Büyük ölçekli Gen demonte olarak C. elegans Sağlam Kayıp fonksiyon-fenotipleri oluşturmak için DsRNA Besleme Kitaplıklar kullanma

Özet

DsRNA C. beslerken elegans büyük ölçekli besleme ekranlar için geçerli protokoller değişken devirme verimleri elde gen fonksiyonunu değerlendirmek için güçlü bir araçtır. Bu gen ifadesinin oldukça etkili ve yeniden üretilebilir bir devirme ile sonuçlanan büyük ölçekli RNAi besleme ekranları yerine getirmek için geliştirilmiş bir protokol açıklar.

Özet

DsRNAlar ifade solucanlar bakterileri besleyerek RNA girişim C gen fonksiyonunu değerlendirmek için yararlı bir araç olmuştur elegans. Genlerin küçük bir sayıda demonte için hedeflenen bu stratejisi iyi çalışıyor olsa da, büyük ölçekli besleme ekranları kendi programını sınırlar, değişken knockdown verimliliğini gösterir. Daha önce yayınlanan RNAi yok etme protokolleri deconstructed ve indirgenmiş Nakavt birincil kaynağı hayvanlara beslenen bakterilerden dsRNA kodlayan plazmidlerin kaybına bağlı olabilir bulduk. Bu gözlemlere dayanarak, biz büyük ölçüde azaltır veya verimli, yüksek verim elde etmek için demonte plazmid kaybı ortadan kaldıran bir DsRNA besleme protokol geliştirdik. Biz bu protokol C. aşağı sağlam, tekrarlanabilir darbe üretecek olduğunu göstermek nöronlar elegans da dahil olmak üzere çok sayıda doku türleri içinde, genler, ve büyük ölçekli ekranlarında etkili demonte izin verecektir. Bu protokol, bir ticari olarak temin edilebilir besleme dsRNA kullanankütüphane ve kütüphane çoğaltmak ve DsRNA ekranları gerçekleştirmek için gereken tüm adımları açıklar. Protokol, bir karmaşık ekipman kullanımını gerektirmez ve bu nedenle herhangi bir C. tarafından yapılabilir laboratuvar elegans.

Giriş

C. Tarihsel olarak, genetik ekranlar elegans DNA içinde rasgele mutasyona oluşturmak için, örneğin etil metansülfonat gibi bir kimyasal mutajen ile hayvanların tedavi edilmesi ile gerçekleştirilmiştir. Mutagenize edilmiş hayvanların soyu veya grandprogeny sonra sergilediğini arzu edilen bir anormal bir fenotip izole edilir. Fenotipe neden sorumlu mutasyon daha sonra bir emek-yoğun bir eşleme prosedürü ile ya da mutant solucan tüm genom sekanslama ile tanımlanır. Orada, kazanım fonksiyon-of ve zarar fonksiyon-fenotipler neden olabilir solucan genomu içinde kalıcı lezyonlar oluşturmak gibi kimyasal mutagenez ekranlar performans için pek çok avantajı vardır, ancak eşleme prosedürü yavaş ve pahalıdır.

Çift kollu bir RNA girişimi (dsRNAi) önemli biyolojik proseslerde yer alan genleri tanımlamak için alternatif bir yol sağlar. Bu yöntemde, bir endojen genin kodlama dizisi eşleşen dsRNA solucan sokulur.DsRNA kılavuzları yok ¹ için onları hedef, uygun endojen mRNA bulmak ve bağlamak üzere görev küçük (21-22 nükleotid) RNA'ları oluşturmak için in vivo olarak işlenir. Bu prosedür nispeten hızlı olduğunu, ancak dsRNA'nın yerine DNA'dan daha mRNA hedefleri nedeniyle, sadece azaltma fonksiyon-fenotipleri bu yaklaşımı kullanılarak gözlenmiştir.

Bir hayvana dsRNA'lar sokulması dsRNA ³ hayvanları ıslatarak ya da ⁴ dsRNA eksprese hayvan bakteri beslenmesiyle, dsRNA ² direkt enjeksiyonu ile elde edilebilir. Hayvanın en hücreleri SID-1, ⁵ dsRNA'yı ithal edebilen bir transmembran kanalı ifade olarak bu teslim yöntemlerin her sistemik devirme etkilere neden olabilir. Başlangıçta her seferinde tek tek genlerin ekspresyonunu bir demonte bir karşıt genetik yaklaşım olarak, iki besleme kütüphanelerinin oluşturulmasına şimdi büyük ölçekli genetik ekranlar izin verir. Piyasada bulunan DsRNA kütüphaneleri ba içerirlerTüm C.% 55 veya% 87 ya da temsil cterial klonlar elegans genleri ^{6, 7.}

Ne yazık ki, büyük ölçekli dsRNAi besleme ekranlar genellikle değişken devirme verimliliği ^8-10 sonuçlanabilir. RNAi Nakavt mutlak seviyesi kolaylıkla ölçülebilir olmasa da, büyük ölçekli ekranlar gözlenen etkinlik yok etme, indirgenmiş RNAi tarafından bozulmasını kaçış kalıntı gene özgü mRNA neden olmalıdır. Bu da, bu ekranlarında hayvanlara yem bakterilerden dsRNA plasmid kaybı doğrudan bir sonucu olabilir. Demonte etkileri beslenen hayvanlara ¹¹ kontrol ile karşılaştırıldığında (eğer varsa) bu fikri desteklemek, hayvanlar bakterinin sadece% 50 bir hedef gene karşı dsRNA'lar ifade ettiği, bakteri karışımları beslenen, önemli ölçüde azalır göstermektedir. C. çoğu genler olarak dsRNAi ekranlarında yaparken gen Nakavt ölçüde kritik bir endişe olur elegans haplosufficient ve böylece gen tanımı, en az% 50 t azaltılmalıdıro kayıp ^fonksiyon-12 fenotip neden olur.

Biz büyük ölçekli ekranlar gerçekleştirmek için daha önceden yayınlanmış besleme protokolleri ve diğerleri ^8-10 tarafından bildirilen aynı değişken devirme etkileri bulduk. Olası nedenler için bir arama, biz ekranda hayvanlara beslenen bakterilerin yaklaşık% 60 dsRNA'nın plazmid kaybetmişti bulundu. Biz dramatik azaltır veya ortadan kaldırır plazmid kaybı ve büyük ölçüde devirme etkinliğini arttırır kütüphane çoğaltma ve tarama protokolü geliştirdik. Bu protokol C de büyük ölçekli ekranlar yapmak için uygundur elegans ve ticari olarak temin edilebilen dsRNA kitaplıkları birini ya da taranması için kullanılabilir. Bu protokolü kullanarak, ekrana sırasında hayvanların beslenen bakterilerin esasen% 100 dsRNA kodlayan plazmid korumak ve, incelenen tüm dokularda işlev fenotipleri sağlam ve yüksek nüfuz kaybına yol bulmak.

Protokol

Not: Bu protokol, doku tiplerinin çeşitli biyolojik süreçlerin çeşitli için gerekli olan genleri tanımlamak için kullanılabilir. Ekranın sırasında gerekli kalite kontrol olarak, hayvanlar hedef dokuda RNAi etkilerini göstermek için kontrol dsRNA eksprese eden bakteriler beslemeli hem pozitif hem de negatif.

Diğer besleme yayınlanmış protokoller 50 ug / ml ampisilin ve 25 ug / ml karbenisilin ^8-10 ya da mevcudiyetinde dsRNA eksprese eden bakteriler büyür. Biz, bu durumlardan herhangi biri altında yetişen bakteri yüksek frekansta dsRNA plazmid kaybetmek bulduk. Gerçekten de, bakteriler, ampisilin, çok yüksek konsantrasyonlarda (en fazla 2 mg / ml), bakterilerin% 50'sinden fazlası içinde gece boyunca büyütülür bile artık plazmidi içerdiğini bulmuşlardır. Karbenisilin büyüme genel olarak plazmid daha fazla tutma neden olsa da, 25 ug / ml plazma kaybını önlemek için yeterli değildi. Bunun yerine, biz carbenicillin konsantrasyonun da bulundu500 ug / ml 'tions sıvı kültürler ve bakteriler katı agar alt-tabakalar üzerinde büyüdükleri zaman, 2 mg / ml karbenisilin plasmid kaybını engellemek için gerekli olan büyüme sırasında plasmid kaybını engellemek için gerekmiştir.

Plazmid tutma Nakavt başarısı için kritik olduğundan DsRNA bakteriler bu protokolde kültürlü olduğunda, yalnızca carbenicillin kullanılır. Biz dikkatle plazmid içermeyen bakteriler bu kültürlerde yetişen etmemelerini sağlamak için bu protokolü açıklanan bakteri büyüme kültürlerde kullanılan karbenisiline konsantrasyonunu optimize ettik. Bununla birlikte, bir kalite kontrol ölçüsü olarak, plasmid kaybı protokol birkaç adımda belirlenir. Etkili demonte sağlamak için, bu adımların her birinde bakteri% 80'den fazla dsRNA plazmid içermesi gerekir. Protokol herhangi bir aşamada bakteri% 20'den fazla dsRNA plazmid kayıp varsa, kullanılan karbenisilin kalitesini kontrol edin. Carbenicillin kullanıldığı taze gün hazırlanmalıdır. Hazırlamak taze karbensilin ve kültürünü tekrarlayın.

1.. Plazmid Kaybı nasıl belirlenir

1. Bakteri küçük bir örnek çıkarın (her bir ilgili adımda tarif edildiği gibi) ve 450 ul steril su ekleyin.
2. Iyice seyreltme arasındaki solüsyon karıştırılarak, steril su kullanılarak daha fazla 1:10, 1:100, 1:1000 ve seri seyreltmeleri oluşturmak için bu seyreltilmiş numunenin 100 ul kullanın.
3. LB ve LB AMP plakası üzerine, her seyreltme oranından 100 ul yayıldı ve 37 ° C de bir gece inkübe edilir, bu plakalar
4. Ertesi gün, 100 ve 500 arasında, bakteri kolonilerinin içeren LB plakası belirlemek. (Bakteri aynı seyrelti içeren) bu plaka üzerinde ve karşılık gelen LB AMP plakası üzerinde koloni sayısı.
5. Bu koloni sayımları plazmid kaybı belirleyin. Plazmid Denklem 1 kullanılarak hesaplanır içermez ve etkili dsRNA'nın yıkmak için en az% 15 olmalıdır bakterilerin yüzde.

"Denklem 1" src = "/ files/ftp_upload/50693/50693eq1.jpg" />

2. Duplicate Kütüphane Plates Yapımı

Genel Bakış: dsRNA Kütüphane, 96 gözlü plakalar içinde bakteri 10566 klonları olarak imalatçı (OpenBiosystems) gelecek. -80 ° C derin dondurucuda hemen plakaları saklayın. Orijinal kütüphane plakaları çoğaltılamaz olacak ve besleyen tüm ekranlar bakteri kaynağı olarak yinelenen kütüphane tabak kullanın olacaktır. Bu orijinal saklamak ve ayrı dondurucularda kütüphane plakaları çoğaltmak için tavsiye edilir. Günde sadece 10 kütüphane plakaları çoğaltma, işleme kolaylığı tavsiye edilir için.

1. -80 ° C derin dondurucuda kütüphane plaka (lar) çıkarın ve kültürler hala donmuş ise folyo mühür kaldırabilirsiniz. Kütüphane plakanın plastik kapağını takın ve (artık 30 dakika daha), oda sıcaklığında çözünme düz bir yüzeye plakasını ayarlayın.

Not: Biz fark ettik ki önemli bir pOrijinal kütüphane plakalarının her çukuruna bulunan bir bakteri ercentage plazmid içermez. Kütüphane bakteri değerli bir kaynaktır Ancak, orijinal kütüphane kültürlerde plazmid kaybı için test etmek için tavsiye edilmez.

2. Bir çok kanallı pipet kullanarak, bir boş 96-gözenekli düz tabanlı çift kaynak plakasının her kütüphane çoğaltma ortamı 150 ul ekle.
3. Pipetleme ve dört 100 ul ayarlanmış bir çok kanallı pipet kullanarak beş kat aşağı çözülmüş kütüphane bakteri kültürleri karıştırın. Daha sonra her bir karışık kültür 10 ul kaldırmak ve yinelenen plakasının karşılık gelen oyuklara transfer. Her transferi için pipet uçları değiştirmek için bazı yapım plaka çoğaltmak için kütüphane plakadan kültürleri aktarmaya devam.
4. Bir kütüphane plaka tüm kültürler aktarıldıktan sonra, tam bir sızdırmazlık sağlamak için bir brayer silindiri kullanarak yeni yapışkanlı folyo ile orijinal kütüphane plaka kuyuları kapsayacak. Plaka üzerindeki plastik kapağı değiştirin veKültürler, (en az 30 dakika) refrozen kadar bir -80 ° C dondurucu içinde dik yerleştirin. Sonra bir kütüphane depolama kutuya geri orijinal kütüphane tabak taşımak.
5. 37 ° C (bir microshaker, yörünge 3 mm 450 rpm) 8-10 saat boyunca düz yinelenen kütüphane plaka kültürleri çalkalayın.
6. Her bir kütüphane yinelenen bir plaka içerisinde plazmid kaybı belirler. Biz orijinal kütüphane plakanın her bakterilerin büyük bir kısmı dsRNA plazmid içermediği bulunmuştur. Bu bakteriler yinelenen kütüphanede büyümesine katkıda kalmamasıdır önemlidir. Büyümelerini önlemek için, karbenisilin yüksek bir konsantrasyon kütüphane çoğaltma ortama (3 mg / ml) kullanılmıştır. Bu koşullar kullanılarak çoğaltılması plakanın kültür sonra bakteri fazla% 90 dsRNA plazmidi içerdiğini bulduk. Her bir çift plaka arasında temsili bir kültür oyuğundaki 10 ul numune çıkarılmaktadır ve 450 ul steril su ekleyin. Bu seyreltilmiş örnekleri kullanarak, her bir çift kütüphanede plazmid kaybı belirleradımlar 1,1-1,4 göre plaka. Önemli plazmid kaybı gözlenirse (> yinelenen kütüphanede bakterilerin% 20 plazmid içermeyen), taze carbenicillin kullanarak kültür ortamı yeniden yapmak ve adım 2.1 protokolünü tekrarlayın.
7. Inkübasyondan sonra, yinelenen plaka kuyuları üzerinde doğrudan yeni bir folyo yapışkan levha yerleştirin, ve bu folyo üzerinde plaka kapaklarını yerleştirin. -80 ° C derin dondurucuda (en az 30 dk) donmuş kadar dik yinelenen kütüphane tabak yerleştirin. Dondurulduktan sonra, uzun süreli depolama için yinelenen kütüphane saklama kutusu tabak taşımak.

3. Omniplates üzerinde Kütüphanesi Geçici Kopya yapma

Genel Bakış: dsRNA ekran için yiyecek hazırlamak başlamak için, yinelenen kütüphane plakalarından bakteriler katı agar omniplates aktarılır ve gece boyunca büyütülür. Katı ortam üzerinde plasmid kaybını önlemek için, omniplates 2 mg / ml karbenisilin ihtiva etmektedir. Bu plakalar üzerindeki bakteri bir süre için kullanılabilirbir hafta ve herhangi bir plasmid kaybı gösterir. Biz bir haftadan daha uzun omniplates yetiştirilen bakterilerin plazmid kaybı için test değil.

1. -80 ° C derin dondurucuda yinelenen kütüphane plaka (lar) çıkarın ve kültürler hala donmuş ise folyo mührü çıkarmak. Folyo çıkardıktan sonra, plakanın plastik kapağı değiştirmek ve (artık 30 dakika daha), oda sıcaklığında çözünme düz bir yüzey üzerinde yinelenen kütüphane plakasını ayarlayın.
2. Boekel 96 pin çoğaltıcısını sterilize edin. Temiz bir eşleyicisinin Pimler damıtılmış su ile durulanmış ve daha sonra her kullanımdan önce sterilize edilmelidir. , Çoklayıcıyı sterilize bir etanol banyosu (bir payreks kaba derin 3/4) içine yerleştirin ve daha sonra bir Bunsen beki kullanarak kapalı işaretçilerine kaplanması etanol yakmak için. Alev söndürmek ve daha sonra tekrarlamak için izin verin.
3. Çözülmüş yinelenen plakanın gözleri içine sterilize çoklayıcıyı yerleştirin ve yavaşça karıştırın kültürleri için kullanın. Kültürünün küçük hacimleri çoğalıcının pimleri uyacaktır.
4. dikkatlice yinelenen plaka kuyulardan çoklayıcıyı kaldırmak ve agar yüzeyini delmek için dikkatli olmak, hafifçe omniplate yüzeyinde (pin aşağı) yerleştirin. Çoğalıcı bakteri pimlerinden agar yüzeyi üzerine aktarılır ve böylece 3-4 saniye için omniplate yüzeyinde çoklayıcıyı bırakın.
5. Çoklayıcıyı çıkarın ve bakteri kültür küçük bir hacmi (2-3 ul) agar içine absorbe izin verir. 37 ° C'de 15-18 saat boyunca ters omniplates inkübe Bu omniplates 96 oyuklu sıvı bir kültür aşılamak için ertesi sabah kullanılabilir. Alternatif olarak, bir gece boyunca bakteri kolonileri içeren omniplates 4 ° C'de yedi gün kadar saklanabilir
6. Kopya-devret ek yinelenen plakaları, steril su ile çoğaltıcı ipuçları yıkayın ve etanol çoklayıcıyı yerleştirerek ve daha önce olduğu gibi, iki kez yanan tarafından sterilizasyon işlemi tekrarlayın. Bir kez sterilize, çoğaltıcı bir sonraki yinelenen plaka üzerinde kullanılabilir.

4. Solucanlar Besleme için Bakteri hazırlanması

Oış: besleme solucanlar bakteri için omniplates bakteri kullanılarak (96 oyuklu bir formatta) 1 ml sıvı kültürler olarak hazırlanır. Bu sıvı kültürler, doymuş nonlogarithmic bakteri kültürleri oluşturmak için gece boyunca büyütülür. Bir gecelik kültürler büyüme tüm bakteri benzer konsantrasyonlarda içerir ve bu nedenle tüm solucanlar gıda aynı miktarda beslenmesini garanti eder. Bu büyüme sırasında hiçbir plazmid kaybı dikkat edilmelidir.

1. Bir tekrar pipet ve 50 ml Combitip kullanılarak 2 ml kuyulu 96 oyuklu plakanın her oyuğuna bakteri büyüme ortamı 1 ml dağıtın.
2. 3,1-3,6 pimler 96 bakteri kolonileri her biri ile temas halinde olduğu bazı yapım adımda oluşturulan bakteri kolonileri içeren omniplates yüzeyi üzerine steril çoğaltıcısını yerleştirin.
3. Dikkatlice büyüme ortamı içine daldırılır kadar pimler derin kuyu kenarlarını sıyırmak yok belirli hale derin plaka içine omniplate yüzeyinden çoklayıcıyı hareket ettirin. TaşıÇoğaltıcı yavaş büyüme ortamı içine bakteri çıkarmak için derin plakanın iç duvarı izlenerek kare hareket. Sıçrama ve çapraz kuyuları kontamine için dikkatli olun.
4. Kontrol yuvaları: Her 96 oyuklu bir kültür plakasına derin kuyu için, bu beklenen yok etme fenotipi için bir pozitif kontrol olarak hareket ve bir negatif kontrol olarak boş dsRNA vektörü (pL4440) içeren bakterilerin iyi katacak bir oyuğuna bir dsRNA eksprese eden bakteri eklemek . Bu çizgi yeniden kontrol dsRNA eksprese eden bakteriler, taze kalır ve plasmid korumak, böylece, tetrasiklin (15 ug / ml) ve karbenisilin (2 mg / ml) ihtiva eden LB plakaları üzerine haftada bir bakteri.
5. Steril bir aşılama döngü kullanılarak (çoğaltıcı tarafından aktarılan bakteri aynı miktar ile ilgili), kontrol levhasından tek bir iyi izole edilmiş koloni kaldırma ve derin delikli kültür plakasının boş bir kuyu inoküle. Inoküle edilmiş kuyunun konumunu kaydedin. Alternatif olarak, bakteri c ilmekbir 250 ul büyüme ortamı içeren bir Eppendorf tüpüne taşınmasını, vortekslenir ve daha sonra birkaç boşlukların aşılanması için kullanıldı.
6. Gece boyunca 37 ° C: (3 mm orbit) microshaker üzerinde 650 rpm'de bir düz konumda kuyulu plakaları çalkalayın. Kültürler, ertesi sabaha kadar doymuş olacaktır. Ne olursa olsun, bu kültürlerde kullanılan karbenisilin konsantrasyonu plasmid kaybını önlemek gerekir.
7. 1 ml, gece boyunca kültürde plazmid kaybı belirler. Kültürler ekran için solucan beslemek için direkt olarak kullanılacaktır. Her kültürün içinde bakteri% 80'den fazla dsRNA plazmid içermesi önemlidir. Adım 1,1-1,4 göre iki temsili kültürler için plazmid kaybı belirler. Beklenti: Her kültürün içinde bakteri fazla% 90 dsRNA plazmidi içerecektir. Biz doygunluk büyüdü hatta bu gecede kültüründe anlamlı plazmid kaybı gözlenmiştir hiç. Önemli bir plasmid kayıp gözlenir, ancak, (>% 20), taze karbenisilin ve rep kullanarak büyüme ortamı yeniden yapmakAdım 4.1 dan protokolü yiyin. Kültürler sürece omniplates az 1-2 hafta eski olduğu gibi orijinal omniplates itibaren yeniden başlatılabilir.
8. Ekran tamamlanır ve bir tekrar test kültürleri başlatmak için bir besin kaynağı olarak kullanılabilir kadar bir kez 1 ml kültürler başlatmak için kullanılan, omniplates 4 ° C'de saklanır.
9. Kültürün gece boyunca inkübe edildikten sonra, derin kuyu plaka bakteri kültürü 150 ul kaldırmak ve besleme plakası yüzeyi üzerine çıkarmak için 12 kanallı bir çok kanallı pipet kullanın. Bu solucanlar dsRNA eksprese eden bakteriler beslenirler yuva olup gibi transfer sırasında agar yüzeyini delmek için önemlidir. Transfer süresi (Şekil 1) dört kuyu yapılabilir. Bunu yapmak için, (her satırda sadece 4 kuyu besleme plakasında olduğu gibi) çok kanallı pipet her üçüncü kanalda pipet uçları yerleştirin. 4 kuyuların her set aktarıldıktan sonra, yeni, steril pipet uçları değiştirin. Her 96 kuyulu kültür plaka 96 ipuçları gerektirirSekiz 12-iyi besleme plakaları transfer için.
10. Bakteriler agar içine absorbe böylece mağazası gece boyunca karanlıkta dik plakalar tohumlandı.

5. Yaratma L1 C Tutuklandı elegans Larva

Genel Bakış: L1-tutuklandı larva dsRNA'nın besleme plakaları üzerinde senkronize solucan kültürleri başlatmak için kullanılır. Bu larvalar sağlıklı yumurta izole etmek gravid yetişkin popülasyonları beyazlatma ve daha sonra yumurta gıda olmadan S-tam ortam içinde yumurtadan izin tarafından oluşturulur. Gıda yokluğunda çıkmış L1 larvalarının L1 larvalarının bir senkron popülasyonu üretme, geliştirme tutuklama olacaktır. Bu hasret hayvanlar zamanla hasta olma ve atılmalıdır olarak ekran sırasında, her hafta taze L1-tutuklandı larvaları hazırlamak. Lin-15B mutantlar tavsiye edilir; nöronal ekranlar için eri-1, dsRNA besleme suşu kullanılan hayvan genetik arka seçimi, uygulamaya bağlı olarak değişebilir.

1. 10-20 L4 la almakOP50 bakteri çim içeren ve plakalar kadar 6-7 gün beklemek altı ayrı NGM plakaları rvae çok taze yumurta koydu ve gebe yetişkinler içerir.
2. Her plakanın yüzeyine 3 ml su eklenerek plakalardan hayvanlar ve yumurta çıkarın ve suya her plakanın yüzeyinden yumurta, bakteri ve hayvanlar çıkarmak için bir eldivenli parmak kullanın. Bakteriyel çim özel dikkat, plaka tüm alanlarını kapsayacak emin olun. Bir cam pipet kullanılarak her plaka, su, bakteri, solucanlar ve yumurta çıkarın ve bir steril 50 ml konik tüp transfer.
3. Kalan tüm bakteriler, solucanlar ve yumurta kaldırmak için yüzey üzerinde aşağı ve yukarı pipetleme, her plakanın yüzeyine suyun bir 3 ml ilave edilir. 50 ml konik tüp, bu hacim.
4. , Bir masa üstü santrifüjü içinde 1 dakika için 1500 rpm'de konik tüp dönerler. Worms ve yumurta tüpün dibine pelet olmalı ve bakteri süspansiyon kalmalıdır. Dikkatlice 4 ml ama aspiretüp topak solucanlar ve yumurta önlemek için emin olmak gelen sıvının.
5. Kalıntı su içinde solucan pelletini ve bir cam pipet ile, steril bir 15 ml konik tüp aktarın. Steril su ile 10 ml'ye getirin hacmi.
6. Daha önce olduğu gibi, 1 dakika boyunca 1500 rpm'de döndürün. Solucan / yumurta pelet rahatsız etmemek için 200 ul su bırakarak süpernatant aspire.
7. Solucanlar ve yumurta yıkama ve ek bakteriler kaldırmak için daha önce olduğu gibi dönmeye konik 10 ml su ekleyin.

Not: In 5,8-5,11 solucanlar adımlar ve yumurta bir çamaşır suyu çözeltisi maruz kalmaktadır. Bleach solucanlar yok ve nispeten sağ salim yumurta bırakacaktır. Yumurta çok uzun çamaşır suyu çözeltisi içinde bırakılır Ancak, onlar da yok olacak. Yumurta kalır fazla 10 dakika çamaşır suyu maruz değilsiniz emin olmak için ağartma adım 5.8 eklenen bir zamanlayıcı ayarlayın.

8. Yüzeyde yüzenin 200 ul ama kaldır, yeniden topak kaçınarak, daha sonra 10 eklemekml çamaşır suyu çözeltisi ve bir zamanlayıcı başlar.
9. Ara sıra ters çevirerek, karıştırma 3-4 dakika için bir çamaşır suyu solucanlar ve yumurta inkübe edin. Daha sonra, bir masa üstü santrifüjü içinde 45 saniye için 1500 rpm'de döndürün. Tüpün altındaki bir topak arayın, orijinal pelet daha küçük ve daha kompakt olması ve san bir görünüm alabilir.
10. Pelet rahatsız etmeyecek şekilde geride 200 ul bırakarak çamaşır suyu aspire.
11. Başka bir 10 ml taze çamaşır suyu ekleyin ve daha önce olduğu gibi ters. Zamanlayıcı 10 dakika okuduğunda, tekrar dönmeye ve çamaşır suyu aspire, geride 200 ul bırakarak ve hızla 10 ml steril su ekleyin. Bir mikroskop altında çözümü inceleyin. Larva ve yetişkinlerin çok daha çok yumurta geride bırakarak, ağartıcı çözelti içinde çözüldü olmalıdır.
12. 45 saniye için daha önce olduğu gibi Spin ve tekrar pelet rahatsız etmemek için süpernatan aspire. Bu pelet öncelikle yumurta içermelidir ve çok gevşek olacak.
13. Anot Ekleonu 10 ml su, biraz arkasında su bırakarak spin ve aspire karıştırmak için ters. Bu, mümkün olduğu kadar çok çamaşır suyu çıkarmak için önemlidir.
14. , Konik tüpe 4 ml S-tam ortam ekleme yumurta tekrar süspansiyon ve bir steril 100 ml Erlenmeyer şişeye transfer et. Sadece yeterince hızlı şişenin içeriği girdap neden hareketli bir çalkalayıcı üzerinde bir dizi 20 ° C inkübatör içine yerleştirilir. Bu yumurtadan zaman L1 larvaları desteklemek için yeterli havalandırmayı sağlayacaktır. 15 saat içinde, bütün yumurta tutuklandı L1 larvalarının bir senkronize popülasyonu üretmeye yumurtadan olmalıdır.

Tutuklandı L1 larvalarının bir elek boyunca her hafta taze olarak yapılmalıdır. Ilk toplu yapıldıktan sonra, sonraki partiler (OP50 100 ul gecede kültürü içeren) dört adet standart, seribaşı 6 cm plakalarının her (önceki haftaki partiden) 500 tutuklandı L1 larvaları ekleyerek başladı ve 20 inkübe edilebilir 4 gün boyunca C °. Dördüncü gün plakalar içermelidirBirçok yumurta ve gebe yetişkin ve daha senkronize L1 larvaları için taze yumurta hazırlamak için beyazlatılmış olabilir.

6. Besleme Plakaların üzerine Tutuklandı L1 Larva aktarma

Genel Bakış: dsRNA ekran gerçekleştirmek için, 20-30 larva L1 tutuklandı dsRNA besleme plakası üzerine aktarılır. Hayvanlar 2-3 gün DsRNA-ifade bakteriler üzerinde beslenen sonra böyle larva tutuklama veya öldürücülüğü gibi erken demonte etkiler görülecektir. Gerçekleştirilen ekrana bağlı olarak, arzu edilen fenotipi besleme plakası üzerine yerleştirilir, orijinal hayvanlar (P0 hayvan) ya da kendi soyu (F1 hayvan) ya gözlemlenebilir. Fenotip sunumu ekspresyonu düşürülürse geni ve ilgi konusu genin gerekli olduğu gelişim sırasında zaman kodlanan proteinin perdurance da dahil olmak üzere bir dizi değişkene bağlıdır. Sadece 20-30 hayvanlarla DsRNA beslenme kültürleri başlayarak önce P0 F1 iki fenotip gözlem izin vermelidirimals besin kaynağı tüketebileceği.

Kolayca, besleme plakaları 20-30 hayvanları aktarmak ilk belirlemek için L1 konsantrasyonu tutuklandı L1 kültüründe hayvanlar tutuklandı.

1. Hayvanları dağıtmak için tutuklanan L1 larva içeren Erleni karıştırın.
2. 4-5 bir dereceye giremeyen 6 cm NGM plaka üzerine 10 ul tablet ve damla damla yeri kaldır tüm medya pipet atılır emin plakanın merkezi aşağı düşer.
3. Pipet ucu kullanılarak plakanın çapı yayılan sıvının tek bir sürekli sonsuz bir hattın oluşturulması için süspansiyonu noktalar yayıldı.
4. Sıvı plaka emilir ve hayvanlar dağıtmak önce diseksiyon mikroskobu kullanarak, sıvı hattının bir ucunda başlayan ve diğer ucuna devam eden tüm hayvanları sayılır. Bu hiçbir hayvan cevapsız emin olmak için diseksiyon kapsamı sürekli odaklanma de gerektirebilir.
5. Üç ayrı 10 ul için bu işlemi tekrarlayıntümbölenler ve solucan süspansiyon ul başına solucanlar ortalama sayısını belirlemek ve Erlenmeyer şişesi üzerinde doğrudan bu numarayı kaydetmek için üç sayı ortalama.

7. Besleme Ekranı başlayın

Genel Bakış: dsRNA ekran başlamak için, 20-30 larva tutuklandı L1 dsRNA eksprese eden bakterilerin ince çim içeren 12 oyuklu besleme plakalarının her çukuruna ilave edilir. Besleme plakaları standart nematod büyüme ortamı (NGM) içeren ve 500 ug / ml karbenisilin (plazmid kaybını önlemek için) ve 1 mM IPTG (dsRNA ifadesini azaltmak için) ile takviye edilmiştir. Hayvanlar, 20 ° C'de birkaç gün boyunca yem ve gelişmeye bırakıldı Bir F1 ekran yaparken bir P0 ekran ve 6-7 gün yaparken hayvanlar için iki tipik beslenme rejimleri 3 gün vardır. Besleme süresi, ancak, ekranda istenen belirli fenotipleri bağlı olarak değişebilir.

1. Bir çok hazırlamak L1 tutuklandı larva ve steril su süspansiyonu kullanın2,000 solucanlar / ml içeren devrim sisi. Her 12-iyi besleme levha bu solucan süspansiyon 120 ul gerektirir. Hayvanların eşit dağılımını sağlamak ve steril bir pipetle için rezervuara hayvanları aktarmak için iyice karıştırın.
2. Her üçüncü pozisyonunda uçları ile belirlenen çok kanallı pipet kullanarak doğrudan besleme plakaların bakteri çim üzerine transferi solucan çözeltisi 10 ul (Şekil 1 e bakınız). Solucanlar dsRNA ifade bakteri beslemek agar içine yuva ve olmayacak gibi, agar yüzeyini delmek için özen.
3. Solucanlar hızla yerleşmek gibi, besleme levhaların her iki satır sonra (nazikçe bu konuda sloshing tarafından) haznesindeki solucan çözüm remix. Tüm besleme plakaları solucanlar var kadar solucan süspansiyon dağıtım devam ediyor. Her 20-30 solucanlar oluyor emin olmak için diseksiyon kapsamında erken bir kaç kuyu inceleyin.
4. Bir 20 ° C kuluçka makinesi içinde nemlendirilmiş kutu içinde dik plakalar saklayın. Ertesi gün, sonra, worm süspansiyon plakasına emmiş, plakalar ters çevirin ve 20 ° C 'de humidor dönmek Bu plakalar Hayvanlar (P0 fenotipleri için) 3 gün sonra görülen ve yeniden 6 gün sonra (F1 fenotipleri için) olabilir.

Not: solucan gelişim 7 gün sonra besleme plaka üzerinde kalır bakteri plasmidi kaybı için test edilmiş ve hemen hemen% 100 dsRNA plazmid korudu.

Sonuçlar

P0 knockdown fenotipleri DsRNA bakterileri ifade hayvanların beslenmesi 2-3 gün sonra görünmeye başlayacaktır. Bazı erken fenotipleri larva tutuklama ve öldürücülüğü içerir ve tüm beslenme kuyuların% 2-3 dikkat edilmelidir. Bu aynı fenotipleri de F1 üretimi hayvanlarda gözlenecektir. Yumurtadan başarısız F1 yumurta varlığı başka ortak F1 fenotip ve birlikte, bu üç fenotipleri F1 ekranlarında tüm kuyuların yaklaşık 10% olarak görülecektir.

Biz P0 ve F1 fenotipleri hem de doku tiplerinin çeşit...

Tartışma

Biz C. büyük ölçekli ekranlar gerçekleştirmek için piyasada mevcut DsRNA besleme kitaplığı kullanan bir protokol tanımlanmıştır elegans. Biz kütüphane çoğaltmak ve etkili bir şekilde kullanmak için tüm talimatları sağlar. Bu yaklaşım, hayvanın farklı dokularda farklı biyolojik proseslerde yer alan genleri tanımlamak mümkün olduğunu göstermektedir. Burada tarif fenotipleri (UNC, Egl ve dpy) kolayca gözlemlenebilir olsa da, bu protokol, hemen hemen herhangi bir biyolojik işlem için gerekli olan genlerin ...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Reagent/Material
96-well Falcon düz tabanlı plaka	Fisher Scientific	353072	steril
yapışkan folyo	USA Scientific	2923-0100
Nunc omniplate	Fisher Scientific	267060
2.0 ml derin 96 kuyulu polipropilen Masterblock	USA Scientific	5678-0285	Derin
kuyu plakaları için	USA Scientific	5665-6101
50 ml kombiuçlar	USA Scientific	4796-5000	ayrı ayrı sarılmış
Rezervuar	USA Scientific	2977-8500	otoklavlanabilir
12 oyuklu plakalar	USA Scientific	CC7682-7512	ayrı ayrı sarılmış
dsRNA besleme kitaplığı	Açık Biyosistemler	RCE1181	mağaza -80 & C
Ampisilin	Fisher Scientific	BP1760-5
Tetrasiklin	Fisher Scientific	BP912-100
Karbenikilin			teslimat için 2-4 hafta izin verir www.biochemicaldirect.com
Bakteriyolojik Agar Ultra saf sınıf A	Affymetrix	10906	sonsuz plakalar
Equipment
Brayer silindiri	USA Scientific	9127-2940
B– kel 96 pinli çoğaltıcı	Fisher Scientific	05-450-9	otoklavlanabilir
mikro çalkalayıcı	Thomas Scientific	1231A93	3 mm yörünge
12 kanallı çok kanallı pipet (0.5-10 μ l)	USA Scientific	7112-0510
12 kanallı çok kanallı pipet (30-300 μ l)	USA Scientific	7112-3300
Repeater Plus manuel pipetleyici	USA Scientific	4026-0201