Method Article

Astrositik Transporter Akımlar bir Dekonvolüsyon Analizi ile Glutamat Gümrükleme gün Dersin türetilmesi

DOI:

10.3791/50708

⸱

August 7th, 2013

 , 
1Synaptic Physiology Section, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz astrositlerde glutamat taşıyıcı akımların elektrofizyolojik kayıtları astrositik membranların de glutamat ömrünü tahmin etmek için analitik bir yöntem açıklanmaktadır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Beyinde glutamat taşıyıcıları en yüksek yoğunluğu astrositlerde bulunmuştur. 3 Na +, 1 H, CO-kamyonu + ve 1 K karşı taşıma zarından glutamat glutamat taşıyıcılarının çift hareket +. Taşıma işlemi tarafından oluşturulan stoikiometrik mevcut astrositlerden tam hücre patch-clamp kayıtları ile izlenebilir. Kaydedilen akımın zaman ders astrositler maruz kaldığı glutamat konsantrasyonu profil, glutamat taşıyıcı kinetiği ve astrositik membranların pasif elektrotonik özelliklerinin zaman ders şekillenir. Burada astrositlerde glutamat taşıyıcı akımları kaydetmek ve astrositik taşıyıcı akımların dalga şekli tüm diğer faktörlerden glutamat açıklık zaman ders izole etmek için kullanılabilecek deneysel ve analitik yöntemleri açıklar. Burada açıklanan yöntemlerle kullanım süresi o tahmin etmek için de kullanılabilirf flash Uncaged ve sağlık ve hastalık sırasında merkezi sinir sisteminin herhangi bir bölgesinde astrositik membranlar de glutamat synaptically-yayınladı.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Astrositler yıldız şeklinde morfolojisi ve nöropil boyunca uzanır ve komşu sinaptik iletişim 1,2 ulaşmak, ince zar çıkıntıları olan beyinde en bol hücre tipleri vardır. Astrositler 'hücre zarı yoğun glutamat taşıyıcı moleküllerin 3 ile doludur. Fizyolojik koşullar altında, glutamat taşıyıcıları hızla zarın hücre dışı glutamat tarafında bağlanır ve hücre sitoplazması aktarın. Böyle yaparak, nakil dışı alan 4 glutamat düşük bazal konsantrasyonu korumak. Sinaps eksitatör bitişik ince astrositik süreçlerinde glutamat taşıyıcılarının ideal uzak sinaptik yarık gelen yayılır olarak sinaptik olaylar sırasında serbest glutamat bağlamak içi....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Dilim Hazırlık

  1. 119 NaCl, 2.5 KCl, 0.5 CaCl2, 1.3 MgSO 4 · 7H 2 O, 4 MgCl2, 26.2 NaHCO3, 1 NaH 2 PO 4, ve 22 glukoz, 320: içeren / depolama çözümü (mM) dilimleme 500 ml hazırlayın mOsm, pH 7.4,
  2. Dilimleri için bir batma odası hazırlamak için 250 ml beher kullanın, / depolama çözümü dilimleme 200 ml ile doldurun, 34 de bir su banyosunda sıcak ° C ve% 95 O 2,% 5 CO 2 ile balonu bu.
  3. 4 bir cam şişede kalan dilimleme / depolama çözümü ° C tutun
  4. Vibratome numune tutucu küçük bir agar blok (% 6, ACSF hazırlanan) ekleyin ve 4 ° C'de sak....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analitik yaklaşımın başarısı kritik merkezi sinir sisteminin herhangi bir bölgesinde astrositlerden taşıyıcı akımların yüksek kaliteli elektrofizyolojik elde bağlıdır Burada anlatılan. Akut fare hipokampal dilimleri, astrositlerde kolayca nedeniyle küçük hücre gövdesi (Ø = 10 mikron) ve belirgin çekirdeği (Şekil 1) Dodt aydınlatma veya IR-DIC altında tespit edilebilir. Hücre içi bir çözüm, (Şekil 1) Alexa 594 (50 mcM) gibi bir fluorofor eklerken kendi ayırt edici yıldız şeklinde morfolo.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada astrositlerden elektrofizyolojik elde etmek için deneysel bir yaklaşım tanımlamak, astrositlerde glutamat taşıyıcı akımlar izole etmek için analitik bir protokol ve bir matematiksel yöntem astrositik taşıyıcı akımlardan glutamat açıklık zaman ders elde.

Analizin başarısı astrositlerden yüksek kaliteli yama kelepçe kayıtları elde etmek için yeteneği ve taşıyıcı akımları tanımlamak için kullanılan uydurma algoritmaları doğruluğunu dayanır. Deconvolution analizi aşağıdaki iki varsayımlar.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan ederim.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Nörolojik Bozukluklar ve İnme İntramural Araştırma Programı (NS002986) Ulusal Enstitüsü tarafından desteklenmiştir. AS el yazması yazdı ve deconvolution analizi uygulanmıştır. JSD deconvolution analizi ilk versiyonunu geliştirdi ve metin yorumladı.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
CGP52432Tocris1246
( R, S< / em>) -CPPTocris173
DPCPXTocris439
LY341495 disodyum tuzuTocris4062
MSOPTocris803
NBQX disodyum tuzuTocris1044
D, L-TBOATocis1223
PikrotoksinSigmaP1675
MNI-L-glutamatTocris1490
Alexa 594Yaşam TeknolojileriA10438Opsiyonel
Matris elektrotlarFrederick Haer Company MX21AES(JD3)
Borosilikat cam kılcal damarlarDünya Hassas AletlerPG10165-4
Çift kademeli cam mikro pipet çektirmeNarishigePC-10
Loctite 404 anında yapıştırıcıTed Pella46551
Xe lambaRapp OptoElektronikFlashMic
Igor Pro 6Wavemetrics

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ventura, R., Harris, K. M. Three-dimensional relationships between hippocampal synapses and astrocytes. J. Neurosci. 19, 6897-6906 (1999).
  2. Witcher, M. R., Kirov, S. A., Harris, K. M. Plasticity of perisynaptic astroglia during synaptogenesis in the mature rat hip....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Glutamate ClearanceAstrocytic Transporter CurrentsDeconvolution AnalysisWhole cell Patch clampTBOA AntagonistSynaptic StimulationBrain Slice PreparationElectrophysiology RecordingsTransporter Current IsolationFlash uncaged Glutamate

Related Articles