Method Article

Prostat Kanserinde Biyomarker Discovery Uygulama: Bireysel herv Lokusları İfade Mikroarray tabanlı Kimlik

DOI:

10.3791/50713

⸱

November 2nd, 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Joint Unit Hospices de Lyon-bioMérieux, 2Medical Diagnostic Discovery Department, BioMérieux, 3Department of Pathology and Cytology, Centre Hospitalier Lyon Sud, Hospices Civils de Lyon, 4Medical Faculty, Lyon 1 University, 5Data and Knowledge Laboratory, BioMérieux, 6Department of Biochemistry and Molecular Biology, Centre Hospitalier Lyon Sud, Hospices Civils de Lyon, 7Department of Urology, Centre Hospitalier Lyon Sud, Hospices Civils de Lyon

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan genomunun% 8'ini işgal insan endojen retrovirüsleri (herv), kıt kodlama kapasitelerini ama yüz bin uzun terminal tekrarları (LSY) korur. Özel bir Affymetrix mikroarray bireysel herv odağı ifade belirlemek için tasarlanmıştır ve gelecekteki klinik çalışmalar için kavramının bir kanıtı olarak prostat kanseri dokularda kullanıldı.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prostat spesifik antijen (PSA), klinik kullanımda, prostat kanseri için en önemli teşhis biyolojik olmakla birlikte, özellikle düşük dozaj değerleri 1 'de, özgüllük ve duyarlılık yoksundur. 'PSA nasıl kullanılır' de net bir farklılaşma kanser ve kanser dışı 2 arasında veya hasta takip için yapılan izin vermez 2.5-10 ng / ml serum bir konsantrasyonuna karşılık gelen gri bölge olarak tanı için, bir akım sorun olmaya devam etmektedir -up post-operatif PSA analizi gibi kinetik parametreler pratik uygulama 3,4 için önemli sorunlar oluşturabilmektedir. Alternatif olarak, kodlamayan RNA'lar (ncRNAs), hastalık gibi yeni işaretleri olarak prostat kanserinde 5,6 örneğin PCA3 ve tümör biyolojisi uncharacterized yönlerini ortaya çıkarmak için potansiyeli olan, insan kanserinin anahtar moleküller olarak ortaya çıkmaktadır. Ayrıca, 2012 de yayınlanan KODLAMASI proje veri tipleri farklı RNA gen yaklaşık% 62 kapak gösterdiome. Ayrıca, transkripsiyon düzenleyici motiflerin miktarı, protein kodlama ekson karşılık gelen bir daha az 4.5x daha fazla olduğu görülmektedir. Bulaşıcı retrovirüsler olarak birincil işlevi olarak Böylece, bir insan endojen retrovirüsler (HERVs) uzun terminal tekrarları (Litre), varsayılan / aday transkripsiyon düzenleyici dizilerin bir yelpazede oluşturmaktadır. Insan genomu boyunca yayılır HERVs, kopyala-yapıştır yayılma süreçleri takip ve insan genomunun% 8 işgal aileleri (ekson bizim genomunun% 2 yayılan dikkat Multicopy giden germ hattı içinde atalarının ve bağımsız enfeksiyonları, kaynaklı .) Bazı herv loci hala kanser 7-10 dahil olmak üzere çeşitli patolojiler ile ilişkilendirilmiştir proteinleri ifade eder. Biz en iyi şekilde iyi onlar ncRNA transkripsiyonunu veya m sürücü ise onlar aktif olup olmadığını anlamak amacıyla, bireysel herv loci ifade karakterize amaçlayan Afpymetrix formatında, yüksek-yoğunluklu mikrodizisini tasarladıkodulate gen ekspresyonunu kodlayan. Bu araç, prostat kanseri alan (Şekil 1) olarak uygulanmıştır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

(Ayrıca HERVs denir) İnsan endojen retrovirüsleri bizim genom boyunca yayılır. Onlar kopyala-yapıştır yayılma süreçleri takip ve Multicopy ailelere açan germ hattı içinde atalarının ve bağımsız enfeksiyonları, kaynaklanır. Bugün, onlar artık bulaşıcı ama onlar insan genomunun% 8'ini işgal, karşılaştırma noktası olarak, ekzonlar insan genomunun% 2 yayılabilir. 2012 yılında yayınlanan KODLAMASI proje verilerini farklı RNA türleri arası bölgelerde üçte biri de dahil olmak üzere, genomun yaklaşık olarak% 62 kapsamaktadır gösterdi. Ayrıca, transkripsiyon düzenleyici motiflerin miktarı, protein kodlama ekson karşılık gelen bir daha az 4.5x daha fazla olduğu görülmektedir. Bulaşıcı retrovirüsler olarak her zamanki fonksiyonu olarak HERVs uzun terminal tekrar (LTR), potansiyel transkripsiyon düzenleyici elemanlar, geniş bir aralığı temsil eder. Tarihsel, ayrı plasenta veya testiste ifade birkaç loci adlı, yaygın herv nedeniyle ep sessiz olduğuna inanılırdıigenetic düzenleme. Bu nedenle, en iyi şekilde daha iyi onlar lncRNA transkripsiyon sürücü ya da gen ifadesini modüle eden kodlama halinde, aktif olup olmadığını anlamak için, tek tek herv loci ifade karakterize etmek amacıyla, Affymetrix biçiminde, yüksek yoğunluklu bir mikro tasarladık. Herv-V2 GeneChip adlandırılan bu araç 23.583 herv probesets entegre ve 5573 yalnız LSY ları oluşan farklı herv elemanlarının yanı sıra komple ve parsiyel-virüsler (Şekil 2) ayırt edebilirsiniz.

Tanı, Değerlendirme ve Planı:

Prostat kanserinin teşhisi klinik laboratuvar prostat spesifik antijen (PSA) biyolojik, morfolojik prostata değişmelerinin ve patolog tarafından gözlenen son olarak, prostat biyopsisi değerlendirmek için bir Dijital rektal muayene dozaj dayanır. Prostat kanseri için PSA gibi geleneksel kanser biyobelirteçlerinin, arasında yeterli özgüllük ve duyarlılık eksikliği, yaygın af kabul edilmiştirklinik etkileri ter birkaç yıl 1. Başlangıçta, PSA prostat adenokarsinomu 11 tanı ve tedavisi için önerilmiştir. Bu kanser taraması için önerilen ve hastalığın 12 gelişimini izleme ikincisi oldu. Ancak, düzenli olarak sorulan bir soru kalır: 'PSA nasıl kullanılacağı'. (Ii) iki büyük çalışmada Avrupa'daki insanların yüzbinlerce kayıt ve (i) 2.5-10 ng serumunda bir konsantrasyona karşılık gelen gri bir bölge / ml açık bir fark kanser ve kanser dışı 2 arasında yapılacak izin vermez , teoride olsa basit, böyle PSA temizliği, PSA hızı ve süresi iki katına gibi post-operatif PSA kinetik parametrelerinin (iii) analizi; ABD hastalığa özgü mortalite 13,14 açısından tarama kullanışlılığı hakkında net bir sonuca varamadı pratik uygulama 3,4 önemli sorunlar oluşturabilmektedir. Biz biyomarker APP, önümüzdeki yıllarda bekleyebilirizAtıf tetikte bekleyen ve daha fazla veya tümör fenotipe bağlı olarak daha az agresif tedaviler arasında bir klinik seçim destekleyecektir. Patolog tarafından verilen tanı ile ilgili olarak, ilk sınırlayıcı faktör (birçok kanser örnekleme tarafından kaçırılan) prostat biyopsisi içinde% 20 yanlış negatif tanı geliyor. İkinci mesele olumsuz etkileri ortaya çıkabilir olumsuz biri, aşağıdaki ek bir biyopsi işlemi için ihtiyacı ile ilgilenir.

Radikal prostatektomi şu anda prostat kanseri için standart tedavilerden biridir. Bu, (10 Gleason 7), özellikle agresif desen durumunda, 45-65 yaşındaki yaşlanma, sağlıklı hastalarda çok odaklı tümör ya da tümör aşikar önerilmiştir. Şimdi robotik cerrahi ile kliniğimizde yapılmaktadır. Çünkü moleküler belirteçler önümüzdeki yıllarda büyük önem sahip olacağı artan kanıtlar, hepimiz hastalara prostat için bir programa katılan olasılığını önermeye karar verdidoku bankacılığı. Daha kesin olarak, prostat kanseri üzerindeki genişleyen moleküler araştırma programı prostatektomi örneklerden kaliteli taze tümör dokularına erişimi için artan bir gereksinim ortaya çıkmıştır. Bu araştırma, özellikle de genomik yaklaşımlar, yüksek DNA / RNA kalitesi büyük örnekleri gerekmektedir. Tümöral ve aynı hastadan alınan bitişik olmayan "tümör dokuları ihtiyaç vardır. Radikal prostatektomi taşıma ve işleme için Öneriler sahne ve marj durumunu ve böylece potansiyel ileri tedavi ve prognozu belirleyen patolojik özelliklerini korumak için tasarlanmıştır. Herhangi bir taze doku örnekleme yöntemi, bu nedenle, teşhis için kabul edilebilir olması amacıyla, daha sonra patolojik değerlendirmeler bozmamalıdır. Prostatın makroskopik diseksiyonu zordur ve büyük ilgi marjı doku ve kapsül işgali ödenmesi gerekiyor: Prostat bankacılık için herhangi diseksiyonu her zaman aynı fikirde göre eğitimli üropatolog tarafından yapılmalıdırd protokolü. Tıp fakültesi ve devlet sağlık kurulu etik komitesi bu soruşturmaların kabul etti ve tüm hastalar prostat dokuları bankacılık dahil için onam alındı ​​bilgilendirdi.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1.. Cerrahlık

Bir patolog tarafından sorumlu alınan kadar sonra, cerrah tarafından çıkarıldı, buz üzerinde prostat tutun.

2. Prostat Dokuların taşınması

  1. Perioperatif iskemi gecikmesini saygı, cerrahi ablasyon sonra 30 dakika içinde özel personel tarafından laboratuvara buz üzerinde radikal prostatektomi örnekleri aktarmak. Dondurma gecikme az 20-30 dakika (Şekil 3A) olmalıdır.
  2. Tartılır ve her zamanki protokolü (sol tarafta siyah sağ tarafında, örneğin, yeşil, Şekiller 3B ve 3C) göre olan prostat leke.
  3. Arka tarafında (Şekil 3D) bezinin enine geniş bir bölümünü gerçekleştirmek. Prostat yönlendirmek ve ön tarafta koydu. Steril bir cerrahi bıçak ile arka tarafında bezinin enine geniş bir bölümünü gerçekleştirmek.
  4. Geçiş bölgesi üzerinde doku parçalarını incelemek,(Şekil 3E) bozulmamış boşluklarını bırakarak sağ ve sol çevresel bölgeleri üzerinde.
  5. Bir Eppendorf tüpü içinde doku çekirdekleri bir ifadeyle, sıvı azot (Şekil 3F) içinde dondurulması ve depolanması ek. Yapıyoruz değilseniz biobank adım 2.7 ile doğrudan geçin.
  6. Biyopsilerde kanser toplam uzunluğu 10 mm üstün yalnızca prostat bankacılık gerçekleştirin. Prostat kapatmak ve bezi bozulma ve cerrahi sınır (Şekil 3G) minimal aksamaması için bir dikiş ipliği kullanın. Sonra histolojik analiz için olağan prosedüre göre parafin içinde formalin ve embed ile radikal prostatektomi örnek düzeltmek.
  7. Dikey Ekim küçük bir höyük üzerine dondurulmuş doku çekirdeği montaj ve cryostat bölümleri olun. Ilk tek 5 um frozen alın ve mavi toluidine ile leke.
  8. Doku doğasını analiz etmek için hızlı bir histolojik inceleme yapın (yani. Iyi huylu veya kötü huylu). Tümöral içindoku, tümör hücrelerinin miktarını tahmin ve tümör hücrelerinin fazla% 80 ile sadece çekirdeklerini seçin.
  9. Bunu takiben, yeni bir tek 5 um frozen gerçekleştirmek ve Hematoksilen, eozin ve Safran ile leke. Daha sonra, 30 um x 15 bölümleri kesilir ve RNAse serbest Eppendorf tüpü içinde yerleştirin.
  10. Hematoksilen, eozin ve Safran için son 5 mikron frozen alın ve prosedürün sonunda tümör hücrelerinin miktarını kontrol etmek için leke.
  11. Kuru buz Eppendorf tüp koymak ve moleküler biyoloji laboratuvarına numune göndermek.

3. RNA Ekstraksiyon, Arıtma ve Kalite Kontrol

  1. Homojenizasyon. Doku, tamamen bir çözelti içinde eritilir kadar Trizol/100 mg doku, 1 ml mevcudiyetinde homojenizasyon yapın. Yavaş yavaş Trizol çözüm ekleyin ve bir el değirmeni kullanarak buz üzerinde dikkatle geçin. Bir kez homojenize edilmiş, Eppendorf tüplerine çözeltisi eş-payı ve oda sıcaklığında Trizol bırakmakBeş dakika.
  2. Faz ayırma. 300 ul kloroform (ya da 150 ul BCP/1.5 ml Trizol) eklenir. Vortex 15 sn sonra 2-3 dakika boyunca oda sıcaklığında bırakın. 2-8 ° C'de 15 dakika boyunca 12,000 x g'de santrifüje
  3. RNA yağış. Yeni bir tüpe dikkatli bir şekilde üst sulu faz transfer. 750 ul izopropanol ekleyin. 10 dakika (ile ters ajite) oda sıcaklığında inkübe edin. C. -19 ° C/-31 ° C'de 2 saat inkübe 2-8 ° C'de 30 dakika boyunca 12,000 x g'de santrifüjleyin örnekleri
  4. RNA yıkama ve süspansiyon. Santrifüj sonrasında, süpernatant kaldırmak. Yıkama RNA 1 ml% 80 EtOH (Tüpleri yavaşça ters) ile pelet. 2-8 ° C'de 10 dakika boyunca 7500 x g'de santrifüjleyin örnekleri P1000 ve P10 kullanarak süpernatant kaldırmak. 2-3 dakika boyunca havada kurumaya EtOH'nin kalan izin verin. 70 ° C ısı bloğu 100 ul RNaz içermeyen su, transfer borular ekleme ve pelet çözmek için 2-3 dakika bekletin. Sonra buz koymak. -19 ° C/-31 ° C için kısa süreli depolama mağaza ve -, Uzun süreli depolama için 80 ° C.
  5. RNA saflaştırma. RNeasy Mini Kit (Qiagen) kullanılarak RNA arındırın. Kısaca, 100 ul RNA numunesine 350 ul tampon RLT ekleyerek başlayın ve iyice karıştırın, daha sonra Qiagen prosedürü izleyin. Son olarak, kalite kontrol (adım 3.6) için (50 ul arasında) saflaştırılmış ürünün bir kısım, 3 ul alır. Saklayın RNA -19 ° C/-31 ° C, kısa vadeli bir süre için ya da uzun süreli saklama için -80 ° C'de.
  6. RNA QC (Şekil 4A). Üretici talimatlarına göre, RNA kalitesi ve Bioanalyzer (Agilent) ve bir Nanodrop (Thermo) kullanarak RNA bütünlüğünü kontrol edin. RNA Bütünlük sayısı (RIN) RNA kalitesini değerlendirmek için kullanılır. Özellikle, 18S ve 28S tepe saptanmasında başarılı kuvvetle daha fazla adımda örnekleri kullanılması önerilir.

4. WT-ovation RNA amplifikasyon

WT-Ov kullanılarak amplifikasyon adımları gerçekleştirmek için Önerileruygun koşullarda ation amplifikasyon kiti:

  • Pipetleme hassasiyetini sağlamak için bir defada en az sekiz güçlendirme örnekleri çalıştırın. 8 reaksiyonların 3 parti halinde kitin bir yarma gerektiren ana karışımları hazırlarken Daha sonra, 1 atık hacmi oluşturmaktadır.
  • Aksi belirtilmediği sürece her zaman buz üzerinde Çözülmüş bileşenleri ve reaksiyon tüpleri tutmak.
  • Arıtma için sadece taze% 80 etanol solüsyonu kullanın.
  • Protokol herhangi bir aşamada bitmiyor.

  1. 25 ng / ul 'lik bir konsantrasyon elde etmek için, toplam RNA seyreltin. Seyreltilmiş örnek 2 ul işleyin.
  2. Hazırlanması Poli-A 1:25.000 seyreltme elde etmek için Poli-A Kontrol Seyreltme Tamponu (Affymetrix) ile Poli-A RNA Stokta bir seri seyreltme, RNA kontrol başak-in çözelti.

    Adım 1: 4,3 'den ilk şerit cDNA sentezi - 4.8. Aşağıda belirtilen reaktif maddeler ile ilgili olarak ifade edilmiştir: A1 (First Strand Primer Mix), A2 (First Strand Tampon Mix), A3 (First Strand Enzim Mix).

  3. Oda sıcaklığında A1 ve A2 çözülme. 2 sn 2 sn ve spin için bir vorteks mikser ile karıştırın. Daha sonra, hızlı bir şekilde buz üzerine yerleştirin. Buz üzerinde A3 yerleştirin.
  4. Bir 0.2 ml PCR tüpü içinde total RNA (50 ng) 2 ul koyun ve A1 2 ul (nihai hacim: 4 ul) ekleyin. Şapka ve 2 sn tüp spin.
  5. 5 dakika boyunca 65 ° C'de inkübe edilir, daha sonra buz üzerinde tüp yerleştirin.
  6. (A tek bir reaksiyon için verilen) aşağıdaki gibi First Strand cDNA Master Mix hazırlayın. Pipetleme karıştırın ve Master Mix kısaca aşağı doğru döndürün. Hemen sonra, buz üzerine yerleştirin.
    Reaktif Hacim
    First Strand Tampon Mix (A2) 5 ul
    Poli-A RNA Kontrol (1:25.000) 0.5 ul
    First Strand Enzim Karışımı (A3) 0.5 ul
  7. Ekle 6 & #181; RNA / Primer içeren tüp Master Mix l. 2 sn için tüp spin hafifçe vurarak karıştırın ve hızlı bir şekilde buz (son hacim: 10 ul) üzerine yerleştirin.
  8. 15 dakika boyunca, daha sonra 1 dakika boyunca, daha sonra 10 dakika daha sonra, 25 ° C, 10 dakika boyunca 42 ° C ve 70 ° C boyunca 4 ° C'de inkübe edin. 4 ° C'de serin tutun , Termal döngü gelen reaksiyon tüpünü çıkarın kısaca döndürün ve buz üzerinde tutmak. Ikinci zincir cDNA Sentez, aşama a hemen devam edin.

    Adım 2: 4.8 'den ikinci zincir cDNA Synthesis - 4.12. B1 (ikinci tür tampon Mix) ve B2 (İkinci Strand Enzim Mix): aşağıdaki gibi bahsedilen reaktif maddeler ile ilgili olarak adlandırılır.

  9. 2 sn B2 ve B3 aşağı Spin ve hızlı bir şekilde buz üzerine yerleştirin. Oda sıcaklığında B1 çözülme. 2 saniye boyunca bir vorteks mikser kullanarak karıştırın, hızlı bir şekilde 2 saniye boyunca sıkma ve buz üzerine yerleştirin.
  10. (Tek bir reaksiyon için verilen) aşağıdaki gibi bir İkinci Strand Master Mix hazırlayın. Pipetleme karıştırın ve Master Mix brie aşağı spinsinek. Hemen sonra, buz üzerine yerleştirin.
    Reaktif Hacim
    İkinci Strand Tampon Mix (B1) 9.75 ul
    İkinci Strand Enzim Karışımı (B2) 0.25 ul
  11. Her First Strand Reaksiyon tüpüne Master Mix 10 ul ekleyin. 3x, ice (20 ul son hacim) 2 saniye ve yer için spin pipetleme karıştırın.
  12. 5 dakika boyunca, daha sonra 1 dakika boyunca 30 daha sonra 10 dakika, daha sonra dakikada, 25 ° C, 50 ° C ve 70 ° C boyunca 4 ° C'de inkübe edin. 4 ° C'de serin tutun , Termal döngü gelen reaksiyon tüpünü çıkarın kısaca döndürün ve buz üzerinde tutmak. Post-İkinci Strand Geliştirme adımda hemen devam.

    Adım 3: 4.13 Post-İkinci Strand Geliştirme - 4.15. Aşağıda belirtilen reaktif maddeler ile ilgili olarak ifade edilmiştir: B1 (ikinci tür tampon Mix), B3 (Tepkime Enhancement enzim Mix).

  13. (Tek bir reaksiyon için verilen) aşağıdaki gibi B1 ve B3 Mix birleştirerek bir Master Mix hazırlayın. Pipetleme karıştırın ve Master Mix kısaca aşağı doğru döndürün. Hemen sonra, buz üzerine yerleştirin.
    Reaktif Hacim
    İkinci Strand Tampon Mix (B1) 1.9 ul
    Reaksiyon Geliştirme Enzim Mix (B3) 0.1 ul
  14. Her İkinci Strand Reaksiyon tüpüne Master Mix 2 ul ekleyin. 3x, ice (22 ul son hacim) 2 saniye ve yer için spin pipetleme karıştırın.
  15. 20 dakika boyunca, daha sonra 1 dakika boyunca 15 dakika daha sonra, 37 ° C ve 80 ° C boyunca 4 ° C'de inkübe edin. 4 ° C'de serin tutun Kısaca spin ve buz üzerine yerleştirin, termal döngü gelen reaksiyon tüpünü çıkarın. SPIA Amplifikasyon adımla hemen devam edin.

    Adım 4: 4,16 dan SPIA prosedür ile tek iplikli cDNA (sscDNA) sentezi -4.19. C1 (SPIA Primer Mix), C2 (SPIA Buffer Mix), C3 (SPIA Enzim Mix): aşağıdaki gibi bahsedilen reaktif maddeler ile ilgili olarak adlandırılır.

  16. Oda sıcaklığında C1 ve C2 çözülme. 2 saniye boyunca bir vorteks karıştırıcı, falso kullanarak ve hızlı buz üzerine yerleştirin karıştırın. Buz üzerinde C3 çözülme. Nazikçe 5x ters çevirerek karıştırın. Hava kabarcıkları tanıtmak için değil emin olun. Sonra, buz üzerinde 2 saniye ve yer için dönerler.
  17. Aşağıdaki gibi bir 0.5 atık hacmi için muhasebe, bir SPIA-Master Mix hazırlayın. Pipetleme karıştırın ve Master Mix kısaca aşağı doğru döndürün. Hemen sonra, buz üzerine yerleştirin.
    Reaktif Hacim
    SPIA-Tampon Mix (C2) 5 ul
    SPIA-Primer Mix (C1) 5 ul
    SPIA-Enzim Mix (C3) 10 ul
  18. Geliştirilmiş İkinci Strand Tepki t SPIA Master Mix 20 ul ekleyinube. 6-8x, falso pipetlenerek ve hızlı bir şekilde buz üzerinde (: 42 ul son hacim) koyun karıştırın.
  19. 5 dakika boyunca, daha sonra 1 dakika daha sonra, 60 dakika boyunca 47 ° C ve 95 ° C boyunca 4 ° C'de inkübe edin. 4 ° C'de serin tutun , Termal döngü gelen tüp çıkarın kısaca döndürün ve buz üzerine yerleştirin.

5. sscDNA saflaştırma ve Kalite Kontrol

  1. sscDNA saflaştırılması. QIAquik PCR saflaştırma kiti (Qiagen) kullanılarak sscDNA arındırın. Kısaca, yükseltilen cDNA ürünün 42 ul 200 ul tampon PB ekleyerek başlayın karıştırın ve kolon yük. Sonra Oiagen prosedürü uygulayın. Son olarak, kalite kontrolleri (adım 5.2) için (30 ul dışında) sscDNA saflaştırılmış ürünün bölüntüsünün 3 ul alır.
  2. (Şekil 4B) elde edildi ve boyut dağılımı doğrulama sscDNA. Üretici talimatlarına göre, sscDNA verim ve Bioanalyzer ve Nanodrop kullanarak boyutu dağılımını kontrol edin. Amplifiye cDNA dağılım büyüklüğü b olmalıdıre genellikle 600 üsleri etrafında bir zirve ile uzun 100 ve 1500 üsleri arasında oluşmaktadır.

6. sscDNA Parçalanma

  1. Nükleazlar-serbest su ile ses düzeyini ayarlama, 30 ul cDNA 2 mg hazırlayın.
  2. 10x OPA tampon PLUS çözüm başlayarak, 1x Tek-Phor-All Tampon PLUS (OPA) hazırlayın.
  3. 0.2 U / ml DNase I hazırlanması (1 U / ml DNase I 5-kat seyreltme).
  4. Aşağıdaki gibi bir parçalanma Master Mix hazırlayın (tek bir reaksiyon için verilen):
    Reaktif Hacim
    10X Tek Phor-All Tampon PLUS 3.6 ul
    DNase I (0.2 U / ul) 3 ul
  5. SscDNA ve 30 ul Parçalanma Mix 6.6 ul ekleyin.
  6. Spin ve daha sonra 10 dakika boyunca 95 ° C 'de, DNase I, inaktive ve buz üzerinde tutulur, 10 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Kısım 1 &# 181; Agilent bazlı boyut dağılımı doğrulama için parçalanmış cDNA l.
  7. sscDNA boyut dağılımı doğrulama (Şekil 4C). Bir Bioanalyzer (Agilent) kullanılarak sscDNA boyutu dağılımını kontrol edin. Parçalanmış cDNA'nın boyut dağılımı, tipik olarak 35 ile 200 baz arasında yer alan olmalıdır.

7. Parçalanmış sscDNA Etiketleme

  1. DEPC su içinde 5 mM DRL-1a 7.5 mM seyreltin.
  2. Aşağıdaki gibi bir etiketleme Master Mix (tek bir reaksiyon için verilen) hazırlayın:
    Reaktif Hacim
    5x TdT Reaksiyon Tamponu 14 ul
    CoCl2 (25 mM) 14 ul
    DLR-1a (5 mM) 1 ul
    Terminal transferaz (400 U / ml) 4.4 ul
  3. Etiketleme karışımı 33.4 ul ekleHer parçalanmış cDNA örnek.
  4. , Tüp hafifçe vurarak karıştırın kısaca döndürün ve 60 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edilir, daha sonra buz üzerinde tutun.

8. Herv Chip microarray için hibridizasyon

  1. Ön-hibritleme Mix (Affymetrix) 200 ul herv GeneChip ön ıslatılmış ve 10 dakika boyunca, 50 ° C, 60 rpm'de inkübe edin.
  2. (A tek bir reaksiyon için verilen) aşağıdaki gibi Hibridizasyon karışımı hazırlayın:
    Reaktif Hacim
    Kontrol Oligo B2 (3Nm) 3.3 ul
    20x Ökaryotik Melezleştirme Kontrol 10 ul
    2x Hibridizasyon Mix 100 ul
    % 99.9 DMSO 17.7 ul
  3. Nihai vo için oda sıcaklığında parçalanmış ve etiketlenmiş cDNA 69 ul hibridizasyon karışımı içinde 131 ul ekle200 ul lume.
  4. Karışım 95 ° C'de 2 dakika boyunca denatüre, daha sonra 5 dakika boyunca maksimum hızda 5 dakika santrifüj boyunca 50 ° C'de inkübe edin.
  5. Önceden silinmiş herv GeneChip boşaltın ve 200 ul hedef hazırlık yükleyin. İki septanın sert noktalar uygulayın.
  6. 18 saat, 50 ° C, 60 rpm'de hibridize olur.
  7. 18 saat sonra herv GeneChip boş ve 4 ° C de toplandı hibritleme çözeltisi depolamak Fişleri hemen ardından 4 ° C'de depolanır akışkansal, üzerine çalışılmazsa 250 ul yıkama tamponu A ile prob dizisi doldurun

9. Yıkama ve Boyama

  1. GCOS menü çubuğundan Fluidics çalıştırın. Fluidics iletişim kutusunda, ilgi istasyonunu seçin (1 - 4), daha sonra tüm modüller için Shutdown_450 seçin, daha sonra çalıştırın. Milli-Q su içine 3 Fluidics aspirasyon hatları bırakın. LCD ekran yönergelerini takip ediniz.
  2. Tüm modüllere Prime_450 programı uygulayın. Yıkama Tampon A için boru yerleştirin200 ml Yıkama Tampon B'yi içeren bir şişe 400 ml Yıkama Tampon A ihtiva eden şişe ve Yıkama Tampon B için bir Sonra tekrar, LCD ekrandaki yönergeleri izleyin.
  3. Iğneler yukarı kaldırın ve 600 ul leke kokteyl 1 (SAPE Çözüm Mix) ve 600 ul leke kokteyl yerleştirin 2 (Antikor Çözüm Mix) pozisyonları # 1 ve # 2 de mikrosantrifuj tüpler içeren ve 800 ul dizi pozisyonu # 3 de tampon solüsyonu tutan .
  4. Ekrandaki yönergeleri izleyerek, FS450-004 protokolünü seçin ve her modülü çalıştırmak, her modül için doğru çip atayın.

10. Tarama

  1. GS3000 tarayıcıyı ısıtın. Bu ışığı yeşile döndüğünde taramaya hazır.
  2. Sızmaması için septa üzerine sert noktalar uygulayın sonra tarayıcıya doğrudan alternatif robotun içine çip yüklemek ya. Taramayı başlatın.
  3. Çip taradıktan sonra,. Cel dosyaları oluşturulur. Şekiller 4D-F).

11. Veri Analizi

  1. Kalite kontrol. Standart Affymetrix bakın herv-V2 cips QC kriterlerini karşılamak olduğunu doğrulamak için kontrol eder. Bu amaçla aşağıdaki temsiller kullanılabilir: yoğunluk medyan karşı günlük yoğunluk değeri dağılımı (yoğunluk araziler ve kutu araziler), medyan mutlak sapma (MAD) (MAD-Med) araziler, plan araziler, normalize ölçeklenmemiş standart hata (nkullan) araziler ve göreli günlük ifadesi (RLE) araziler.
  2. Normalleştirme. Buna ek olarak, veri kümesi beklenmedik toplu etkilerini vurgulamak ve istatistiksel analiz önce bunları düzeltmek için araştırılmalıdır. Veri ön işleme böylece arka plan düzeltme (örneğin. Triptofan prob temel sinyaline dayalı), RMA normalleşme ve özetleme 15 tarafından takip içerir.
  3. Veri madenciliği ve diferansiyel ifade genler için arama. Cips normalleştirmek ve hiyerarşik bir clusteri uygulamakveri kümesini (Şekil 6A) keşfetmek için ng yaklaşım. Sonra, mikrotertibin klasik bir önemli analizi (SAM) bir yanlış keşif oranı (FDR) düzeltme 17 tarafından takip prosedürü 16 kullanılarak farklı olarak ifade genlerin (°) için bir arama gerçekleştirin. Bu adımları tam Partek GS gibi bazı yazılım analizi suit entegre edilmiştir, ancak alternatif BioConductor projenin 19 paketleri ile R istatistik yazılımı 18 kullanılarak yapılabilir unutmayın. Yapılan istatistiksel analizler sonucunda, ifade değerleri az 2 6 olduğu için probesets dışlamak için veri kümesini filtre.
  4. Görselleştirme ve yorumlanması. Açıklama veritabanlarını kullanarak özel bir arayüzü herv-V2 mikrotertibin gelen sonuçları yorumlayın.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transkriptomik çalışmalar başlangıç ​​değeri, biyolojik maddenin kalitesi esas almaktadır. RNA ekstraksiyonu, uygun koşullarda gerçekleştirilir ise, RNA bütünlüğü numarası (RIN) tipik olarak 7 veya daha yüksek (Şekil 4A) 'dir. Affymetrix herv-V2 çip üzerindeki cDNA 2 ug hibridize için ihtiyaç bir amplifikasyon işleminin kullanılmasını ifade eder. Başarılı bir yükseltme adımı, bir çan şeklindeki dağılımı (Şekil 4B) yol açar. Daha sonra, DNAse1 parçalanma yaklaşık 100 nükleotid hibridizasyon (Şekil 4C) önce cDNA boyut dağılımı daha homojen hale getirmek için gerçekleştirilir. Hibridizasyon ve tarama (Şekil 4D) sonra, görüntünün bir görsel denetim ızgara iyi noktalar (Şekil 4E) hizalanmış olup olmadığını kontrol için bir olanak sağlar ve melezleme kontrolleri tutarlı ise (Şekil 4F). Bu adım, mikrodiziler dışlamak için de faydalı olduğu hava kabarcıkları veya hata Deney sırasında oluştu.

Cips QC (Şekil 5) geçti ve normalleştirme sonra, Lyon-Sud Hastanesi'ne 5 maç-pair tümör ve normal prostat RNA örneklerinin istatistiksel analiz diferansiyel ifade değerleri ile 207 herv probesets belirlenmesi (p.val yol açtı kez <0.05) (Şekil 6A). Bu kayıtları desteklemek ve prostat spesifik bilgiler elde etmek için, 35 ek maç çifti örnekleri (kolon, yumurtalık, testis, meme, akciğer ve prostat) sonunda tespit analizi ve SAM-FDR prosedürü (FDR =% 20) ilave edildi 44 prostata özgü herv probesets. Bunlar arasında, en uygun 10 herv yapılar (Şekil 6B) tarif edilmiştir. Ileri klinik çalışmalar bu aday biyomarkerların duyarlılık ve özgüllük değerlerini değerlendirmek için gerekli olacaktır.

pload/50713/50713fig1.jpg "width =" 500px "/>
. Klinikten genel yöntemin Şekil 1 Scheme aday biyomarkerların tanımlanmasına yol açan: (numune hazırlama, hedef hazırlama, mikroarray işleme 2-6) tezgah (1 klinisyen ve patolog tarafından doku hazırlanması tarafından prostatektomi) (7: herv microarrays Biocomputing analizi). Normal dokudan türetilmiş nükleik asitler turuncu tasvir edilir; tümöral alanda türetilen nükleik asitler (turuncu) ve tümör spesifik (siyah) nükleik asitler normal bir karışımı oluşur. resmi büyütmek için buraya tıklayın .

figure-results-1
. Şekil 2 Anlayışı ve herv-V2 çip içeriği: herv dizileriİnsan genomunun alınan herv-gDB3 adı verilen bir veritabanında depolanır, daha sonra 25-mer aday sondalar, elde edilen hedef alt bölümlerinin her biri için tasvir edilmiştir (en sonunda dizisi üzerinde sentezlenen önce özel bir melezleştirme modelleme işlemi (EDA +) geçmesine aile). resmi büyütmek için buraya tıklayın .

figure-results-2
Patolog tarafından Şekil 3. Prostat taşıma. (A) Taze radikal prostatektomi numune laboratuvara transfer edilir. (BC) prostat (sol tarafta siyah sağ tarafta yeşil) lekeli. (D) arka tarafında bezinin büyük enine kesit. (E) sağlam, piec marjları bırakmakdokuların es prostat bezinin farklı alanlarda disseke. Doku (F) Çekirdek, bir Eppendorf tüpü içinde yerleştirilir. (G) Dikiş ipliği prostat kapatın ve bezi bozulma ve cerrahi sınırın asgari aksamaması için kullanılır. Sonra, radikal prostatektomi örnek histolojik analiz için olağan prosedüre göre formalin içinde tespit için hazır. resmi büyütmek için buraya tıklayın .

figure-results-3
Nükleik asit hazırlanması ve hibridizasyon verimliliği Şekil 4,. Kalite kontrol eder. (A) RNA bütünlüğü, (B) cDNA hedefleri ve hibridizasyon aşamada kullanılan (C) parçalı büyütülmüş hedefler. Thüç kalite kontrolleri RNA nano cips ve Eukaryote Nano Serie II deneyi kullanılarak Bioanalyzer ile elde edilmiştir ese. (D) taramadan sonra herv-V2 mikroarray hibridizasyon alanında, (E) sol üst köşesi gösteren grid hizalama kontrolleri genişlemesi ve melezleme kontrolleri lekelenme gösteren merkez alanın (F) genişleme genel görüntü. resmi büyütmek için buraya tıklayın .

figure-results-4
Şekil 5, sinyalleri. Processing. (A) Affymetrix polyA başak-amplifikasyon kontrolleri. PoliA B. Dap, Thr, Lys Phe ve kontrol transkriptleri subtilis genleri RNA örnek çivili ve genel başarısını değerlendirmek için hizmet edilir Hedef hazırlık adımları. Şiddeti hiçbir önyargı yüksek ve düşük ifade genler arasındaki WT-Ovation amplifikasyon sırasında orada olduğundan emin olmak için, bu başak denetimlerin arasındaki değerleri azalan tespit edilmelidir. (B) Affymetrix başak-melezleme kontrolleri. E izole Bu hedefler coli ve P1 bakteriyofaj etiketleme prosedürü önce çivili. BioB, BIOC, Biol ve Cre gelen artan değerleri, melezleşme genel başarısı göstermektedir. RMA normale döndükten sonra, çip sinyallerin (C) yoğunluk dağılımı. Alt 2 6 (arka) daha yüksek değerlere sahip probesets sergi sinyallerin çoğu, özellikle bazı özel herv loci sınırlı genel bir ifade ettiğini belirten. resmi büyütmek için buraya tıklayın .

ftp_upload/50713/50713fig6.jpg "width =" 500px "/>
Şekil 6,. Veri analizi. Normal ve tümör örnekleri (A) Hiyerarşik kümelenme analizi. Ve aşağı normal ve tümöral örnekleri arasında (mavi)-regülasyon - bölümleme kümeleme, Öklid uzaklık fonksiyonu algoritmasını kullanarak (kırmızı) içine probesets gruplama normalize ifade değerleri uygulanmıştır. Prostat kanserinin aday biyomarkeri olarak tanımlanan ilk 10 herv yapıların (B) Seçim. Her herv öğesi için, ilgili herv aile, genomik koordinatlar (NCBI 36/hg18) ve herv yapısının kısa bir açıklama verilmiştir. resmi büyütmek için buraya tıklayın .

figure-results-5
Şekil 7. Herv repertuar. (A) insan genomunun Sıralama 25.000 protein kodlayan genler (eksonları,% 2) ve 200.000 uzun terminal tekrarı (LTR) retrotranspozonları (herv,% 8) dahil transposable elementlerin büyük miktarda saptandı. Herv-V2 yonga içeriği (B) Ekstrapolayon ve ilgili ifade verileri (tümöral doku tiplerinin karşı 8 normal menşeli 79 örnekleri) herv repertuar üçte biri transkripsiyonel etkin olduğunu düşündürmektedir. resmi büyütmek için buraya tıklayın .

figure-results-6
Şekil 8. Çip sinyallerin Fonksiyonel yorumlanması. (A) Promoter kimlik ve epigenetik kontrol: U3 negatif sinyal (kırmızı prob, 5'LTR) R-U5 pozitif sinyaline karşı (mavi prob, 5'LTR) farklı CpG metilasyonu (katı siyah daireler) tümöral dokularda karşı peritümoral normal U3 içeriği ile desteklenen U3-odaklı transkripsiyonu, öneririz. (B) Ekleme stratejisi: mRNA tümör içinde özel olarak ifade edilen kodlayan varsayımsal 3.1 kb kaplama üst üste binen SD1/SA2 prob ekleme birleşme ile tanımlanır. * Olmayan diğer plasental dokularla karşılaştırıldığında Yazışmalar. resmi büyütmek için buraya tıklayın .

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Son 10 yılda, herv ifade ölçümü için girişimleri çoğu RT-PCR teknikleri kullanılmış ya herv cins 25,26 genel eğilimleri değerlendirmek için pol genlerin göreceli korunması dayalı özel bir lokus 20-24 veya odaklanmak . Buna ek olarak, herv ailesine 27,28 ekspresyonunu tespit etmek ve ölçmek için tasarlanmıştır düşük yoğunluklu mikrodiziler ile birleştiğinde çok dejenere primerler kullanılarak PCR büyütmesi. Bir aile içinde tek tek lokusunun ekspresyonunu izlemek için, daha sonraki klonlama ve sıralama ile kombine korunmuş bölgelerin PCR amplifikasyonu göre yaklaşımlar için HML-2 29,30 veya herv-E4.1 31 ailelerin transkripsiyonal olarak aktif ayrı elemanları etkin belirlenebilir. Ayrıca klonlama ve dizileme adımlarla biten, aktif HML-2 spesifik insan yalnız LTR tespit tekrarlar arasında destekleyicileri belirlemek amacıyla genom tekrar ifade izleme tekniği 32,33. Bu arka arkaya bir aile içinde 34,35 paralog elemanları arasındaki çapraz tepkimeleri en aza indirgemek amacıyla tekrar element Sonda tasarımı için uygun yöntemler tanıtan herv transcriptome analizlerine özel yüksek yoğunluklu mikrodiziler iki nesil geliştirdi. Herv-W, herv-H, herv-E 4.1, herv-FRD, herv-K HML-2 ve herv-K HML-5 ailelerin 2.690 ayrı-virüsler ve 2.883 yalnız LTR hedefleyen herv-V2 yonga tanıttı farazi prostat kanseri biyolojik tanımlanması ile bu yazıda gösterildiği dokuların 35, geniş bir 1.718 herv loci (Şekil 7A ve B) 'nin ifadesi. Buna ek olarak, belirli bir lokus üzerinde birden probesets kullanımının kendi transkripsiyon düzenlemesi ile ilgili bilgi veriyor. İlk olarak, U5 pozitif biri ile bağlantılı olarak bir U3 negatif sinyal, bir promoter olarak LTR sınıflandırır, ve tersine U3 pozitif ve negatif sinyaller U5 bir poliadenilasyon rol yansıtabilir. Biz böylece idizisi tarafından sağlanan bu U3-U5 dikotom bilgilere dayalı dokular 35 ve geniş bir aralıkta 326 promotör LTR dentified, biz önerilen ve deneysel böyle özerk transkripsiyon bir metilasyon bağımlı epigenetik süreci 34 (Şekil tarafından kontrol edildiğini, bazı seçilmiş olgularda doğruladı 8). Plasentada ve tümöral testis 34 ERVWE1/Syncytin1 ekspresyon profili ile gösterildiği gibi İkinci olarak, örneğin, LTR gelen sinyallerin bulgulanması, gag ve env bağımsız probesets ya da belirli bir ek yeri birleşim hedef prob tarafından verilen, proviral birleştirme stratejisi ile ilgili bilgi veriyor. Bu herv spesifik prob seçimi işlemi (Şekil 8) olarak etkin bir geleneksel genler 36 için olduğu gibi, doku ile ilişkili birleştirme stratejisi kimlik desteklemek için yeterince sağlam olduğunu gösterir.

Bu yöntem tek tek herv odağı ifadeyi belirlemek için ilk girişimAfpymetrix teknolojisine dayanan özel bir yüksek yoğunluklu mikrodizisi kullanılarak. Mikrodizi formatının açıkça tanımlanmış avantajları (i) 'den oluşan herv transcriptome çözmek için çeşitli herv ailelerin koordine arama ve her bir lokus için farklı bölgelerin (ii) aynı anda ve bağımsız analizi, örn. Solo ve proviral LSY ları, gag ya da env bölgelere ve herhangi bir önsel herv elemanın işlevselliğine olmadan proviral yapıları ile ilişkili olası spliced ​​kavşaklar için, U3 ve U5 etki. Beklentiler mikroarray ilişkili Biocomputing araçları açıklamaları bir gelişme güvenmek. Bu, böyle bir kanıtlandığı aktif HERVs lncRNA transkripsiyon, sürücü ya da daha fazla veya daha az yakın kodlayıcı gen ifadesini modüle eden olmadığı gibi biyolojik hipotez halinde çip sinyalleri dönüştürmek için izin vermelidir. Nitekim, bu tür varsayım v bileşenleri içeren prostat kanseri ile ilişkili ncRNA transkriptleri tespit son çalışmalar tarafından desteklenmektedirherv-K, endojen retrovirüs bir aile ya da bölümleri bir virüs LTR yükseltici bölgesi 37, hem de iki füzyon gen etkinlikleri, yani herv-K22q11-ETV1 ve herv-K17-ETV 38,39 ikinci iral ORF. Birlikte ele alındığında, LTR fonksiyonu ve ekleme stratejisi kimlikleri ile birlikte bu tüm transcriptome yaklaşım tetik kronik 40,41 içinde herv ifade bileşenleri ve bulaşıcı hastalıklara karşı 42,43 işaretleyici deşifre yardımcı olabilir.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma bioMérieux SA, Bakımevleri Civils de Lyon ve Fransız kamu kurumu OSEO (Yeni Tedavi Yaklaşımları için İleri Tanı, kişiselleştirilmiş tıp adanmış bir Fransız hükümet tarafından finanse edilen bir program) tarafından desteklenmiştir. PP, VC, GO, NM ve FM bioMérieux SA çalışanlarıdır. PP, NM ve FM bu yazının bulgularını kapsayan patent başvurularımız var.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz herv-V2 protokolünün ilk geliştirme ve optimizasyon katkılarından dolayı Cecile Montgiraud, Juliette Gimenez, Magali Jaillard ve Bertrand BONNAUD teşekkür ederim. Biz de etik konularla ilgili yaptığı rehberlik için Hader Haidous teşekkür etmek istiyorum.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
TrizolInvitrogen15596-026
RNA poli-A kontrol stoğuAffymetrix900433
DNAse 1PromegaM61011.000 U (1 U/&mikro; l)
Terminal transferazRoche3333574001400 U. Enzim ve koenzim dahil (CoCl2< / sub>).
DLR-1aAffymetrix900542
Hibridizasyon iç kontrolleri B2 ve 20x Ökaryotik Hibridizasyon KontrolüAffymetrix900454
GeneChip Hibridizasyon, Yıkama ve boyamaAffymetrix90072030 reaksiyon için PreHybridization Mix ve 2x Hybridization Mix dahil
10x One-Phor-All Tamponu PLUSDEPC ile arıtılmış sudaki bileşim: 100 mM Tris-asetat pH 7.5; 100 mM magnezyum asetat; 500 mM potasyum asetat.
RNeasy Mini kitiQiagen74104RNA temizleme protokolü
WT-Ovation RNA amplifikasyon sistemiNugen2210-24
QIAquik PCR arıtma kitiQiagen28104
EQUIPMENT
Material AdıŞirket KatalogNumarası Yorumlar
Nanodrop 1000Thermo Scientific
GeneChip Tarayıcı 3000 7GAffymetrixGS30007Gİsteğe bağlı: otomatik yükleyici
GeneChip Fluidics Station 450AffymetrixFS450
GeneChip Hibridizasyon 640 FırınAffymetrix6404 GeneChip Prob dizisi taşıyıcısı içerir
GeneChip Tarayıcı 3000 Yüksek Çözünürlüklü Tarama Yaması
HERV-V2 çipiAffymetrixCustom array.
dahil olmak üzere GeneChip İşletim Yazılımı (GCOS) yüklü iş istasyonu Mikrodizi kullanılabilirliği için (yalnızca araştırma amaçlı olmak üzere), lütfen iletişime geçin:
Franç ois Mallet
Laboratoire Commun de Recherche Hospices Civils de Lyon-bioMé rieux
Tıbbi Teşhis Keşif Bölümü
Merkezi Hospitalier Lyon Sud, Bâ timent 3F
69495, Pierre Bé nite cedex Fransa
Telefon: 33 (0)4 72 67 87 85
E-posta: francois.mallet@biomerieux.com
HERV-V2 conception
Özel veritabanı ve ek açıklamalar

6 HERV ailesine ait genomik HERV dizilerini gruplandıran özel bir veri tabanının oluşturulması, aşağıdaki prosedürle elde edilmiştir: (i) her bir HERV ailesinin en eksiksiz ve temsili dizisi literatürden seçilmiş ve bir prototip dizisi olarak tanımlanmıştır (Şekil 2). (ii) 6 prototip, LTR'lerine (U3/R/U5) ve iç parçalarına (gag/pol/env) atıfta bulunularak işlevsel olarak açıklandı. (iii) RepeatMasker 44 daha sonra bu işlevsel diziler girdi kitaplıkları olarak kullanılarak uygulandı. En az %80 homoloji (NCBI 36/hg18) temelinde insan genomu üzerinde tüm ilgili dizilerin genom çapında bir araştırması gerçekleştirildi. (iv) Son olarak, bu işlemle elde edilen fonksiyonel diziler, genomik konumlarına göre farklı lokuslar halinde birleştirildi ve sonunda özel bir HERV veritabanında uygulandı. HERV-gDB3 olarak adlandırılan bu veritabanı, 10.035 ayrı HERV lokisi içerir35.

Locus'a özgü problar design
HERV-gDB3'ten başlayarak, ilk olarak 25-mer aday problarının örtüşen izleri oluşturuldu. Her aday prob daha sonra çapraz hibridizasyon potansiyellerini değerlendirmek için KASH 45 kullanılarak insan genomuna karşı hizalandı. Bu son tahmin, bu amaç için özel olarak geliştirilen ve EDA+ olarak adlandırılan bir model tarafından gerçekleştirildi. Kısaca, EDA+'nın prensibi, 25 mer'lik bir hedef/prob hibridizasyon kompleksindeki uyumsuzluklar ve boşlukların getirdiği kararsızlığı hesaba katmaktır. Düşük çapraz hibridizasyon riskleri (yani . az sayıda spesifik olmayan genomik hedef) sergileyen aday problar seçilir ve son olarak probsetlere monte edilir.

Özel HERV GeneChip mikrodizisi
Özel HERV GeneChip, 23.583 HERV prob setini entegre eder ve 5.573 farklı HERV öğesini ayırt edebilir, solo LTR'lerden, tam ve kısmi provirüslerden oluşur (Şekil 2). Tarafsız amplifikasyon ve hibridizasyon için standart Affymetrix kontrol probları da mikrodiziye dahil edildi.
, ,

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Landmarks in prostate cancer diagnosis: the biomarkers. BJU Int. 110, Suppl 1. 8-13 (2012).">Artibani, W. Landmarks in prostate cancer diagnosis: the biomarkers. BJU Int. 110, Suppl 1. 8-13 (2012).
  2. Negative predictive value for cancer in patients with "gray-zone" PSA level and prior negative biopsy: preliminary results with multiparametric 3.0 Tesla MR. J. Magn. Reson. Imaging. 36, 943-950 (2012).">Girometti, R., et al. Negative predictive value for cancer in patients with "gray-zone" PSA level and prior negative biopsy: preliminary results with multiparametric 3.0 Tesla MR. J. Magn. Reson. Imaging. 36, 943-950 (2012).
  3. Prognostic value of modeled PSA clearance on biochemical relapse free survival after radical prostatectomy. Prostate. 69, 1325-1333 (2009).">You, B., et al. Prognostic value of modeled PSA clearance on biochemical relapse free survival after radical prostatectomy. Prostate. 69, 1325-1333 (2009).
  4. PSA Velocity and Doubling Time in Diagnosis and Prognosis of Prostate Cancer. Br. J. Med. Surg. Urol. 5, 162-168 (2012).">Vickers, A. J., Brewster, S. F. PSA Velocity and Doubling Time in Diagnosis and Prognosis of Prostate Cancer. Br. J. Med. Surg. Urol. 5, 162-168 (2012).
  5. DD3: a new prostate-specific gene, highly overexpressed in prostate cancer. Cancer Res. 59, 5975-5979 (1999).">Bussemakers, M. J., et al. DD3: a new prostate-specific gene, highly overexpressed in prostate cancer. Cancer Res. 59, 5975-5979 (1999).
  6. Urinary prostate cancer 3 test: toward the age of reason. Urology. 75, 447-453 (2010).">Vlaeminck-Guillem, V., Ruffion, A., Andre, J., Devonec, M., Paparel, P. Urinary prostate cancer 3 test: toward the age of reason. Urology. 75, 447-453 (2010).
  7. Expression of the human endogenous retrovirus-K transmembrane envelope, Rec and Np9 proteins in melanomas and melanoma cell lines. Melanoma Res. 16, 223-234 (2006).">Buscher, K., et al. Expression of the human endogenous retrovirus-K transmembrane envelope, Rec and Np9 proteins in melanomas and melanoma cell lines. Melanoma Res. 16, 223-234 (2006).
  8. Identification of the HERV-K gag antigen in prostate cancer by SEREX using autologous patient serum and its immunogenicity. Cancer Immun. 8, 15(2008).">Ishida, T., et al. Identification of the HERV-K gag antigen in prostate cancer by SEREX using autologous patient serum and its immunogenicity. Cancer Immun. 8, 15(2008).
  9. Human endogenous retrovirus K10: expression of Gag protein and detection of antibodies in patients with seminomas. J. Virol. 69, 414-421 (1995).">Sauter, M., et al. Human endogenous retrovirus K10: expression of Gag protein and detection of antibodies in patients with seminomas. J. Virol. 69, 414-421 (1995).
  10. Viruses: Essential Agents of Life. Witzany, G. , Springer-Verlag. 325-361 (2012).">Pérot, P., Bolze, P. A., Mallet, F. Viruses: Essential Agents of Life. Witzany, G. , Springer-Verlag. 325-361 (2012).
  11. Prostate specific antigen in the diagnosis and treatment of adenocarcinoma of the prostate. I. Untreated patients. Untreated patients. J. Urol. 141, 1070-1075 (1989).">Stamey, T. A., Kabalin, J. N. Prostate specific antigen in the diagnosis and treatment of adenocarcinoma of the prostate. I. Untreated patients. Untreated patients. J. Urol. 141, 1070-1075 (1989).
  12. Measurement of prostate-specific antigen in serum as a screening test for prostate cancer. New Engl. J. Med. 324, 1156-1161 (1991).">Catalona, W. J., et al. Measurement of prostate-specific antigen in serum as a screening test for prostate cancer. New Engl. J. Med. 324, 1156-1161 (1991).
  13. Prostate cancer around the world. An overview. Urol. Oncol. 28, 663-667 (2010).">Schroder, F. H. Prostate cancer around the world. An overview. Urol. Oncol. 28, 663-667 (2010).
  14. Active surveillance for favorable-risk prostate cancer: background, patient selection, triggers for intervention, and outcomes. Curr. Urol. Rep. 13, 153-159 (2012).">Klotz, L. Active surveillance for favorable-risk prostate cancer: background, patient selection, triggers for intervention, and outcomes. Curr. Urol. Rep. 13, 153-159 (2012).
  15. Exploration, normalization, and summaries of high density oligonucleotide array probe level data. Biostatistics. 4, 249-264 (2003).">Irizarry, R. A., et al. Exploration, normalization, and summaries of high density oligonucleotide array probe level data. Biostatistics. 4, 249-264 (2003).
  16. Significance analysis of microarrays applied to the ionizing radiation response. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 5116-5121 (2001).">Tusher, V. G., Tibshirani, R., Chu, G. Significance analysis of microarrays applied to the ionizing radiation response. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 5116-5121 (2001).
  17. Statistical significance for genomewide studies. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 9440-9445 (2003).">Storey, J. D., Tibshirani, R. Statistical significance for genomewide studies. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 9440-9445 (2003).
  18. Team, R. D. C. R: A language and environment for statistical computing. , (2008).
  19. Bioconductor: open software development for computational biology and bioinformatics. Genome Biol. 5, R80(2004).">Gentleman, R. C., et al. Bioconductor: open software development for computational biology and bioinformatics. Genome Biol. 5, R80(2004).
  20. Survey of human genes of retroviral origin: identification and transcriptome of the genes with coding capacity for complete envelope proteins. J. Virol. 77, 10414-10422 (2003).">de Parseval, N., Lazar, V., Casella, J. F., Benit, L., Heidmann, T. Survey of human genes of retroviral origin: identification and transcriptome of the genes with coding capacity for complete envelope proteins. J. Virol. 77, 10414-10422 (2003).
  21. Detecting the expression of human endogenous retrovirus E envelope transcripts in human prostate adenocarcinoma. Cancer. 98, 187-197 (2003).">Wang-Johanning, F., et al. Detecting the expression of human endogenous retrovirus E envelope transcripts in human prostate adenocarcinoma. Cancer. 98, 187-197 (2003).
  22. Temporal regulation of the expression of syncytin (HERV-W), maternally imprinted PEG10, and SGCE in human placenta. Biol. Reprod. 69, 286-293 (2003).">Smallwood, A., et al. Temporal regulation of the expression of syncytin (HERV-W), maternally imprinted PEG10, and SGCE in human placenta. Biol. Reprod. 69, 286-293 (2003).
  23. Expression analyses of human endogenous retroviruses (HERVs): tissue-specific and developmental stage-dependent expression of HERVs. Genomics. 84, 982-990 (2004).">Okahara, G., et al. Expression analyses of human endogenous retroviruses (HERVs): tissue-specific and developmental stage-dependent expression of HERVs. Genomics. 84, 982-990 (2004).
  24. Expression of human endogenous retrovirus K in melanomas and melanoma cell lines. Cancer Res. 65, 4172-4180 (2005).">Buscher, K., et al. Expression of human endogenous retrovirus K in melanomas and melanoma cell lines. Cancer Res. 65, 4172-4180 (2005).
  25. Development of broadly targeted human endogenous gammaretroviral pol-based real time PCRs Quantitation of RNA expression in human tissues. J. Virol. Methods. 129, 16-30 (2005).">Forsman, A., et al. Development of broadly targeted human endogenous gammaretroviral pol-based real time PCRs Quantitation of RNA expression in human tissues. J. Virol. Methods. 129, 16-30 (2005).
  26. Development of real-time PCRs for detection and quantitation of human MMTV-like (HML) sequences HML expression in human tissues. J. Virol. Methods. 136, 83-92 (2006).">Muradrasoli, S., Forsman, A., Hu, L., Blikstad, V., Blomberg, J. Development of real-time PCRs for detection and quantitation of human MMTV-like (HML) sequences HML expression in human tissues. J. Virol. Methods. 136, 83-92 (2006).
  27. Comprehensive analysis of human endogenous retrovirus transcriptional activity in human tissues with a retrovirus-specific microarray. J. Virol. 79, 341-352 (2005).">Seifarth, W., et al. Comprehensive analysis of human endogenous retrovirus transcriptional activity in human tissues with a retrovirus-specific microarray. J. Virol. 79, 341-352 (2005).
  28. Quantitative multiplex degenerate PCR for human endogenous retrovirus expression profiling. Nat. Protoc. 1, 2831-2838 (2006).">Pichon, J. P., Bonnaud, B., Mallet, F. Quantitative multiplex degenerate PCR for human endogenous retrovirus expression profiling. Nat. Protoc. 1, 2831-2838 (2006).
  29. Expression pattern analysis of transcribed HERV sequences is complicated by ex vivo recombination. Retrovirology. 4, 39(2007).">Flockerzi, A., et al. Expression pattern analysis of transcribed HERV sequences is complicated by ex vivo recombination. Retrovirology. 4, 39(2007).
  30. Expression patterns of transcribed human endogenous retrovirus HERV-K(HML-2) loci in human tissues and the need for a HERV Transcriptome Project. BMC Genomics. 9, 354(2008).">Flockerzi, A., et al. Expression patterns of transcribed human endogenous retrovirus HERV-K(HML-2) loci in human tissues and the need for a HERV Transcriptome Project. BMC Genomics. 9, 354(2008).
  31. HERV-E-Mediated Modulation of PLA2G4A Transcription in Urothelial Carcinoma. PLoS ONE. 7, e49341(2012).">Gosenca, D., et al. HERV-E-Mediated Modulation of PLA2G4A Transcription in Urothelial Carcinoma. PLoS ONE. 7, e49341(2012).
  32. GREM, a technique for genome-wide isolation and quantitative analysis of promoter active repeats. Nucleic Acids Res. 34, e67(2006).">Buzdin, A., Kovalskaya-Alexandrova, E., Gogvadze, E., Sverdlov, E. GREM, a technique for genome-wide isolation and quantitative analysis of promoter active repeats. Nucleic Acids Res. 34, e67(2006).
  33. At least 50% of human-specific HERV-K (HML-2) long terminal repeats serve in vivo as active promoters for host nonrepetitive DNA transcription. J. Virol. 80, 10752-10762 (2006).">Buzdin, A., Kovalskaya-Alexandrova, E., Gogvadze, E., Sverdlov, E. At least 50% of human-specific HERV-K (HML-2) long terminal repeats serve in vivo as active promoters for host nonrepetitive DNA transcription. J. Virol. 80, 10752-10762 (2006).
  34. Custom human endogenous retroviruses dedicated microarray identifies self-induced HERV-W family elements reactivated in testicular cancer upon methylation control. Nucleic Acids Res. 38, 2229-2246 (2010).">Gimenez, J., et al. Custom human endogenous retroviruses dedicated microarray identifies self-induced HERV-W family elements reactivated in testicular cancer upon methylation control. Nucleic Acids Res. 38, 2229-2246 (2010).
  35. Microarray-based sketches of the HERV transcriptome landscape. PLoS ONE. 7, e40194(2012).">Pérot, P., et al. Microarray-based sketches of the HERV transcriptome landscape. PLoS ONE. 7, e40194(2012).
  36. A microarray configuration to quantify expression levels and relative abundance of splice variants. Nucleic Acids Res. 33, e47(2005).">Fehlbaum, P., Guihal, C., Bracco, L., Cochet, O. A microarray configuration to quantify expression levels and relative abundance of splice variants. Nucleic Acids Res. 33, e47(2005).
  37. Transcriptome sequencing across a prostate cancer cohort identifies PCAT-1, an unannotated lincRNA implicated in disease progression. Nat. Biotechnol. 29, 742-749 (2011).">Prensner, J. R., et al. Transcriptome sequencing across a prostate cancer cohort identifies PCAT-1, an unannotated lincRNA implicated in disease progression. Nat. Biotechnol. 29, 742-749 (2011).
  38. Distinct classes of chromosomal rearrangements create oncogenic ETS gene fusions in prostate cancer. Nature. 448, 595-599 (2007).">Tomlins, S. A., et al. Distinct classes of chromosomal rearrangements create oncogenic ETS gene fusions in prostate cancer. Nature. 448, 595-599 (2007).
  39. Truncated ETV1, fused to novel tissue-specific genes, and full-length ETV1 in prostate cancer. Cancer Res. 68, 7541-7549 (2008).">Hermans, K. G., et al. Truncated ETV1, fused to novel tissue-specific genes, and full-length ETV1 in prostate cancer. Cancer Res. 68, 7541-7549 (2008).
  40. The role of human endogenous retroviruses in the pathogenesis of autoimmune diseases. Med. Sci. Monit. 18, RA80-RA88 (2012).">Brodziak, A., et al. The role of human endogenous retroviruses in the pathogenesis of autoimmune diseases. Med. Sci. Monit. 18, RA80-RA88 (2012).
  41. Human endogenous retroviruses and cancer: Causality and therapeutic possibilities. World J. Gastroenterol. 18, 6027-6035 (2012).">Mullins, C. S., Linnebacher, M. Human endogenous retroviruses and cancer: Causality and therapeutic possibilities. World J. Gastroenterol. 18, 6027-6035 (2012).
  42. Resurrection of endogenous retroviruses in antibody-deficient mice. Nature. 491, 774-778 (2012).">Young, G. R., et al. Resurrection of endogenous retroviruses in antibody-deficient mice. Nature. 491, 774-778 (2012).
  43. HIV infection and HERV expression: a review. Retrovirology. 9, 6(2012).">Vander Kuyl, A. C. HIV infection and HERV expression: a review. Retrovirology. 9, 6(2012).
  44. RepeatMasker Open-3.0. , (1996).">Smit, A. F. A., Hubley, R. RepeatMasker Open-3.0. , (1996).
  45. Flexible Pattern Matching in Strings: Practical On-Line Search Algorithms for Texts and Biological Sequences. , Cambridge University Press. (2002).">Navarro, G., Raffinot, M. Flexible Pattern Matching in Strings: Practical On-Line Search Algorithms for Texts and Biological Sequences. , Cambridge University Press. (2002).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

HERV Loci ExpressionMicroarray AnalysisProstate Cancer BiomarkersRNA ExtractionWhole Transcriptome AmplificationHERV Gene ChipHybridization ProtocolDifferential Expression AnalysisFunctional ValidationBiomarker Discovery

Related Articles