Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Alphaherpes Virüs İleriye Taşıma ve Değişken Canlı Hücre Görüntüleme

10.7K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/50723

⸱

16 Ağustos 2013

 ,  , 
1Department of Immunology and Infectious Diseases, Montana State University, 2Department of Molecular Biology, Princeton University

Bu makalede

Özet

Alphaherpes virüs enfeksiyonlarının Canlı hücre görüntüleme yönelik ulaşım ve hücreler arası yayılma dinamik olayların analizi sağlar. Burada, birincil nöronların enfeksiyon sırasında viral meclislerinin görselleştirme kolaylaştırmak için floresan füzyon proteinleri ifade rekombinant viral suşlar kullanmak yöntemleri sunuyoruz.

Özet

Canlı hücre floresan mikroskopi teknikleri, hem de floresan füzyon proteinleri ifade rekombinant viral suşlar yapımında gelişmeler taşıma ve nöron alphaherpes virüs enfeksiyonunun yayılmasını gerçek zamanlı görsel sağladı. Canlı hücre görüntüleme ile birlikte viral membran, zar ve capsids için yeni floresan füzyon proteinlerin programı, akson içinde ulaşım geçiren viral partikül meclisleri tespit. Benzer araçları başarıyla hücreler arasında iletilen virionlann sayısı ve çeşitliliği ölçmek için viral parçacıkların yayılması, hücre-hücre analizi için kullanılmıştır. Önemlisi, anterograd ulaşım ve yayılma canlı hücre görüntüleme teknikleri parçacık taşıma hızları, parçacıkların dağılımları, ve protein yerelleştirme zamansal analizleri de dahil olmak üzere bilgi hazinesi üretmek. Klasik viral genetik teknikleri yanı sıra, bu yöntem kritik bilgiler sağladıönemli mekanik soruları. Bu yazıda ayrıntılı olarak alphaherpes virüs taşıma ve yayılmasının temel sorulara cevap için geliştirilmiştir görüntüleme yöntemleri açıklar.

Giriş

Alphaherpes herpes simpleks virüsü gibi virüsler (HSV) -1, -2, ve pseudorabies virüs periferik sinir sistemi (PNS) enfeksiyon (PRV) viral yaşam döngüsü boyunca çeşitli karmaşık ve oldukça düzenli bir adımdan oluşur. PNS nöronlar içinde Ulaştırma primer viral enfeksiyon ve sonraki arası ana yayılma hem de olaylar sırasında önemlidir. Viral yaşam döngüsü iki bileşeni modüle moleküler mekanizmalar; uzak akson (ileriye taşıma) ve duyarlı hücreleri (ileriye yayılması) için virionlar sonraki iletim içinde hücre organlarından viral meclislerin yönettiği taşıma anlayışı herpes patogenezinde için önemlidir.

Nöronlarda viral parçacıkların taşıma ve çıkış olgun bir bulaşıcı virion 1,2 montajı bağlıdır. Immünofloresan (eğer varsa) ve elektron mikroskopisi (EM) dahil olmak üzere, daha önceden belirlenmiş deneyleri, parçacık montaj durumu ve prot incelemek için kullanılmıştırein etkileşimleri virion ulaşım ve yayılması 3-6 ile ilişkilidir. Ancak kimyasal sabitleme tarafından tanıtıldı taşıma virionların ve deneysel eserler dinamik yapısı sabit görüntülerin 7,8 yorumlanması eleştirilmiştir. Son zamanlarda, viral floresan füzyon proteinleri bir dizi protein fonksiyonu üzerinde ihmal edilebilir etkilere sahip HSV ve PRV için tarif edilmiştir. Kapsid, zar ve glikoprotein 9-11: Yeşil floresan proteini (GFP) ve Kırmızı floresan proteinleri (mCherry veya MRFP) fluorophores genellikle olgun bir virionun üç yapısal bileşenlerinin iki görüntüleme sağlamak için eşleştirilmiş. Çift etiketli virüs kullanarak ileriye taşıma hücre görüntüleme Canlı taşıma sırasında viral parçacıkların montaj durumunu görüntüler. Viral suşlar ifade Benzer florofor sayısı ve yayılma 12,13 aşağıdaki viral genomların çeşitliliği görselleştirmek için kullanılır. Floresan proteinleri özellikleri (14,15 gözden) büyük ölçüde etkileyebilirviral veya cep meclisleri görselleştirmek için yeteneği. Yabani tip işlevselliği korunması için yeni bir protein füzyonları, tasarımı ve test kendi kendine etkileşimleri ve kararlılığı dahil floresan protein içsel özellikleri, dikkate alınmalıdır.

Floresan proteini füzyon, iki in vitro hücre kültürü sistemlerinde iyi karakterize ile birlikte herpes virüsü enfeksiyonu canlı hücre görüntüleme için kullanılır: ayrışmış 16 ve 17 (Şekil 1A) sıçan üstün servikal ganglion (SCG) nöronlar bölümlere. Her iki sistemde de, embriyonik SCG en tek hücre gövdeleri için ayrışmış, disseke edilir ve in vitro kültür 18 için kaplama. SCG nöronlar otonom sinir sisteminin bir parçasıdır ve kolayca olgun bir polarize devlet ex vivo olarak kültür ve nöronal büyüme faktörü (NGF) ile ayırt edilebilir. Ayrışmış SCG nöronlar f sağlayan akson uzun bir ağ oluşturmakya da anterograd ulaşım 6 geçmesi gibi viral parçacıkların görselleştirme. Bölümlere SCG kültürler nöronal hücre gövdesi (S bölmesi) ve distal akson Termini (N bölmesi) 19 akışkan izolasyonu sağlar. Orijinal 20 veya modifiye Campenot odaları 17 ile bölümlere nöronların yapımı ve kullanımı için ayrıntılı protokoller bir dizi daha önce yayınlanmıştır. Akışkan izolasyon nöronal hücre gövdeleri ve izole akson Termini ulaşım sonra döl virionlar tespit seçici enfeksiyonu için izin verir. Enfeksiyon öncesi termini üzerinde epitel hücreleri kaplama viral enfeksiyonun yayılması için alıcı hücreler içerir.

Orada tüm canlı hücre görüntüleme deney için önemli birçok temel unsurlardır, ama bizim protokoller için en uygun olan: otomatik görüntü elde etme, floresan aydınlatma, görüntüleme hızı ve çevre kontrolü. Tüm görüntüleme deneyleri için, kullandığımızters, otomatik, Epifloresans aydınlatma mikroskobu (Şekil 1B). Mikroskop Nikon Eclipse Ti tabanı etrafında inşa ve hızlı bir şekilde yeniden otomatik görüntü alımı sırasında mikroskop için bilgisayar kontrollü motorlu sistemleri bir dizi istihdam etmektedir. Floresan aydınlatma için, aydınlatma yol boyunca nötral yoğunluk filtreleri ile zayıflatılmış olabilir geniş spektrumlu cıva ark lambası kullanın. Tahrik olma filtreleri floresan aydınlatma spektrum sınırlamak ve çok geçişli çift renkli aynalar ve floresan emisyon filtreleri özel floresan bileşikler görselleştirmek ile eşleştirilmiş. Uyarma ve emisyon filtreleri farklı floresan kanalların hızlı sıralı satın sağlamak için bağımsız, hızlı geçiş filtresi tekerlekler monte edilmiştir. Görüntü elde etme hızını daha düşük yoğunluklu sinyal ve kısa görüntü kez okundu tespiti için yararlı bir hassas ve hızlı EM-CCD kamera, ile geliştirilmiştir. Microsc üzerinde çevresel kontrolyerdir kuluçka ısıtılmış bir aşamada üst ve nemlendirilmiş bir CO2 ile zenginleştirilmiş bir atmosfer inkübatör içine geçirilir ise yüksek ısılarda örnekleri korumak için bir objektif lens ısıtıcı ile elde edilir. Mikroskop yakın 25 kadar muhafaza ortam sıcaklığı ile karanlık bir odada tutulur ° C ve tüm pencereler karartma perdeleri ile minimize dış ışık. Aşağıdaki protokoller ileriye taşıma ve yayılması deneyleri için bu sistemin kullanımını tarif eder.

Alternatif bir dizi canlı hücre görüntüleme değişkenleri kontrol etmek için var. Mikroskopi ayarları kontrol elle ya da özel bir yazılım bağımlı otomatik sistemleri ile yapılabilir. Floresan aydınlatma, halojen, LED veya lazer kaynağı ile elde edilebilir. Görüntüleme hızı filtre anahtarlama hızını ve eşleştirilmiş algılama sistemi ile sinyal görselleştirmek için zaman değiştirilir. Çevre kontrolü mi üzerindeki özel donanım ile elde edilebilircroscope sahne, tamamını veya bir ısıtmalı ve nemlendirilmiş kutusuna mikroskop bir parçası, ya da mikroskop yapılacaktır oda sıcaklığı yükseltmek yoluyla bir muhafaza. Bu alternatiflerin her biri maliyet ve performans ile ilgili avantajları ve dezavantajları vardır.

Sonraki protokol, detay rekombinant viral suşlar aracılığıyla hızlı ileriye taşıma ve alphaherpes virüslerin ileriye yayılmasını incelemek için canlı hücre görüntüleme kullanımı. Gerçek zamanlı canlı hücre görüntüleme kapsid, zar ve / veya akson 11 içinde ulaşım geçiren dinamik yapılara glikoprotein co-lokalizasyon görüntüler. Bölümlere nöronal kültürlerin bir gecede timelapse görüntüleme duyarlı hücrelerin 12 aksonal virionu çıkış ve enfeksiyon görüntüler. Burada sunulan protokolleri bizim özellikle görüntüleme sistemi ile kullanım için optimize edilmiş, ancak canlı hücre görüntüleme dört elementin göre geniş anlamda sunulmuştur. TartışmasındaDaha fazla ayrıntı deney başarılı için gerekli olan optimizasyon bazı olacaktır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bölüm 1 - Canlı hücre Floresan Mikroskopi için Çevresel Kontrol Koşulları

  1. Herhangi bir görüntüleme deney öncesinde 30 dakika bağlanmak ve mikroskop sahne üst inkübatör ısınma başlar.
    1. Mikroskop, iletilen ve epifluorescent ışık kaynakları ve otomatik donanım kontrolleri açın. Mikroskop bağlanmak ve EM-CCD kamera soğutma başlamak için mikroskop kontrol yazılımı, NIS Elemanları, açın.
    2. . Lens uygun objektif (ya 60X veya 100X immersiyon yağı) için sıcak Not takın: deney türüne göre objektif lens seçin. 60X faz amacı ileriye yayılması görselleştirmek için uygundur ise 100X diferansiyel girişim kontrast (DIC) ileriye taşıma virion meclislerinin takibi için en iyisidir. Bu örnek ile doğrudan temas yok gibi düşük büyütme, petrol dışı daldırma hedefleri bir lens sıcak gerektirmez.
    3. Mi ve motorlu sahneye aşamasında üst inkübatör takın croscope. Örnek yerde tutacaktır uygun eklemek emin olun. Inkübatör kontrolünden sahne üst inkübatör üzerindeki giriş portuna nemlendirilmiş hava hattı takın.
    4. Inkübatör ve lens sıcak kontrolleri açın ve (tartışma) görüntülü olan objektif ve örnek için özel önceden doğrulanmış koşullarına sıcaklık ayarları.
    5. % 5 CO 2 / üst inkübatör sahneye CO 2 ilave hava sağlamak için% 95 atmosferik tankı üzerindeki kontrol vanasını açın. Akış hızı dakikada gaz 60 ila 80 ml olmalıdır. Daha hızlı oranları nemlendirme odası rağmen geniş örnek dehidratasyon neden olacaktır.
  2. Objektif lens için lens yağ ekleyin ve hemen sahne üst inkübatör içine yansıması olan kültür yerleştirin.
  3. 10 dakika içinde en az kültür sıcaklığının dengeleme izin verir. Bir saat, özellikle Bölüm 3'te açıklanan gece görüntüleme için, tercih edilir.
ve_title "> Bölüm 2 - İleriye Virion ulaşım etkinlik Protokol Gerçek zamanlı Görüntüleme

  1. Altı ile sekiz saat önce görüntüleme, Taylor ve de tarif edilen yöntem kullanılarak ilgi konusu virüs 1 x 10 6 plak oluşturan birim olgun, ayrışmış SCG nöron, bir 35 mm lamel alt çanak (örneğin virüsler için Tablo 1) hastalık ark. 2012A 11. 30-60 dakika tarafından birden fazla virüs, off-set aşılar test benzer zamanlarda, enfeksiyondan sıralı örneklerin görüntüleme sağlamak için eğer.
  2. Herhangi bir deney çalıştırmadan önce 10 dakika en az sahne üst inkübatör içine çanak yerleştirin. Sıcaklık equilibrates ise, odak düzlemi kayıyor ve olumsuz herhangi bir görüntüleme deneyleri etkileyecektir.
  3. Iletilen ışık ve mikroskop mercek kullanarak, açık bir şekilde izole akson uzantısı olan bir nöronal hücre gövdesi bulabilirsiniz. Alternatif olarak, algılama ifade eden bir hücre bulmak için uygun floresan aydınlatma kullanınfloresan proteinleri tablosu miktarda. Çünkü ışığın neden olduğu hücresel hasar ve floresan proteinleri beyazlatma, bu adım ve daha sonraki aşamalarda, floresan aydınlatma için bir örnek maruz kalmasını sınırlamak için önemlidir.
  4. Hücrelerin maruz kaldığı uyarma ışık yoğunluğunu azaltmak için floresan aydınlatma zayıflatır. Nötr Yoğunluk (ND) floresan aydınlatma ışık yolu filtre hafifletici ışık meşgul. Uzun 1 dakika, ND4 en az uzun süren film floresan proteinleri fotoğraf beyazlatma ve akson foto-hasarı geniş önlemek için kullanılmalıdır için. Yüksek floresan yapıları genellikle yerde bir ND8 filtresi ile görüntülenebilir.
  5. Mikroskop yazılım (Şekil 2 ve Ek Film 1A) kullanarak, EM-CCD kamera için ışık yolu açın.
  6. Her floresan kanal için en iyi görüntüleme süreleri ve koşulları belirler.
    1. "Play" düğmesini kullanarak bir canlı görüntü penceresi başlatın.
    2. Her floresan protein için en uygun kamera pozlama ayarları belirleyin. Hızlı hareket eden virion yapıların devinişsel sapmaları olarak kanal başına 300 milisaniye aşmayın meydana gelecektir. (Üretici maksimum kazanç önerilen), maruz kalma süresi en aza indirmek ve loş sinyallerin tespiti geliştirmek için 300 bir ayara kameranın EM kazanç yararlanın. Doğru pozlama süreleri düşük arka plan yoğunluğu ve yüksek özgül sinyalleri bir görüntü elde edilmelidir.
  7. Pozlama ayarı ve akson bir iyi tanımlanmış bir bölge bulduktan sonra, yazılım otomatik görüntü elde etme gerçekleştirmek için yapılandırılmalıdır. Ağartma örnek önlemek için canlı görüntüleme penceresi durdurun.
    1. NIS Elements yazılımı olarak, 6D seçin - Define / menü aşağı "Uygulamalar" açılan Deney uygulamasını çalıştırın.
    2. ND satın alma penceresinde, görüntü elde etme sıklığını belirleyecek Zaman sekmesini tıklatın. "Hayır Gecikme" ve süresi 5 dk için Aralığı ayarlayın. The yazılımı daha sonra 5 dakika süresi için mümkün olan en yüksek frekansta görüntü kareleri kazanacaklardır.
    3. Birden fazla floresan görüntü elde etmek için kullanılan önceden belirlenmiş donanım yapılandırmaları seçimi sağlar "Lambda" sekmesini seçin. Ilk kutusunu tıklatın ve menü aşağı sonraki açılan uygun bir donanım yapılandırması seçin. Yansıması için, flüoresan protein için tekrarlayın.
    4. "XY Pozisyonlar", "Z-serisi" ve "büyük resim" için sekmeleri de-seçilmiş olduğundan emin olun.
    5. Sekmeler üzerinde, işaretli kutusu otomatik olarak satın alma sırasında sabit diske görüntüleri kaydetmek için "Save to File" seçeneğini seçin. Deney çıktı dosyasının konumunu ve dosya adını yapılandırın. Sıralı deneyler olduğundan, yazılım belirlenen dosya adının sonunda bir sıra numarası ekler.
    6. Bir kez tüm sekmeleri seçilmiştir. "Run-Now" butonuna tıklayarak deneme başlatın.
    7. Pozlama ayarları ile görüntü elde etme oranı optimize ve image boyutu. Görüntü mümkün alan küçük bir bölge kullanarak genellikle kare elde etme oranları hızlandırır. % 25 ve toplam görüntü alanının% 50 arasında bir alan seçerek, NIS-Elements ROI aracını kullanarak İlgi Bölge tanımlayın. Alternatif olarak, daha kısa pozlama süreleri kare elde etme oranlarını artırmak, ama (tartışma) sinyal kalitesini düşürür olacaktır.

Bölüm 3 - İleriye spread Olayların Gecelik Time-lapse Görüntüleme

  1. Görüntüleme önce dört saat, bir 35 mm μ-Bulaşık üzerine inşa edilmiş bir bölümlere nöronal kültür bulaştırmak. Taylor ve ark tarif edilen yöntem kullanılarak (örneğin virüsler için Tablo 1) ilgi konusu virüs 1 x 10 6 plak oluşturan birim nöronal hücre gövdeleri inoküle. 2012b 12.
  2. Yavaşça sahne üst inkübatör içine kültür çanak yerleştirin. Nesnel yerini yemeğin tarafına ayarlandığından emin olun. Yavaş yavaş odak, ensur içine objektif getirmekamaç ing örnek içine itmek değildir. Odak alanı tespit edildikten sonra, yavaş yavaş akson bölmesinin iç tarafında demarking iç bariyer yakın, çanak merkezi haline amacı taşıyın. Hareket sırasında, odak derinliği korunmasını sağlamak ve örnek içine iterek kaçının. Amacı ile plastik yüzey sapma akson ve plastik zarar verir.
  3. Sıcak (~ 37 ° C) fosfat Teflon ring dışında kültür çanak tamponlu tuzlu. Yaklaşık 2 ml Bu örnek, dehidratasyon en aza indirmek ve ısı yalıtımı sağlamak için PBS bir halka ile nöronal kültür çevreler.
  4. Sıcaklığı otomatik görüntü elde etme (3.8) başlatmadan önce 1 saat en az gelmesini sağlayınız. 3.7 adımları 3.5 Bu süre içinde yapılandırılabilir.
  5. Tüm nötral yoğunluk filtreleri yaparak mümkün olan en düşük seviyeye aydınlatma yoğunluğunu kısıtlayın. Bu sık sık görüntü elde etme ove sağlayacakfotoğraf-zarar aşırı olmadan r uzun süreler. Aydınlatma azaltılması uzun pozlama (tartışma) gerektiren, düşük sinyal neden olur.
  6. Tarihsel pozlama ayarları veya set-up Bölüm 2.5 'te açıklandığı gibi hedef floresan proteinleri pozlama ayarlarını yapmak için ifade enfekte epitel hücrelerinin paralel bir tabak oluşturmak deneysel önce kullanın.
  7. Gerekli kanallar için pozlama ayarı sonra, otomatik görüntü elde etmek için yazılım yapılandırma zamanıdır. Ağartma örnek sınırlamak için canlı görüntüleme penceresi durdurun.
    1. Elements yazılımı (Şekil 2 ve tamamlayıcı film 2) olarak, 6D seçin - ND Toplama pencere açmak için aşağı "Uygulamalar" açılır menüsünden Deney uygulama tanımlayın / çalıştırın.
    2. ND Toplama penceresinde, Zaman sekmesini tıklatın. "5 dakika" için Aralığı ayarlayın. 20 saat için süre ayarlayın. Döngüler alanı otomatik olarak progra tekrar sayısı için hesaplanırm gerçekleştirir.
    3. "Lambda" sekmesini seçin. Ilk kutusunu tıklatın ve menü aşağı sonraki açılan Faz kontrast için uygun lambda yapılandırma seçin. Görüntülü her floresan protein için uygun konfigürasyonları seçerek, sonraki pozisyonlar için tekrarlayın.
    4. Bir görüş tek bir büyük alana birleştirilmek üzere birden fazla görüntü parametrelerini belirleyen "Büyük Resim" sekmesini seçin. İyi bir büyüklükte alan 7% dikiş üst üste kullanarak 5 x 2 görüntü oluşur. Bu görüntü elde etme sıklığını etkilemeden yansıması için pozisyon başına hücre sayısı için izin verir. Ayrıca, "Sahne hareketi sırasında Kapat Active Shutter" için onay kutusunu kaldırın. Bu seçenek görüntüler arasında kepenkleri kapatarak değil tarafından satın hızını artırır.
    5. , "XY Pozisyonlar" sekmesini seçin sırayla gecede filmin sırasında paralel olarak yansıması olacaktır birden fazla pozisyon belirlemek için. Merkezi po tanımlamak pozisyonları seçinher büyük resim aralıkları için int. Örnek 6-8 görüntü pozisyonları seçin. İyi bir görüntü alanı açıkça tanımlanmış akson yakın apozisyon hücrelerin küçük kümeler olacak. Hücreler en aza indirilmelidir birbirleriyle ve akson donatılacak üstüne yığılmış olmamalıdır. Odak noktası hücrenin çekirdeğini oluşturur. , Açık bir şekilde tanımlanmış çekirdek zarı hücrelerin çoğunluğu için görülür ki bu amaç yerleştirin.
    6. "Z-serisi" sekmesi seçili olduğundan emin olun.
    7. Yukarıda Bölüm 2.6.5 açıklandığı gibi otomatik kaydetme özelliği yapılandırın.
    8. "1 kez döngü" tıklayarak pozlama ve pozisyon ayarları test edin. Iletilen ışık aydınlatma, odak ve çerçeveleme için çıkan görüntüler değerlendirin. Yoğunlaştırdığını ise, XY sekmesi altında her pozisyon için odak sıfırlayın. 10 dakika bekleyin ve odak istikrarlı kadar bu adımı tekrarlayın.
    9. Tüm ayarları doğrulanmış ve test edildikten sonra, "Şimdi Çalıştır" butonuna tıklayarak otomatik deneme başlatmak.

Bölüm 4 - Görüntü İşleme ve İhracat

Data Export

  1. Taşıma veya yaymak olayların canlı hücre görüntüleme sırasında elde edilen veri setleri sunumlar ve yayınlar (Ek Film 3) daha sonra kullanmak için sık kullanılan dosya türlerini içine NIS Elements yazılımı ihraç edilmelidir. NIS Elements film uygun ham. ND2 dosyasını açın ihracat ve istenen floresan kanalları görselleştirmek için "bölünmüş bileşeni" görünümü seçin. Oynatma uygun bir hızda dosya; saniyede 5 kare hızlı ulaşım görselleştirme için iyi bir başlangıç ​​noktasıdır.
  2. Film oynatma sırasında gerçek zamanlı saat temsil etmek için bir zaman damgası ekleyin. Resmin üzerine sağ tıklayın ve, ND-bilgiler kat. Dijital sayaç sol üst köşesinde görünür.
    1. Bilgileri görüntülemek için zaman damgası düzenleyin. Sağ tezgahın üzerine tıklayın ve Edit ND-bilgileri seçin. Sonraki açılan pencerede, Hü yansıtmak için metni düzenlemekönemlidir ng parametreleri. Netlik için düzenleme yazı tipi, renk ve boyut.
  3. "Düzenle" menüsüne gidin ve "görünümü anlık oluşturma" ya da "x" tuşuna basın bulabilirsiniz. Bu komut "görünümü anlık" penceresi açılır. Seçin bir 8-bit, RGB, tüm filmden floresan kanalları içeren ihracata hazır dosyası oluşturmak için "Tüm çerçeveler için geçerlidir".
  4. Çapraz platform uyumluluğu için bir. Avi dosyası olarak kaydedin. Kare başına 200 msn de oynatma hızını ayarlayın. NIS Elemanları tarafından oluşturulan. Avi dosyaları sonra daha fazla istediğiniz dosya türünü içine diğer dönüştürme yazılımı ile sıkıştırılmış olabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Anterograd Taşıma

PRV 348 ile ayrışmış SCG kültürlerin enfeksiyonlara Bu protokolün uygulama, GFP-US9 ve gM-mCherry membran füzyon proteinleri ifade eden bir rekombinant PRV gerginlik, virionlar anterograd taşıma (Şekil 3 ve Ek Film 4) ve görselleştirme kolaylaştırmıştır. Puncta taşıma kendi algılama viral parçacıkların sonuçları ve söz konusu görüntüleme koşulları bu füzyon proteinlerin Ortaklığın filtre geçiş sırasında hareket eden bir parçacık her fluorofor ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu gözlem eylemi ile önemli değişiklik olmadan ortaya gibi canlı hücre görüntüleme amacı biyolojik süreçleri izlemektedir. Çevre kontrolü, görüntüleme hızı ve floresan aydınlatma: Bu amaç, üç değişken optimize ederek elde edilir. Bu arası bağımlı değişkenler uygun görüntüleme koşulları elde etmek için dengeli olmalıdır. Sunulan protokol temsili sonuçlar üretmek için özel koşullar kullanmaktadır. Biz kısaca sunulan özel yöntemler ayrıntılarına geçmeden önce çevresel kontroller ve gözlemsel zarar tartışacağız.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

LWE ve RK Sağlık hibe R37 NS033506-16 ve R01 NS060699-03, ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmektedir. MPT bir Amerikan Kanser Derneği Doktora Sonrası Araştırma Bursu (PF-10-057-01-MPC) tarafından desteklenmiştir. Dr Matthew Lyman ve Dr Oren Kobiler bir tavsiye ve bilgi mikroskop yapılandırma ve canlı hücre görüntüleme yöntemleri tasarımında etkili olmuştur. Ayrıca mikroskop satın alma, kurulum ve performans teknik yardım için Neal Barlow ve Nikon Araçların Brian T. Kain için teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
35 mm cam tabanlı kültür çanağıMatTek Corporation; Ashland, MAP35G-1.5-20-C
35 mm μ-Çanak Ibidi USA LLC, Verona, WI81156
Mikroskop gövdesi Nikon Instruments Inc.Nikon Eclipse Ti
Motorlu mikroskop XY aşamasıÖnceki Bilimsel; Rockland, MAH117 ProScan Düz Üst
Motorlu filtre tekerlekleriÖnceki BilimselHF110 10 konumlu filtre tekerleği
Floresan aydınlatma kaynağı Lümen Dinamiği; Mississauga, Ontario, KanadaX-Cite 120Q
Çok Bantlı Floresan filtre setleri, Chroma Technology Corp.; Körük Şelalesi, VT89000 Sedat Quad - ET 89006 ECFP/EYFP/mCherry - ET
EM-CCD kameraAndor Technology USA; Güney Windsor, CTiXon3 897
Chamlide sahne üstü çevresel inkübatörCanlı Hücre Aletleri; Seul, Güney KoreTC-L-10
Objektif lens ısıtıcısıBioptecs; Butler, PA150803 Kontrol Cihazı 150819-12-08 Isıtıcı
Analiz yazılımıNikon Instruments Inc.; Melville, NYNIS Elemanları
,

Kaynaklar

  1. Johnson, D. C., Baines, J. D. Herpesviruses remodel host membranes for virus egress. Nature reviews. Microbiology. 9 (5), 382-394 (2011).
  2. Mettenleiter, T. C., Klupp, B. G., Granzow, H. Herpesvirus assembly: a tale of two membranes. Current Opinion in Microbiology. 9 (4), 423-429 (2006).
  3. Saksena, M. M., Wakisaka, H., et al. Herpes simplex virus type 1 accumulation, envelopment, and exit in growth cones and varicosities in mid-distal regions of axons. Journal of Virology. 80 (7), 3592-3606 (2006).
  4. Snyder, A., Wisner, T. W., Johnson, D. C. Herpes Simplex Virus Capsids Are Transported in Neuronal Axons without an Envelope Containing the Viral Glycoproteins. Journal of Virology. 80 (22), 11165-11177 (2006).
  5. Snyder, A., Polcicova, K., Johnson, D. C. Herpes simplex virus gE/gI and US9 proteins promote transport of both capsids and virion glycoproteins in neuronal axons. Journal of Virology. 82 (21), 10613-10624 (2008).
  6. Tomishima, M. J. A conserved alpha-herpesvirus protein necessary for axonal localization of viral membrane proteins. The Journal of Cell Biology. 154 (4), 741-752 (2001).
  7. Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. G. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nature Methods. 9 (2), 152-158 (2012).
  8. Kratchmarov, R., Taylor, M. P., Enquist, L. W. Making the case: Married versus Separate models of alphaherpes virus anterograde transport in axons. Reviews in Medical Virology. 22 (6), 378-391 (2012).
  9. Antinone, S. E., Smith, G. A. Two modes of herpesvirus trafficking in neurons: membrane acquisition directs motion. Journal of Virology. 80 (22), 11235-11240 (2006).
  10. Del Rio, T., Ch'ng, T. H., Flood, E. A., Gross, S. P., Enquist, L. W. Heterogeneity of a fluorescent tegument component in single pseudorabies virus virions and enveloped axonal assemblies. Journal of Virology. 79 (7), 3903-3919 (2005).
  11. Taylor, M. P., Kramer, T., Lyman, M. G., Kratchmarov, R., Enquist, L. W. Visualization of an alphaherpesvirus membrane protein that is essential for anterograde axonal spread of infection in neurons. mBio. 3 (2), (2012).
  12. Taylor, M. P., Kobiler, O. Alphaherpesvirus axon-to-cell spread involves limited virion transmission. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2012).
  13. Kobiler, O., Brodersen, P., Taylor, M. P., Ludmir, E. B., Enquist, L. W. Herpesvirus replication compartments originate with single incoming viral genomes. mBio. 2 (6), (2011).
  14. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
  15. Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide. Trends in Cell Biology. 19 (11), 649-655 (2009).
  16. Ch'ng, T. H., Flood, E. A., Enquist, L. W. Culturing primary and transformed neuronal cells for studying pseudorabies virus infection. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). , 292-299 (2005).
  17. Curanovic, D., Ch'ng, T. H., Szpara, M., Enquist, L. Compartmented neuron cultures for directional infection by alpha herpesviruses. Current protocols in cell biology. Chapter 26 (Unit 26.4), (2009).
  18. Zareen, N., Greene, L. A. Protocol for culturing sympathetic neurons from rat superior cervical ganglia (SCG). J. Vis. Exp. (23), e988(2009).
  19. Ch'ng, T. H., Enquist, L. W. Neuron-to-Cell Spread of Pseudorabies Virus in a Compartmented Neuronal Culture System. Journal of Virology. 79 (17), 10875-10889 (2005).
  20. Campenot, R. B., Lund, K., Mok, S. -A. Production of compartmented cultures of rat sympathetic neurons. Nature Protocols. 4 (12), 1869-1887 (2009).
  21. Kramer, T., Greco, T. M., Taylor, M. P., Ambrosini, A. E., Cristea, I. M., Enquist, L. W. Kinesin-3 Mediates Axonal Sorting and Directional Transport of Alphaherpesvirus Particles in Neurons. Cell Host & Microbe. 12 (6), 806-814 (2012).
  22. Smith, G. A., Gross, S. P., Enquist, L. W. Herpesviruses use bidirectional fast-axonal transport to spread in sensory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (6), 3466(2001).
  23. Kramer, T., Enquist, L. W. Alphaherpesvirus Infection Disrupts Mitochondrial Transport in Neurons. Cell Host & Microbe. 11 (5), 504-514 (2012).
  24. Swedlow, J. R., Platani, M. Live cell imaging using wide-field microscopy and deconvolution. Cell Structure and Function. 27 (5), 335-341 (2002).
  25. Kaech, S., Huang, C. F., Banker, G. Short-Term High-Resolution Imaging of Developing Hippocampal Neurons in Culture. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (3), (2012).
  26. Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. Live-cell microscopy - tips and tools. Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Alfaherpes Virüs TransportuFloresan Protein FüzyonlarıNöronal KültürlerArdışık EdinmeÇok Konumlu GörüntülemeNIS Elements YazılımıSahne Üstü İnkübatörViral Partikül Takibi
Alphaherpes Virüs İleriye Taşıma ve Değişken Canlı Hücre Görüntüleme
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.