Yöntem makalesi

Memeli Hücreleri ile Derneği'nin Bakterilerin Canlılık belirlenmesi için Floresan Mikroskopi Yöntemleri

DOI:

10.3791/50729

⸱

5 Eylül 2013

 , 
1Department of Microbiology, Immunology, and Cancer Biology, University of Virginia Health Sciences Center

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bakteriyel patojenez alanı merkezinde mikroplar ökaryotik hücrelere maruz kaldıktan sonra hayatta nasıl olursa ve tanımlamak için yeteneğidir. Bu makalede, iç ve konakçı hücreler ile ilgili ayrı ayrı bakterilerin canlılığı ortaya floresan boyaların kullanımı için protokolleri özetlenmektedir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bakteriyel patojenez alanı merkezinde mikroplar ökaryotik hücrelere maruz kaldıktan sonra hayatta nasıl olursa ve tanımlamak için yeteneğidir. Bu soruları için geçerli protokollerin koloni sayımı tahlilleri, gentamisin koruma tahlilleri ve elektron mikroskobu. Koloni sayısı ve gentamisin koruma analizleri, yalnızca tüm bakteri nüfusunun canlılığını değerlendirmek ve bireysel bakteri canlılığını belirlemek mümkün değildir. Elektron mikroskobu ayrı ayrı bakterilerin yaşayabilirliği belirlemek ve ev sahibi hücrelerde lokalizasyon ile ilgili bilgi sağlamak için de kullanılabilir. Bununla birlikte, bakteriler sık ​​sık canlılığının değerlendirilmesi zor hale elektron yoğunluklarının bir aralığını gösterir. Bu makalede, iç ve konakçı hücreler ile ilgili ayrı ayrı bakterilerin canlılığı ortaya floresan boyaların kullanımı için protokolleri özetlenmektedir. Bu deneyler birincil insan nötrofillerinde Neisseria gonorrhoeae hayatta kalmasını değerlendirmek için ilk olarak geliştirilmiş, ancak bir olmalıbir bakteri konakçı hücre etkileşimine pplicable. Bu protokoller, zar geçirgen floresan boyalar birleştirmek için erişilebilir membran geçirmeyen floresan boyalar (propidyum iyodür ve SYTOX Green) ile, tüm bakterileri leke (SYTO9 ve 4 ',6-diamidino-2-fenilindol [DAPI]) cansız bakteri. Önceki ökaryotik hücre nüfuziyet için, bir antikor ya da tepkin madde flüoresan hücre dışı bakteri belirlemek için ilave edilmektedir. Bu nedenle, bu deneyler, ökaryotik hücrelere ve iç yapışık bakteri canlılığı ayırt edebilir. Bir protokol, aynı zamanda ayrı ayrı bakterilerin hücre içi lokalizasyonu belirlemek amacıyla, ökaryotik hücre işaretleyicileri için floresan antikorlar ile kombinasyon halinde canlılığı boyalar kullanılarak sağlanır. Bu makalede açıklanan bakteriyel canlılığı boyalar ayrı ayrı bakterilerin canlılığı değerlendirmek ve bakteri konakçı hücre hayatta burada ile ilgili bilgi sağlamak için, geleneksel teknikler mikrobiyoloji için hassas bir tamamlayıcı ve / veya alternatifs.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dinamik bir etkileşim ve ikamet ettikleri bakteri ve bilgisayarlar arasında işbirliği evrim vardır. Bakteriler bağlılık organellere, salgı sistemleri ve / veya konak fagositik ve fagositik olmayan hücrelerin kendi üretken enfeksiyon etkinleştirmek toksin üretme yeteneği gelişmiştir. Bakteriler de tanıma ve konakçı bağışıklık sisteminin antimikrobiyal aktiviteleri ile uğraşmak gerekir. Ev sahibi, bağışıklık sistemi, fiziksel ve kimyasal engeller, bağışıklık hücreleri, tamamlayıcı sistemin, ve humoral bağışıklık diğer bileşenleri de dahil olmak üzere doğal ve adaptif bileşenden oluşur. Birçok bakteri tabakalı konak immün tepkisi ile öldürülmesi ve temizlik duyarlı olsa....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1.. Propidium iyodür ve SYTO9 ile Bakteriyel Canlılık Değerlendirilmesi

  1. Ilgi bakteri ile 24 yuvalı plakalar içinde 12 mm çapında yuvarlak cam lameller yapışık olan hücreleri, Infect. Aldehid veya organik çözücüler ile hücreleri tamir yapmayın.
  2. Bir kez yavaşça hücreleri yıkayın 0.1 M 3 - (N-morfolino) 1 mM MgCI2 (MOPS / MgCI2) ihtiva eden propanesülfonik asit (MOPS), pH 7.2,.
  3. Dış bakteri tespit etmek için, MOPS / MgCI2 içinde, ilgi konusu bakteriyel türe bağlanan Alexa Fluor 647-bağlı antikor veya lektin, oda sıcaklığında karanlıkta 10 dakika boyunca inkübe hücreleri.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Belirtilen protokoller N. hayatta kalma incelemek için kullanılmıştır gonorrhoeae primer insan maruz kaldıktan sonra 5,26 nötrofil. Nötrofiller N. ile enfekte edildi gonore ve yeşil floresan canlılığı boya SYTO9 ve kırmızı floresan propidiyum iyodür (Şekil 4A) kullanılarak, protokolü 1 ile işlenir. Boyalar tercihen ev sahibi hücre, plazma zarının değil, N. geçirgenliği için kolesterol tecrit saponin varlığında ilave edildi gonorrhoeae memb.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNA, insan hücrelerine ve içine bağlanmış canlı ve ölü bakteri belirlemek için bir flüoresan lektin ile bağlantılı olarak bağlanması ve canlılığı boyalar kullanan iki protokol burada sunulmuştur. Her iki protokol etkili ölü bakteri canlı ayırmak için, kullanımı protokol seçimi denemenin hedefi bağlıdır. Birinci protokol cansız bakteri ve sağlam bakteri tespit etmek için tespit SYTO9 propidiyum iyot kullanmaktadır. Şekil 4A'da gösterilen N bulaşmış insan nötrofillerinden uygulanan protokol 1.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz yazının eleştirel okuma için Asya Smirnov ve Laura Gonyar teşekkür ederim. Bu çalışma AKCMBJ hibe NIH R00 ve R01 TW008042 AI097312 NIH T32 AI007046 tarafından kısmen desteklenen tarafından desteklenmiştir.

....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Kan alma için 21 G 3/4 kelebek iğneBecton Dickinson367251 
Sodyum Heparinli Kan Alma Tüpleri 10 mlBecton Dickinson366480 
Sulama için steril suBaxter07-09-64-070 
Dekstran 500Sigma31392 
Sodyum KlorürFisher ScientificS641 
DekstrozRicca Kimya ŞirketiRDCD0200 
Dulbecco'nun PBS no Ca2 + < / sup> veya Mg2 + < / sup>Thermo ScientificSH3002802 
Ficoll çözümüGE Sağlık17-1440-03 
Asetik AsitFisher ScientificBP2401 
12 mm dairesel cam lamellerFisher Scientific12-545-80 12CIR-1 
24 kuyulu plakalarCorning Incorporated3524 
Havuzlanmış İnsanSerumu SigmaS7023 
RPMIMediatech15-040-CV&nbsp;
Fetal SığırSerumu Thermo ScientificSH3007103 
İnsan interlökin-8Ar-Ge D Sistemleri208-IL/CF 
MOPSSigmaM3183ve nbsp;
MgCl2Fisher ScientificBP214 
Propidyum İyodürYaşam TeknolojileriL7007 veya L7012 
SYTO9Yaşam TeknolojileriL7007 veya L7012 
SaponinFluka Analitik47036 
Alexa Fluor 647-bağlı soya lektiniYaşam TeknolojileriL-32463& nbsp;
DAPISigmaD8417 
SYTOX YeşilYaşam TeknolojileriS7020 
Fare anti-CD63Gelişimsel Çalışmalar Hibridoma BankasıH5C6 
Alexa Fluor 555 Antikor Etiketleme KitiYaşam TeknolojileriA20187 
Hemasitometre Parlak ÇizgiHausser Scientific1492 
ForsepsEMS78320 
Sorvall Legend RT + SantrifüjTermo Bilimsel75004377 

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Woolard, M. D., Frelinger, J. A. Outsmarting the host: bacteria modulating the immune response. Immunol. Res. 41, 188-202 (2008).
  2. Johnson, M. B., Criss, A. K. Resistance of Neisseria gonorrhoeae to neutrophils. Front Microbiol. 2, 77(2011).
  3. Simons, M. P., Nausee....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Fluorescence MicroscopyBacterial ViabilityHost Cell AssociationMembrane PermeabilityPropidium IodideSYTO9 DyeSubcellular LocalizationExtracellular BacteriaIntracellular BacteriaViability Dyes

İlgili makaleler