Method Article

Memeli Hücreleri ile Derneği'nin Bakterilerin Canlılık belirlenmesi için Floresan Mikroskopi Yöntemleri

DOI:

10.3791/50729

⸱

September 5th, 2013

 , 
1Department of Microbiology, Immunology, and Cancer Biology, University of Virginia Health Sciences Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bakteriyel patojenez alanı merkezinde mikroplar ökaryotik hücrelere maruz kaldıktan sonra hayatta nasıl olursa ve tanımlamak için yeteneğidir. Bu makalede, iç ve konakçı hücreler ile ilgili ayrı ayrı bakterilerin canlılığı ortaya floresan boyaların kullanımı için protokolleri özetlenmektedir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bakteriyel patojenez alanı merkezinde mikroplar ökaryotik hücrelere maruz kaldıktan sonra hayatta nasıl olursa ve tanımlamak için yeteneğidir. Bu soruları için geçerli protokollerin koloni sayımı tahlilleri, gentamisin koruma tahlilleri ve elektron mikroskobu. Koloni sayısı ve gentamisin koruma analizleri, yalnızca tüm bakteri nüfusunun canlılığını değerlendirmek ve bireysel bakteri canlılığını belirlemek mümkün değildir. Elektron mikroskobu ayrı ayrı bakterilerin yaşayabilirliği belirlemek ve ev sahibi hücrelerde lokalizasyon ile ilgili bilgi sağlamak için de kullanılabilir. Bununla birlikte, bakteriler sık ​​sık canlılığının değerlendirilmesi zor hale elektron yoğunluklarının bir aralığını gösterir. Bu makalede, iç ve konakçı hücreler ile ilgili ayrı ayrı bakterilerin canlılığı ortaya floresan boyaların kullanımı için protokolleri özetlenmektedir. Bu deneyler birincil insan nötrofillerinde Neisseria gonorrhoeae hayatta kalmasını değerlendirmek için ilk olarak geliştirilmiş, ancak bir olmalıbir bakteri konakçı hücre etkileşimine pplicable. Bu protokoller, zar geçirgen floresan boyalar birleştirmek için erişilebilir membran geçirmeyen floresan boyalar (propidyum iyodür ve SYTOX Green) ile, tüm bakterileri leke (SYTO9 ve 4 ',6-diamidino-2-fenilindol [DAPI]) cansız bakteri. Önceki ökaryotik hücre nüfuziyet için, bir antikor ya da tepkin madde flüoresan hücre dışı bakteri belirlemek için ilave edilmektedir. Bu nedenle, bu deneyler, ökaryotik hücrelere ve iç yapışık bakteri canlılığı ayırt edebilir. Bir protokol, aynı zamanda ayrı ayrı bakterilerin hücre içi lokalizasyonu belirlemek amacıyla, ökaryotik hücre işaretleyicileri için floresan antikorlar ile kombinasyon halinde canlılığı boyalar kullanılarak sağlanır. Bu makalede açıklanan bakteriyel canlılığı boyalar ayrı ayrı bakterilerin canlılığı değerlendirmek ve bakteri konakçı hücre hayatta burada ile ilgili bilgi sağlamak için, geleneksel teknikler mikrobiyoloji için hassas bir tamamlayıcı ve / veya alternatifs.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dinamik bir etkileşim ve ikamet ettikleri bakteri ve bilgisayarlar arasında işbirliği evrim vardır. Bakteriler bağlılık organellere, salgı sistemleri ve / veya konak fagositik ve fagositik olmayan hücrelerin kendi üretken enfeksiyon etkinleştirmek toksin üretme yeteneği gelişmiştir. Bakteriler de tanıma ve konakçı bağışıklık sisteminin antimikrobiyal aktiviteleri ile uğraşmak gerekir. Ev sahibi, bağışıklık sistemi, fiziksel ve kimyasal engeller, bağışıklık hücreleri, tamamlayıcı sistemin, ve humoral bağışıklık diğer bileşenleri de dahil olmak üzere doğal ve adaptif bileşenden oluşur. Birçok bakteri tabakalı konak immün tepkisi ile öldürülmesi ve temizlik duyarlı olsa da, bazı patojenik ve fırsatçı bakterilerin konakçı hücrelerin çeşitli enfekte ve konak immün cevabı 1 ile açıklık bozmak için mekanizmalar geliştirmişlerdir. Neisseria gonorrhoeae bakteriyel patojen bir örneğidir Bu son derece insan konak. Yok inat uyarlanmıştır. gonorrhoeae kolayca ürogenital sistem, yutak, konjonktiva ve rektum mukoza epitelyal hücrelerin luminal yüzeyleri kolonize. Kolonizasyon mukozal sitelerde nötrofillerin bol işe tetikler. Nötrofiller mikroorganizmaları öldürmek için antimikrobiyal süreçlerin çeşitli sahip profesyonel fagositlerdir, ancak, N. gonorrhoeae nötrofillerin 2-5 mevcudiyetinde hayatta kalma yeteneğine sahiptir. Böyle N. nasıl gibi bakteriyel patojenler Anlamak gonorrhoeae, yıkmak bastırmak ve sonuçta normalde düşman konak ortamlarda hayatta kalmak için bağışıklık tepkisini kaçırmak bulaşıcı hastalıklarla mücadele için yeni tedavilerin geliştirilmesi için çok önemlidir.

Genellikle konakçı hücreler bakteriyel hayatta araştırmak için kullanılan deneysel protokol koloni sayısı deneyleri, gentamisin koruma tahlilleri ve elektron mikroskobu. Koloni sayısı deneylerinde, enfekte olmuş hücrelerin bir popülasyonu wh bir deterjan ile, örneğin, (parçalananaich bakteriler bakteri serbest bırakmak için) dirençlidir. Lizatlar seyreltildi ve agar bazlı ortam üzerine plakalanmıştır ve lizatlardaki koloni oluşturucu birim, her bir zaman noktasında ve / veya deney koşulu için numaralandırılır edilir. Bu yaklaşım, tüm bakteri nüfusunun canlılığı bildirir ancak hücre içi ve hücre dışı yaşam arasında ayırım yeteneğine sahip değildir. Koloni sayımı tahlili, gentamisin koruma deneyinde, bir varyasyonu özellikle ökaryotik plazma zarı 6 geçmeye antibiyotik gentamisin yetersizlik dayalı hücre içi bakteri hayatta, ölçer. Bununla birlikte, bu deney, gentamisin (ya da benzer bir ökaryotik membran geçirgen olmayan başka bir antibiyotik) ile iç bakterilere erişmek için antibiyotiğin yetersizlik ile öldürmeye karşı hassas olan bakteri bağlıdır. Bu nedenle, bir gentamisin koruma deneyi, tüm bakteri türlerinin incelenmesi için etkili ya da başka yüksek bakteriyel hayatta incelerkennötrofiller gibi pinocytic hücreleri. (Bakteri agrega ya da farklı bireysel bakteriyel hücrelerden davranır mikrokoloniler formu ise gibi) bu yaklaşımların hiçbiri hücre içi lokalizasyonu ya da ayrı ayrı bakterilerin diğer davranışları ortaya koymaktadır. Tek tek dış ve iç bakteri canlılığı incelemek için sıkça kullanılan bir başka yaklaşım, ince kesitli transmisyon elektron mikroskobu (TEM) 'dir. Bu yaklaşım daha fazla hücre içi işaretleri karşı altın bağlanmış antikorları ile immunoelectron mikroskobu ile incelenmiştir edilebilir konakçı hücrelerde bakterilerin yere (örneğin, fagosom, sitoplazma, autophagosome), ilgili bilgi sağlayabilir avantajlıdır. Bununla beraber, elektron mikroskobu bakteri uygunluğu değerlendirmek özellikle duyarlı değildir. Gömülü bölümler uranil asetat, kurşun sitrat veya diğer elektron yoğun reaktifleri ile boyanmış ve elektron mikroskopi ile görüntülenmiştir zaman, elektron-yoğun bakteri uygun ve elektrik olarak kabul edilirtron-Lucent cansız 7,8. Ancak, bu varsayım ciddi biçimde kesintiye membranların ve sitoplazma yoksun olan sadece bu ölü bakteri beri elektron-Lucent görünür, bakteri canlılığı overestimates. Ayrıca, bazı bakteri türlerinin zor canlılığını belirlemek için yapım büyüme aşamasına bağlı olarak, kendi elektron yoğunluklarının bir aralığını görüntüleyebilir.

Alternatif bir ya da bu yaygın olarak kullanılan yöntemlere ilave olarak olduğu gibi, burada eklenmiş ve konak hücreleri ile içeride bakterilerin hayatta kalmasını değerlendirmek için bakteriyel canlılığı göstermektedir floresan boyaların kullanımı için protokoller ve mantığını sağlar. Hücre dışı bakteriler belirlemek için, enfekte olmuş hücreler, ilk olarak bir lektin ya da bakteri özgü antikor gibi bir flüoresan tepkime maddesi, maruz kalmaktadır. Enfekte edilen hücreler daha sonra geçirgen ve bakteriyel canlılığı için bir vekil olarak, bozulmuş membran vs bozulmamış bakterilere farklı olarak erişilebilir DNA özgü boyalar maruz kalmaktadır. İlk olarak ppropidium iyodür membranlar tehlikeye ve böylece cansız kabul edilen bu bakterilerin sadece erişilebilir ise otokol, membran geçirgen boya SYTO9, toplam bakteri nüfusu tanımlar. Propidium iyodür ve SYTO9, Biyofilmlererde bakteri canlılığı değerlendirmek patojenik bakterilerin patojenik ayrımcılık ve uygulanabilir su-kaynaklı bakteri 9-12 numaralandırmak için kullanılır olmuştur. SYTOX Green cansız nüfusa erişilebilir iken, ikinci protokolde, 4 ', 6'-diamidino-2-fenilindol (DAPI), toplam bakteri tanımlar. Bu canlılığı boya çifti bakteriyel hücre içi lokalizasyonu tanımlamak Örneğin, ilgi konusu bir protein ile ilgili olarak her bir bakterinin yerini belirlemek için bağışıklık ile kombine edilebilir. Bu tahlillerin kullanılması konak hücrelerin enfeksiyonu esnasında bakteri öldürme veya hayatta kalması ile sonuçlanabilir etkileşimler içine önemli bilgiler sağlar. Bu makalede anlatılan protokoller canlılığı ve değerlendirmek için kullanılmıştırNötrofil phagosomes 5,13,14 farklı toplumlarda da dahil olmak üzere temel insan nötrofil, ve içine bağlanmış olup, N. gonorrhoeae. Bununla birlikte, bu protokoller profesyonel fagositlerin, non-profesyonel fagositlerin ve protozoa 15-24 gram-pozitif ve gram-negatif bakterilerin uygulanabilirliğini değerlendirmek için uygulanabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1.. Propidium iyodür ve SYTO9 ile Bakteriyel Canlılık Değerlendirilmesi

  1. Ilgi bakteri ile 24 yuvalı plakalar içinde 12 mm çapında yuvarlak cam lameller yapışık olan hücreleri, Infect. Aldehid veya organik çözücüler ile hücreleri tamir yapmayın.
  2. Bir kez yavaşça hücreleri yıkayın 0.1 M 3 - (N-morfolino) 1 mM MgCI2 (MOPS / MgCI2) ihtiva eden propanesülfonik asit (MOPS), pH 7.2,.
  3. Dış bakteri tespit etmek için, MOPS / MgCI2 içinde, ilgi konusu bakteriyel türe bağlanan Alexa Fluor 647-bağlı antikor veya lektin, oda sıcaklığında karanlıkta 10 dakika boyunca inkübe hücreleri.

NOT: Davranış ilgilenilen lektin veya antikor (Şekil 1) bağımsız olarak canlılığı tüm bakteri bağlar olduğunu göstermek için, konakçı hücrelerin yokluğunda, canlı ve ölü bakteri ile kontrol eder.

  1. MOPS / MgCl2 ile hücreler iki kez durulayın.
  2. Aspire mhücrelerden edia ve 0.5 ml / Canlı Ölü Boyama Çözüm ekleyin. Canlı / Ölü boyama solüsyonu MOPS / MgCI2 içinde 5 uM SYTO9, 30 uM propidyum iyodür ve% 0.1 saponin, (nihai konsantrasyonlar) 'dir.
  3. Karanlıkta, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe hücreleri.
  4. MOPS / MgCl2 içinde hücreler iki kez durulayın.
  5. Invert lamelleri cam slaytlar üzerine aşağı yüz ve şeffaf tırnak cilası ile mühür. Montaj ortamları kullanmayın.
  6. Yeşil, kırmızı, ve uzak-kırmızı görüntü alımı ile uyumlu filtre setleri ile bir floresan mikroskop kullanılarak, 30 dakika içinde görüntü kazanır.

NOT: Geleneksel floresan mikroskobu ve konfokal lazer tarama mikroskobu kullanılmaktadır olabilir de. 30 dakika sonra, floresan boyalar bakterilerden sızıntı başlar ve edinilen veriler artık doğru. Bu makalede gösterilen Görüntüler openlabın yazılımını kullanarak Hamamatsu Orca-ER dijital kamera ile Nikon Eclipse E800 dik floresan mikroskop elde edildi. 650 nm ve 663 arasında bir emisyon filtresi - - Alexa Fluor 647 floresansı 590 uyarma dalga boyuna sahip bir filtre kullanılarak saptandı 735 nm ve yanlış renkli mavidir. 580 nm ve 600 arasında bir emisyon filtresi - - 660 nm propidyum iyodür den Floresan 540 uyarma dalga boyuna sahip bir filtre kullanılarak tespit edildi. 495 nm ve 515 arasında bir emisyon filtresi - - 555 nm SYTO9 gelen floresans 465 uyarma dalga boyuna sahip bir filtre kullanılarak tespit edildi.

  1. Bu protokol harici cansız bakteri kırmızı + mavi görünür görüntüleri neden olur, iç cansız bakteri yalnızca kırmızı görünür, dış canlı bakteri yeşil + mavi görünür, ve iç canlı bakteriler sadece yeşil görünür. Gözle dış cansız iç cansız, uygun bir dış ve iç canlı bakteri sayısını saymak.
  2. Dış bakteri sayısının (harici canlı bakteri sayısının bölünmesiyle dış canlı bakteri yüzde hesaplama uygun artı nonvimümkün). İç bakteri sayısının (canlı artı cansız) (Şekil 4) iç tarafından canlı bakteri sayısının bölünmesiyle iç canlı bakterilerin yüzde hesaplayın.
  3. Bu protokol ile gerçekleştirmek için iki temel kontroller vardır. Öncelikle, tüm cansız bakteri propidium iyodür-pozitif ve tüm canlı bakteri SYTO9-pozitif olduğunu doğrulamak. (Herhangi bir konakçı hücrelerin yokluğunda) bakterilerin bir orta-logaritmik kültür>% 95 SYTO9 pozitif olmalıdır. N. bir orta-logaritmik bir kültür Şekil 2'de gösterilen, gonorrhoeae Canlı / Ölü boyama solüsyonu ile inkübe (10 8 koloni oluşturan birim başına ml). İkincisi, propidium iyodür ve SYTO9 hem geçirgenleştirilmiştir, enfekte konakçı hücrelerini girebilirsiniz doğrular.
    1. Ölü bakteri popülasyonu üretmek için, bir 1.5 ml mikrofüj tüpüne oluşturan üniteler 2 x 10 8 bakteri kolonisi toplamak,% 70 izopropanol ekleyin ve 10 dakika boyunca otur. Bir mikrofüj A'daki bakteri Peletnd kalıntı izopropanol çıkarmak için PBS içinde iki kere bakteriler yıkayın. 1.7 - Sonra takip protokolü 1.5 adımları. Bir cam slayt bakteri süspansiyonu 5 ul ilave edin ve bir lamel ile kaplama. Protokolün adım 1.9 olarak görüntü örnekleri. Bu koşullar altında, nüfusun% 100 propidyum iyodür pozitif (Şekil 2) az olmalıdır. Bazı bakteri türlerinde, propidium iyodür tamamen SYTO9 boyanma mahçup olabilir ve cansız bakteri sarı veya turuncu görünebilir.
    2. Nötrofiller gibi fagositik hücreler için, izopropanol ile öldürülmüş bakterilerin hücreleri ortaya çıkarmak ve hücre içi bakterilerin% 100 propidyum iyodür pozitif (Şekil 3) olduğundan emin olun. Ölü bakteriler özümsemesi olmayabilir nonphagocytic hücreler için, sodyum azit ya da önceden canlı / ölü boyama çözeltisi ilave diğer hücre geçirgenlik antimikrobiyal maddeler ile enfekte hücreleri tedavi etmek için yeterli olabilir.

2. SYTOX Gree ile değerlendirilmesi Bakteriyel Canlılıkn ve DAPI

  1. Etiket karanlıkta, oda sıcaklığında 20 dakika boyunca Morse tanımlandı Orta 25, 10 ug / ml DAPI ile çıkar bakterileri.
  2. DAPI-etiketli bakteriler, 24 yuvalı plakalar içinde 12 mm çapında yuvarlak cam lameller yapışık olan hücreleri, Infect. Aldehid veya organik çözücüler ile hücreleri tamir yapmayın.
  3. MOPS / MgCl2 ile bir kez hücreleri durulayın.
  4. Dış bakteri tespit etmek için, MOPS / MgCI2 içinde, ilgi konusu bakteriyel türe bağlanan Alexa Fluor 647-bağlı antikor veya lektin ile karanlıkta, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe hücreleri. Önerilen kontroller için protokol adım 1.3 nota bakınız.
  5. Aspire hücrelerden medya ve MOPS / MgCl2 0.5 ml 0.4 iM SYTOX Yeşil ekleyin.
  6. Karanlıkta, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe hücreleri.
  7. MOPS / MgCl2 içinde hücreler iki kez durulayın.
  8. 5 dakika boyunca MOPS / MgCI2 hücreler bir kez yıkayın.
  9. Bir floresan mikroskop ile 30 dakika içinde görüntüler elde. Mikroskop, dijital kamera, ve toplama yazılımı açıklaması için protokol adımı 1.9 bakın.

Not: Alexa Fluor 647 floresans 590 uyarma dalga boyuna sahip bir filtre kullanılarak tespit edilmiştir - 650 nm ve 663 arasında bir emisyon filtresi - 735 nm, ve yanlış renkli kırmızı. 495 nm ve 515 arasında bir emisyon filtresi - - 555 nm SYTOX Green Fluorescence 465 uyarma dalga boyuna sahip bir filtre kullanılarak tespit edildi. 375 nm ve 400 nm bariyer filtreden - DAPI gelen floresans 355 uyarma dalga boyuna sahip bir filtre kullanılarak tespit edildi.

  1. Bu protokol harici cansız bakteri yeşil + kırmızı görünür görüntüleri neden olur, iç cansız bakteriler mavi + yeşil görünür, dış canlı bakteri mavi + kırmızı görünür, ve iç canlı bakteriler sadece (Şekil 4) mavi görünür. Protokol ste de tarif edildiği gibi, dış ve iç bakterilerin yüzde ölçmekp 1.11.
  2. Protokolü Adım 1.12 açıklanan kontrol DAPI / SYTOX Green boya kombinasyonu (Şekiller 2 ve 3) ile yapılmalıdır.

3. Hücrealtı yerelleştirme yanı sıra Bakteriyel Canlılık Değerlendirilmesi

  1. Etiket karanlıkta, oda sıcaklığında 20 dakika boyunca Morse tanımlı bir ortam içinde 10 ug / ml DAPI ile çıkar bakterileri.
  2. DAPI-etiketli bakteriler, 24 yuvalı plakalar içinde 12 mm çapında yuvarlak cam lameller yapışık olan hücreleri, Infect. Aldehid veya organik çözücüler ile hücreleri tamir yapmayın.
  3. MOPS / MgCl2 ile bir kez hücreleri durulayın.
  4. Dış bakteri tespit etmek için, MOPS / MgCI2 içinde, ilgi konusu bakteriyel türe bağlanan Alexa Fluor 647-bağlı antikor veya lektin ile karanlıkta, oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Önerilen kontroller için protokol adım 1.3 nota bakınız.
  5. Aspire hücrelerden medya ve hücreler iki ti durulayınMOPS / MgCI2 içinde mes.
  6. % 0.2 saponin içeren MOPS / MgCI2 içinde, 20 dakika boyunca çıkar hücre içi göstergesi karşı Alexa Fluor 555-bağlı antikor ile inkübe hücreleri.
  7. MOPS / MgCl2 içinde hücreler iki kez durulayın.
  8. 5 dakika boyunca MOPS / MgCI2 hücreler bir kez yıkayın.
  9. Aspire hücrelerden medya ve MOPS / MgCl2 0.4 mcM SYTOX Yeşil ekleyin.
  10. Karanlıkta, oda sıcaklığında, hücreler 5 dakika inkübe edin.
  11. MOPS / MgCl2 içinde hücreler iki kez durulayın.
  12. 5 dakika boyunca MOPS / MgCI2 hücreler bir kez yıkayın.
  13. Floresan mikroskop 30 dakika içinde slaytlar görüntü kazanır. Mikroskop, dijital kamera, ve toplama yazılımı açıklaması için protokol adımı 1.9 bakın.

NOT: Alexa Fluor 647 Floresan 590 dalgaboyu bir filtre kullanılarak tespit edildi - 650 nm ve 663 emisyon filtresi - 735 nm, ve sahte renkli mor. Floresan f580 nm ve 600 arasında bir emisyon filtresi - - 660 nm rom Alexa Fluor 555 540 uyarma dalga boyuna sahip bir filtre kullanılarak tespit edildi. 495 nm ve 515 arasında bir emisyon filtresi - - 555 nm SYTOX Green Fluorescence 465 uyarma dalga boyuna sahip bir filtre kullanılarak tespit edildi. 375 nm ve 400 nm bariyer filtreden - DAPI gelen floresans 355 uyarma dalga boyuna sahip bir filtre kullanılarak tespit edildi.

  1. Bu protokol harici cansız bakteri yeşil + mor görünür görüntüleri neden olur, iç cansız bakteriler mavi + yeşil görünür, dış canlı bakteri mavi + mor görünür, iç canlı bakteriler sadece mavi görünür, ve subselüler protein (Şekil 4), kırmızı görünür. Protokolünde tarif edildiği gibi iç ve dış canlı bakteri perecent 1.11 adımları ölçmek.
  2. Protokolü Adım 1.12 açıklanan kontrol DAPI / SYTOX Green boya kombinasyonu (Şekiller 2 ve 3) ile yapılmalıdır.
  3. Içindecanlı ve cansız bakteri sayma ek olarak, ilgi subselüler marker ile ko için pozitif ya da negatif olarak her bakterileri sınıflandırmak.
  4. Canlı bakteri sayısı ile kolokalize canlı bakteri sayısının bölünmesiyle hücre içi göstergesi ile birlikte lokalize canlı bakterilerin yüzde hesaplayın. Cansız bakteri sayısı ile cansız kolokalize bakteri sayısına bölünmesiyle hücre içi göstergesi ile birlikte lokalize cansız bakterilerin yüzde hesaplayın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Belirtilen protokoller N. hayatta kalma incelemek için kullanılmıştır gonorrhoeae primer insan maruz kaldıktan sonra 5,26 nötrofil. Nötrofiller N. ile enfekte edildi gonore ve yeşil floresan canlılığı boya SYTO9 ve kırmızı floresan propidiyum iyodür (Şekil 4A) kullanılarak, protokolü 1 ile işlenir. Boyalar tercihen ev sahibi hücre, plazma zarının değil, N. geçirgenliği için kolesterol tecrit saponin varlığında ilave edildi gonorrhoeae memb...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNA, insan hücrelerine ve içine bağlanmış canlı ve ölü bakteri belirlemek için bir flüoresan lektin ile bağlantılı olarak bağlanması ve canlılığı boyalar kullanan iki protokol burada sunulmuştur. Her iki protokol etkili ölü bakteri canlı ayırmak için, kullanımı protokol seçimi denemenin hedefi bağlıdır. Birinci protokol cansız bakteri ve sağlam bakteri tespit etmek için tespit SYTO9 propidiyum iyot kullanmaktadır. Şekil 4A'da gösterilen N bulaşmış insan nötrofillerinden uygulanan protokol 1...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz yazının eleştirel okuma için Asya Smirnov ve Laura Gonyar teşekkür ederim. Bu çalışma AKCMBJ hibe NIH R00 ve R01 TW008042 AI097312 NIH T32 AI007046 tarafından kısmen desteklenen tarafından desteklenmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Kan alma için 21 G 3/4 kelebek iğneBecton Dickinson367251 
Sodyum Heparinli Kan Alma Tüpleri 10 mlBecton Dickinson366480 
Sulama için steril suBaxter07-09-64-070 
Dekstran 500Sigma31392 
Sodyum KlorürFisher ScientificS641 
DekstrozRicca Kimya ŞirketiRDCD0200 
Dulbecco'nun PBS no Ca2 + < / sup> veya Mg2 + < / sup>Thermo ScientificSH3002802 
Ficoll çözümüGE Sağlık17-1440-03 
Asetik AsitFisher ScientificBP2401 
12 mm dairesel cam lamellerFisher Scientific12-545-80 12CIR-1 
24 kuyulu plakalarCorning Incorporated3524 
Havuzlanmış İnsanSerumu SigmaS7023 
RPMIMediatech15-040-CV&nbsp;
Fetal SığırSerumu Thermo ScientificSH3007103 
İnsan interlökin-8Ar-Ge D Sistemleri208-IL/CF 
MOPSSigmaM3183ve nbsp;
MgCl2Fisher ScientificBP214 
Propidyum İyodürYaşam TeknolojileriL7007 veya L7012 
SYTO9Yaşam TeknolojileriL7007 veya L7012 
SaponinFluka Analitik47036 
Alexa Fluor 647-bağlı soya lektiniYaşam TeknolojileriL-32463& nbsp;
DAPISigmaD8417 
SYTOX YeşilYaşam TeknolojileriS7020 
Fare anti-CD63Gelişimsel Çalışmalar Hibridoma BankasıH5C6 
Alexa Fluor 555 Antikor Etiketleme KitiYaşam TeknolojileriA20187 
Hemasitometre Parlak ÇizgiHausser Scientific1492 
ForsepsEMS78320 
Sorvall Legend RT + SantrifüjTermo Bilimsel75004377 

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Woolard, M. D., Frelinger, J. A. Outsmarting the host: bacteria modulating the immune response. Immunol. Res. 41, 188-202 (2008).
  2. Johnson, M. B., Criss, A. K. Resistance of Neisseria gonorrhoeae to neutrophils. Front Microbiol. 2, 77(2011).
  3. Simons, M. P., Nauseef, W. M., Apicella, M. A. Interactions of Neisseria gonorrhoeae with adherent polymorphonuclear leukocytes. Infect. Immun. 73, 1971-1977 (2005).
  4. Seib, K. L., et al. Investigation of oxidative stress defenses of Neisseria gonorrhoeae by using a human polymorphonuclear leukocyte survival assay. Infect. Immun. 73, 5269-5272 (2005).
  5. Criss, A. K., Katz, B. Z., Seifert, H. S. Resistance of Neisseria gonorrhoeae to non-oxidative killing by adherent human polymorphonuclear leucocytes. Cell Microbiol. 11, 1074-1087 (2009).
  6. Edwards, A. M., Massey, R. C. Invasion of human cells by a bacterial pathogen. J. Vis. Exp. (49), e2693(2011).
  7. Bozzola, J. J. Conventional specimen preparation techniques for transmission electron microscopy of cultured cells. Methods Mol. Biol. 369, 1-18 (2007).
  8. Dorward, D. W. Ultrastructural analysis of bacteria-host cell interactions. Methods Mol. Biol. 431, 173-187 (2008).
  9. Yang, L., et al. Rapid, absolute, and simultaneous quantification of specific pathogenic strain and total bacterial cells using an ultrasensitive dual-color flow cytometer. Anal. Chem. 82, 1109-1116 (2010).
  10. Mueller, R. S., et al. Vibrio cholerae strains possess multiple strategies for abiotic and biotic surface colonization. J. Bacteriol. 189, 5348-5360 (2007).
  11. Shen, C., et al. Enhanced inactivation of Salmonella and Pseudomonas biofilms on stainless steel by use of T-128, a fresh-produce washing aid, in chlorinated wash solutions. Appl. Environ. Microbiol. 78, 6789-6798 (2012).
  12. Hoefel, D., Grooby, W. L., Monis, P. T., Andrews, S., Saint, C. P. Enumeration of water-borne bacteria using viability assays and flow cytometry: a comparison to culture-based techniques. J Microbiol Methods. 55, 585-597 (2003).
  13. Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. J. Vis. Exp.. (17), e745(2008).
  14. Allen, L. A. Immunofluorescence and confocal microscopy of neutrophils. Methods Mol Biol. 412, 273-287 (2007).
  15. Kaplan, E. L., Chhatwal, G. S., Rohde, M. Reduced ability of penicillin to eradicate ingested group A streptococci from epithelial cells: clinical and pathogenetic implications. Clin. Infect. Dis. 43, 1398-1406 (2006).
  16. Chow, O. A., et al. Statins enhance formation of phagocyte extracellular traps. Cell Host Microbe. 8, 445-454 (2010).
  17. Thulin, P., et al. Viable group A streptococci in macrophages during acute soft tissue infection. PLoS Med. 3, e53(2006).
  18. Kubica, M., et al. A potential new pathway for Staphylococcus aureus dissemination: the silent survival of S. aureus phagocytosed by human monocyte-derived macrophages. PLoS One. 3, (2008).
  19. Swords, W. E., et al. Mycobacterium xenopi multiplies within human macrophages and enhances HIV replication in vitro. Microb. Pathog. 40, 41-47 (2006).
  20. Tamilselvam, B., Almeida, R. A., Dunlap, J. R., Oliver, S. P. Streptococcus uberis internalizes and persists in bovine mammary epithelial cells. Microb. Pathog. 40, 279-285 (2006).
  21. Martinez, A. N., et al. Molecular determination of Mycobacterium leprae viability by use of real-time PCR. J. Clin. Microbiol. 47, 2124-2130 (2009).
  22. Botha, M., Botes, M., Loos, B., Smith, C., Dicks, L. M. Lactobacillus equigenerosi strain Le1 invades equine epithelial cells. Appl. Environ. Microbiol. 78, 4248-4255 (2012).
  23. Allen, L. A., Schlesinger, L. S., Kang, B. Virulent strains of Helicobacter pylori demonstrate delayed phagocytosis and stimulate homotypic phagosome fusion in macrophages. J. Exp. Med. 191, 115-128 (2000).
  24. Smith, C. D., Berk, S. G., Brandl, M. T., Riley, L. W. Survival characteristics of diarrheagenic Escherichia coli pathotypes and Helicobacter pylori during passage through the free-living ciliate, Tetrahymena sp. FEMS Microbiol. Ecol. 82, 574-583 (2012).
  25. Morse, S. A., Bartenstein, L. Purine metabolism in Neisseria gonorrhoeae: the requirement for hypoxanthine. Can. J. Microbiol. 26, 13-20 (1980).
  26. Johnson, M. B., Criss, A. K. Neisseria gonorrhoeae phagosomes delay fusion with primary granules to enhance bacterial survival inside human neutrophils. Cell Microbiol. , (2013).
  27. Stocks, S. M. Mechanism and use of the commercially available viability stain. BacLight. Cytometry A. 61, 189-195 (2004).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Fluorescence MicroscopyBacterial ViabilityHost Cell AssociationMembrane PermeabilityPropidium IodideSYTO9 DyeSubcellular LocalizationExtracellular BacteriaIntracellular BacteriaViability Dyes

Related Articles