Yöntem makalesi

Genetiği keşfedin A Tohum Kabuğunun Yatak Deneyi

13.3K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/50732

⸱

9 Kasım 2013

 , 
1Département de Botanique et de Biologie Végétale, Université de Genève

Bu makalede

Özet

Biz Arabidopsis thaliana tohum tohum kat yatak tahlili (SCBA) monte prosedürü sunuyoruz. SCBA genetik ve in vitro keşfetmek için güçlü bir araç olduğu gösterilmiştir nasıl uyuyan tohum ve hafif uyaranlara yanıt olarak endosperm kontrolleri tohum çimlenme. SCBA endosperm embriyonik büyümeyi etkilemek için şüphelenilen her durumda altında uygulanabilir prensip olarak.

Özet

Arabidopsis endosperm olgun embriyoyu çevreleyen ve uyuyan tohumların çimlenmesini veya (FR) uzak kırmızı ışık atımı ile ışınlanmış nondormant tohumların bunu önlemek için önemli bir rol oynayan bir tek hücre tabakası oluşur. Ayrıca endosperm tarafından uygulanan çimlenme baskıcı aktivitesi altında yatan moleküler genetik mekanizmaları anlamak için, bir "tohum kat yatak" deneyi (SCBA) icat edildi. SCBA fiziksel tohum kat altta yatan bir katman üzerinde embriyo gelişimini izleme sağlar tohumlardan tohum mont ve embriyolar ayıran bir diseksiyon işlemdir. Dikkate değer, SCBA tohum dinlenmesi ve tohum çimlenme FR-bağımlı kontrolü bağlamında tohum kat çimlenme baskıcı faaliyetlerini yeniden oluşturulmasını. SCBA, atıl nondormant ve genetik olarak değiştirilmiş tohum kabuğu ve embriyo malzemeleri, çimlenme kontrol genetik yollarının kombinasyon kullanımına izin verir ve özel olarak op yanaendosperm ve embriyo aşmayınız disseke edilebilir. Burada bir ayrıntı SCBA'yı monte prosedürü biz.

Giriş

Arabidopsis olgun tohumlarda, tohum kabuğu testa, maternal kökenli ölü doku bir dış tabaka, ve endosperm, embriyo doğrudan 1 çevredeki canlı doku tek bir hücre tabakası oluşmaktadır. Endosperm ve embriyo ayrı fertilizasyon olaylardan türetilmiştir: embriyo, bir anne ve bir baba genomu 2 ile diploid doku ise endosperm anne ve bir baba genom iki ile bir triploid dokudur.

Geleneksel olarak endosperm atanan ana işlevi bir besleyici doku olmasıdır. Bununla birlikte, aynı zamanda endosperm tohum çimlenmesi kontrol etmek için merkezi bir rol oynadığını giderek daha belirgin hale gelmektedir. Bu kavram, uyuşukluk durumunda yeni üretilen tohumlar tarafından sergilenen bir özellik birinci belli oldu. Uyuyan tohumlar çimlenme elverişli koşulların varlığına rağmen çimlenmeye başarısız. Tohumlar bir olgunlaşma döneminden sonra kendi uyuşukluğuna kaybeder ve nondorman halineuygun çimlenme koşullarına maruz kaldığında t, yani çimlenir. Model bitki Arabidopsis dahil olmak üzere birçok bitki türünün içinde, tohum kabuğu kesinlikle çiğit kaldırma embriyonik büyüme ve 3,4 yeşillendirme tetikler beri uykuda tohumların çimlenmesini önlemek için gereklidir. Arabidopsis'te, Bethke et al. Çimlenme endosperm 5 çevreleyen endosperm korurken testa çıkardıktan sonra bastırılmış kaldığı görülmektedir. Bu gözlemler, güçlü endosperm, embriyo üzerinde baskı uygulayarak aktivitesi tohum kabuğu içindeki doku olduğunu belirtti. Ancak, tohum kabuğu kaldırma deneyleri zorunlu tohum kat tarafından sağlanan çimlenme baskıcı faaliyetin doğasını açıklığa kavuşturulması ne de bunu uygulamak genlerin belirlenmesi yardım yok.

Biz son zamanlarda tohum kabukları ve embriyolar fiziksel olarak ayrılmış ama yakın proxi tutulur bir tohum kat yatak tahlili (SCBA) tanıttımity endosperm sağladığı çimlenme baskıcı aktivitesi 6 korunur, böylece. SCBA, uyuyan nondormant ve genetiği değiştirilmiş tohum ceket ve embriyonik malzemelerin birleştirici kullanımına izin verir. Bunun bir sonucu olarak, çimlenme ve özellikle endosperm ve embriyoda işletim kontrol genetik yolları çıkarılmasına olanak sağlar. SCBA endosperm 6 büyümesini bastırmak için embriyo doğru fitohormon absisik asit (ABA) serbest bırakır göstermek için uyuşukluk bağlamında kullanılmıştır. Ayrıca biz Dormantlığı tanıtmak için sinyal endosperminde faaliyet yollar ve embriyonik doku tanımlamak için SCBA'yı kullanabilirsiniz.

Çimlenme kontrol endospermin rolü daha çok kırmızı (FR) ışık darbesine maruz nondormant tohumların davayı dikkate alarak güçlendi. Erken tohumun çekilmesi üzerine bir FR ışık palsı çimlenme 7,8 inhibe ettiği bilinmektedir. Tohum kat tohumlardan FR bir ışık nabız kaldırıldığındaşiddetle endosperm de nondormant tohumların 9 çimlenmesini ezemez düşündüren, çimlenme inhibe edemedi. Dikkate değer olarak, bağımsız solunum aparatı da çimlenme FR-bağımlı inhibisyonu özetlemek için kullanılabilir. Bu tohum çimlenme bu FR-bağımlı inhibisyonu da endosperm 9 ABA salınmasını içeren bir süreç olduğunu göstermektedir bırakıldı. Ayrıca, bağımsız solunum aparatı endosperm ve hafif ipuçları 9,10 cevaben nondormant tohum çimlenmesi kontrol etmek için embriyo faaliyet gösteren farklı ışıklı sinyal yollarını tespit izin verdi.

SCBA tohum çimlenme kontrolü bağlamında endosperm işlevini keşfetmek için güvenilir bir teknik olduğu, bu nedenle görünüyor. Ayrıca, çimlenme kontrol şüphelenilen genler endosperm, embriyo ya da her ikisi dokularda faaliyet olup olmadığını değerlendirmek için in vitro güçlü bir araçtır. Burada bir ayrıntı SCBA'yı birleştirmek için gereken çeşitli adımları biz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

SCBA monte sonra, embriyoların büyümesi birkaç gün boyunca izlenir. Bu nedenle, SCBA'daki tohum diseksiyon işlemi ve montaj önce, bir embriyo gelişimi üzerinde tohum kaplama malzemesinin etkisine uygun bir değerlendirme engelleyebilir gelecek kirletmesini önlemek için tohum sterilize etmek gerekmektedir.

1.. Tohum Sterilizasyon

  1. Bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde, olgun ve kuru Arabidopsis tohum 50-60 ul dökün ve% 70 etanol solüsyon hazırlanır.
  2. Tohum içeren mikrosantrifüj tüpüne% 70 etanol çözeltisi içinde 1 ml ilave edilir ve bir vortexer 1.200 rpm'de 10 dakika boyunca oda sıcaklığında çalkalanır.
  3. 3 saniye santrifüj Mikrosantrifüj tüpü 4,000 xg'de tüpün altındaki tohum konsantre.
  4. Dikkatli bir mikrosantrifüj tüpün altındaki tohum bırakarak vakum emme ucu ile,% 70 etanol solüsyonu aspire.
  5. T için steril damıtılmış su ile 1 ml ilave edilir O mikrosantrifüj tüp hala tohum içeren.
  6. 1,200 rpm'de 10 dakika boyunca oda sıcaklığında çalkalayın.
  7. 3 saniye santrifüj Mikrosantrifüj tüpü 4,000 xg'de tüpün altındaki tohum konsantre. Dikkatli bir şekilde tüpün altındaki tohum bırakarak vakum emme ucu kullanılarak süpernatan aspire su.
  8. Hala tohum içeren mikrosantrifüj tüpüne steril su, damıtılmış suyun 1 ml ilave edilir. Suyun akışı homojen tüp içindeki tohum askıya emin olun. Burada amaç tohumların bütünlüğünü korumak üzere daha fazla sallayarak kaçınmaktır.
  9. Tohumlar 30 saniye boyunca yine tüp bırakarak tüpün altındaki yerçekimiyle yerleşmek olsun. Dikkatli bir şekilde tüpün altındaki tohum bırakarak vakum emme ucu kullanılarak süpernatan aspire su.
  10. 1,8-1,9 adımları dört kez tekrarlayın. Genel sterilizasyon prosedürü yaklaşık 30 dakika sürer.

2. Tohum Kaplama

"ontent> Tüm sonraki basamaklar steril koşullarda korumak için bir laminer akış kabini içinde yapılır.

  1. (N-morfolino) etansülfonik asit (MES-KOH - bir Petri tabağı 2.5 mM 2 4.3 g / L Murashige ve Skoog ortamını ihtiva eden bir çözelti otoklav ile hazırlanabilir çimlenme ortamının 30 ml ihtiva eden (100 mm çapında, 20 mm yükseklik) hazırlanması , pH 5.7) ve 0.8 g / L agar. Çözüm Petri plaka üzerine dökülmeden önce 50 ° C su banyosunda soğumaya bırakın.
  2. Tohumları ihtiva eden tüpe steril damıtılmış su 200 ul ekleyin. Tohum yeniden süspanse edin ve 1 ml ucu ile standart bir pipet kullanarak çimlenme ortamının yüzeyi üzerine transfer edin.
  3. Bir vakum emme ucunu kullanarak çimlenme ortamının yüzeyinde tohumları çevreleyen su çıkarın.
  4. Başka bir kurutma işlemi 2 saat boyunca laminer akış kabini içine Kapağın olmaksızın tohum içeren Petri kabı bırakın. Kapaklı Petri kabı kapatın ve laminer altında bekletinyaklaşık 4 saat, tohum sterilizasyon işlemi (adım 1.2) de başlatılmasından bu yana geçen, böylece yaklaşık 90 dakika boyunca kabine akar.

3. Tohum Diseksiyon

Aşağıdaki adımlar laminer akış kaputu dolap içinde yerleştirilen bir stereo çalışma gerektirir. A Dumont forseps 5. kesik (yani künt) ipuçları ile büyük ölçüde tohumların kullanımı (Şekil 1A) kolaylaştırır.

  1. Çimlenme ortamının 30 ml içeren bir Petri kabı, yeni levha hazırlayın. Ortam, iki yan yana dikdörtgen steril Whatman 3MM kağıt (• Şekil 1 B, aşama 1, 1,5 cm x 1.0 cm) yüzeyinde bir yer. Whatman 3MM kağıt bir otoklav içinde sterilize edilir.
  2. Steril forseps (Şekil 1B, adım 2) kullanılarak Whatman 3MM kağıtlara tohumları aktarın.
  3. Yavaşça kesik forseps yan yana küt uçları (kullanılarak tohum basarak Whatman 3MM kağıt karşı tek bir tohum tutun Şekil 1B, 3. adım).
  4. (12.7 mm x, örneğin U100 insülin şırınga + 1 ml şırınga içinde, 0.33 mm (29 g)), bir şırınga iğnesi kullanılarak tohum, tohum kabuğunu (testa ve endosperm) kesme (Şekil 1B, aşama 4). Arabidopsis tohum şekli elipsoidal olup, kotiledonlar (yani uzak kök ucundan) radikula birleştirilir yere mümkün olduğunca yakın en uzun yarı-ana ekseni boyunca, tohum kabuğunu kesmek için tavsiye edilir. Bu diseksiyon prosedürünün sonraki aşamada embriyonun güvenli serbest yardımcı olur.
  5. Kesik forseps (Şekil 1B, adım 5) yan yana künt ipuçlarını kullanarak Whatman 3MM kağıt karşı tohum itin. Bu adım adım, 3,4 (Şekil 1B, aşama 6) oluşturulan açıklıktan dışarı tohum kabuğu embriyo serbest bırakır. Bu kotiledon ucu Kökçüğün ucuna en yakın olan tohum (yani, uzak fr itme uygulanması önerilirom açılması).

4. Meclis Tohum Portmanto Yatak Deneyi (SCBA)

Tohum kat ve embriyo sayısı uygun seçimi için açıklamalara bakın.

  1. Çimlenme ortamının 30 ml içeren bir Petri kabı, yeni levha hazırlayın. Ortamının yüzeyi üzerine yerleştirin, naylon elekten bir steril dikdörtgen parça (3.5 cm x 5.0 cm) (Şekil 2, adım 1).
  2. Zarar görmesini önlemek için, embriyo ve tohum kat yavaşça şırınga iğnesi (Şekil 2, adım 2) kullanarak onları iterek forseps metalik kenarlarının yüzeyine taşınmış olabilir. Embriyo transferi ve Naylon örgü (Şekil 2, 3. adım) üzerine tohum kat.
  3. Tohumlar kat mümkün olduğunca çok yaklaştırdı (Şekil 2, adım 4) olduğundan emin köreltilmiş forseps ve iğne kullanarak tohum kat dairesel ve tek bir katman birleştirin. Mümkün olduğunca maruz deneyin tarafından üretilen tohum kabuğu açılışyukarı iğne. Bu adım sistematik test değildi. Embriyonun gelişimini inhibe yayılabilir maddeler doğrudan ondan embriyo dışarı doğru difüze yerine beklenmektedir Bununla beraber, bu SCBA'daki verimliliğini artırabilir.
  4. Adım 4.3 'de monte edilmiş tohum kabuğu yatak ortasına, yuvarlak tek bir tabaka (Şekil 2, adım 5) halinde embriyolar yerleştirin. Embriyoların mümkün olduğu kadar yakın yakınlık içinde olduğundan emin olun.
  5. 20-21 ° C'de sürekli ışık (40 mol / m 2 s ec) altında SCBAs inkübe FR bir darbe, çimlenme tutuklama normal ışık altında SCBA'yı monte tarif edildiği gibi FR nabız 9 uygulamak ve karanlıkta Petri çanağı bırakmak için kullanılan durumunda.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Önceki iş GA sentezlemek mümkün mutant tohum tohum 11,12 yüksek ABA birikiminin bir sonucu olarak çimlenme koyamadık olduğunu gösterdi. Onun kaldırma embriyonik büyüme 13 tetikler Ancak, çimlenmeye yetersizlik tohum kat gerektirir. Bu durum kuvvetle GA sentezlenmesi için mümkün tohumların endosperm embriyonik büyümesini bloke etmek ABA serbest olduğunu göstermiştir. Bu nedenle GA ve ABA sentezlemek mümkün tohum kat aksine SCBA'daki embriyoların gelişimini engellemek için GA sentezlemek için toh...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada açıklanan çiğit yatak deneyi (SCBA) prosedürü prensip olarak Arabidopsis tohum çimlenme bloke (ya da sonra) ve endosperm, bu tutuklama uygulamaya şüphelenilen herhangi bir durum için geçerlidir. İkincisi, tohum kabuğunu (testa ve endosperm) kaldırılması ve embriyolar, tohum kaplama ile çevrili zaman bu göre daha hızlı bir büyüme embriyonik ilerler gözlemlenen gözlemleyerek kanıtlanabilir. Çimlenme özellikle çevresel, fiziksel parametrelere (örneğin su ya da potansiyel ışık kalitesi) veya belirli...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Teşekkürler

Bu çalışma, İsviçre Ulusal Bilim Vakfı tarafından hibe ve Cenevre Devlet tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Thermomixer ComfortEppendorf AG5355 000.011Eppendorf AG, Hamburg, Almanya
Vacusafe ComfortINTEGRA Biosciences AG158 310Integra Biosciences AG, Zizers, İsviçre
Petri kabı plakası (100 mm x 20 mm)Greiner Bio-One GmbH664 102Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Almanya
Murashige ve SkoogSigma-AldrichM5524Sigma-Aldrich, St Louis, MO, ABD
MESSigma-AldrichM3671Sigma-Aldrich, St Louis, MO, ABD
Agar (bitki agar)Duchefa Biochemie BVP1001Duchefa Biochemie, Haarlem, Hollanda
Dumont forseps #5Güzel Bilim Araçları GmbH11251-10Fine Science Tools GmbH, Heidelberg Almanya
Şırınga iğnesiBD Micro-Fine324827BD, Franklin Lakes, NJ ABD
Naylon ağ (SEFAR NYTEX)SEFAR AG03-50/31Sefar AG, Heiden, İsviçre
Büyüme odasıCLF Bitki İklimleriPercival I-30BLLXCLF tesisi İklim, Wertingen, Almanya
PaclobutrazolSigma-Aldrich46046Sigma-Aldrich, St Louis, MO, ABD

Kaynaklar

  1. Debeaujon, I., Leon-Kloosterziel, K. M., Koornneef, M. Influence of the testa on seed dormancy, germination, and longevity in Arabidopsis. Plant Physiol. 122, 403-414 (2000).
  2. Baroux, C., Spillane, C., Grossniklaus, U. Evolutionary origins of the endosperm in flowering plants. Genome Biol. 3, reviews1026(2002).
  3. Debeaujon, I., Lepiniec, L., Pourcel, L., Routaboul, J. -M. Seed development, dormancy and germination. , Blackwell Publishing. 25-43 (2007).
  4. Finch-Savage, W. E., Leubner-Metzger, G. Seed dormancy and the control of germination. New Phytol. 171, 501-523 (2006).
  5. Bethke, P. C., et al. The Arabidopsis aleurone layer responds to nitric oxide, gibberellin, and abscisic acid and is sufficient and necessary for seed dormancy. Plant Physiol. 143, 1173-1188 (2007).
  6. Lee, K. P., Piskurewicz, U., Tureckova, V., Strnad, M., Lopez-Molina, L. A seed coat bedding assay shows that RGL2-dependent release of abscisic acid by the endosperm controls embryo growth in Arabidopsis dormant seeds. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 19108-19113 (2010).
  7. Reed, J. W., Nagatani, A., Elich, T. D., Fagan, M., Chory, J. Phytochrome A and Phytochrome B Have Overlapping but Distinct Functions in Arabidopsis Development. Plant Physiol. 104, 1139-1149 (1994).
  8. Shinomura, T., et al. Action spectra for phytochrome A- and B-specific photoinduction of seed germination in Arabidopsis thaliana. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 8129-8133 (1996).
  9. Lee, K. P., et al. Spatially and genetically distinct control of seed germination by phytochromes A and B. Genes Dev. 26, 1984-1996 (2012).
  10. Lee, K. P., Lopez-Molina, L. Control of seed germination in the shade. Cell Cycle. 11, 4489-4490 (2012).
  11. Piskurewicz, U., et al. The gibberellic acid signaling repressor RGL2 inhibits Arabidopsis seed germination by stimulating abscisic acid synthesis and ABI5 activity. Plant Cell. 20, 2729-2745 (2008).
  12. Piskurewicz, U., Tureckova, V., Lacombe, E., Lopez-Molina, L. Far-red light inhibits germination through DELLA-dependent stimulation of ABA synthesis and ABI3 activity. EMBO J. 28, 2259-2271 (2009).
  13. Debeaujon, I., Koornneef, M. Gibberellin requirement for Arabidopsis seed germination is determined both by testa characteristics and embryonic abscisic acid. Plant Physiol. 122, 415-424 (2000).
  14. Sun, T. P., Kamiya, Y. The Arabidopsis GA1 locus encodes the cyclase ent-kaurene synthetase A of gibberellin biosynthesis. Plant Cell. 6, 1509-1518 (1994).
  15. Alonso, J. M., et al. Genome-wide insertional mutagenesis of Arabidopsis thaliana. Science. 301, 653-657 (2003).
  16. Rook, F., et al. Impaired sucrose-induction mutants reveal the modulation of sugar-induced starch biosynthetic gene expression by abscisic acid signalling. Plant J. 26, 421-433 (2001).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Endosperm KontrolEmbriyo Diseksiyonuimlenme BesiyeriGA Eksikli i Olan MutantlarTohum Kabu u zolasyonuDairesel Tabaka MontajS rekli I k nk basyonu

İlgili makaleler