Biyobozunur polimerik nano partiküllerin kullanılması Tedavi Angiogenezis Programlama Kök Hücreler

Summary

Bu biyolojik olarak parçalanabilir bir polimerik nano-tanecikleri kullanılarak anjiyojenez için tedavi edici faktörler aşırı ifade programlama kök hücrelerin bir yöntem tarif eder. Tarif edilen işlemler in vitro yağ elde edilen kök hücreleri transfekte etmek ve bir murin arka bacak anjiyojenezi, iskemi modelinde desteklemek için programlanmış kök hücrelerin etkinliğini doğrulamak, polimer sentezi içerir.

Abstract

Kontrollü vasküler büyüme başarılı doku rejenerasyonu ve yara iyileşmesi, hem de örneğin, felç, kalp krizi veya periferal arter hastalıklar gibi iskemik hastalıkların tedavisi için kritik önem taşır. Anjiyojenik büyüme faktörleri doğrudan verilmesi, yeni kan damarı büyümesini teşvik etmek için bir potansiyele sahip, ancak genellikle bu tür hedefleme ve in vivo kısa yarı ömrü eksikliği gibi sınırlamalar ile ilişkilidir. Gen tedavisi anjiyojenik faktörleri kodlayan genlerin sunarak alternatif bir yaklaşım sunmaktadır, ancak genellikle virüsü kullanılarak gerektirir ve güvenlik kaygıları ile sınırlıdır. Burada, biyolojik olarak parçalanabilir bir polimerik nano-tanecikleri kullanılarak in situ anjiyojenik faktörlerin aşırı ifade programlama kök hücreler tarafından damar büyümesini teşvik etmek için yeni geliştirilmiş bir strateji tarif eder. Özellikle bizim strateji vivo iskemik dokulara doğru göç etme yeteneğinden yararlanarak teslim araçlar gibi kök hücreleri kullanılmaktadır. Optimize edilmiş polimerik vektörleri, yağ türevi kullanarak,kök hücreler, vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) kodlayan bir geni fazla-sentezlemek üzere anjiyojenik modifiye edilmiştir. Biz, polimer sentezi, nanopartikül oluşumu, in vitro olarak kök hücreleri transfekte etmek, hem de bir murin arka bacak iskemi modelinde angiogenesisi teşvik etmek için VEGF ifade eden kök hücrelerin etkinliğini doğrulamak için yöntemleri için işlemleri tarif.

Introduction

Bu tekniğin genel amacı iskemi yerinde tedavi etkenleri aşırı ifade eden non-viral programlanmış kök hücreleri kullanılarak tedavi anjiyojenezi teşvik etmektir. Kök hücreleri laboratuarda sentezlenen nanopartiküller kullanılarak biyolojik ex vivo değiştirilmiş olanlar ve anjiyogenez ve doku kurtarma arttırmak için potansiyellerini doğrulamak için arka bacak iskemisi bir murin modelinde aktarılmıştır.

Kontrollü vasküler büyüme önemli bir başarı doku rejenerasyonu bileşen yanı sıra, inme, uzuv iskemisi, ve miyokard enfarktüsü gibi çeşitli iskemik hastalıkların tedavisi içindir. Birçok strateji büyüme faktörü teslimat ve hücre bazlı tedavisi de dahil olmak üzere vasküler gelişime yardımcı olmak için geliştirilmiştir. ^1. hayvan hastalık modellerinde gözlenen etkinliğine rağmen, bu yöntemler, yine de yetersiz gibi büyüme faktörü verilmesi için suprafizyolojik dozları için ihtiyaç duyulması gibi sınırlılıklara yüz ya da parakrinyalnız hücreler tarafından serbest. Yukarıdaki sınırlamalarını aşmak için bir potansiyel strateji kök hücre tedavisi ve kök hücreleri genetik olarak istenen terapötik faktörlerin aşırı ifade için ex vivo transplantasyon öncesinde programlanır, böylece bir gen terapisi, birleştirmektir. Bu yaklaşım, vb arka bacak iskemisi ^{2, 3} kalp hastalığı, kemik iyileştirme ve ⁴ sinir yaralanması ⁵ dahil olmak üzere, çeşitli hastalık modellerinde gösterilmiştir. Ancak, çoğu gen terapi teknikleri, bu tür potansiyel immünojenisite ve araya sokulan mutajenez gibi güvenlik kaygıları ile ilişkili viral vektörler, dayanmaktadır. Non-viral gen teslimi aracılık Biomateryaller bu sınırlamaları aşmak, ancak genellikle, düşük transfeksiyon verimlilik muzdarip olabilir. Etkili bir non-viral gene teslimi için yeni biyomalzeme keşfini hızlandırmak için, son çalışmalar kombinatoryal kimya ve yüksek verimli tarama yaklaşımı kullanmışlardır. Poli (β-amino ES gibi biyolojik olarak parçalanabilir polimer kütüphaneleriTERS) (PBAE) geleneksel polimerik vektör muadillerine kıyasla belirgin gelişmiş transfeksiyon verimliliği ile önde polimerlerin keşfine yol açtı, geliştirilmiş ve tarandı. ^6-7

Burada, arka bacak iskemi bir murin modelinde vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) aşırı ifade eden genetik olarak modifiye edilmiş ADSCs sonraki transplantasyonunu takiben, PBAE sentezi ve in vitro olarak adipoz türetilmiş kök hücreler (ADSCs) transfekte etmek için kabiliyetleri doğrulanmasına tarif . Sonuçları, biyolüminesans görüntüleme kullanılarak hücre kaderini takip lazer Doppler perfüzyon görüntüleme (LDPI) kullanarak doku reperfüzyon değerlendirilmesi ve histoloji ile anjiogenez ve doku kurtarma belirlenmesi ile değerlendirildi.

Protocol

1.. Polimer Sentezi

1. Bir duman başlığı içinde, butandiol diakrilat (C) 3523 mg tartılır ve bir karıştırma çubuğu içeren bir cam sintilasyon şişesine aktarın.
2. Ön ısıtma 5-amino-1-pentanol (32), bir tuzunu çözmek için 90 ° C'ye kadar, daha sonra bir mol oranı ile sonuçlanacaktır bir çeker ocak içinde, 1533 mg ağırlığında ve 32 üzerinden bu yöntem, C ihtiva eden sintilasyon şişesine eklemek C: 32 = 1:1.2.
3. Derhal bir karıştırma plakası üzerine iki çözüm içeren şişe yerleştirin. 600 rpm'de karıştırma hızını ayarlayabilirsiniz.
4. 90 ° C'de ayarlanmış bir fırına aktarın parıldama ampulünün 4 saat için 1000 rpm'ye ayarlayın karıştırma hızı. Karıştırma çubuğu takılıyor, hızını düşürmek. 4 saat sonra, düşük değerli 300 rpm hız ve başka 12-16 saat boyunca 90 ° C 'de muhafaza.
5. Bir karıştırma çubuğu içeren bir cam sintilasyon şişesine susuz tetrahidrofuran (THF) içinde 10 ml C32 5 g ekleyin. Tamamen eriyene kadar yüksek üzerinde folyo ve girdap sarın.
6. Ayrı bir cam sintilasyon şişesi içinde contaBir karıştırma çubuğu ining, Tetraethyleneglycoldiamine 10 mM (122) ekleyin. THF içinde 40 ml ilave edilir.
7. 5 dk sonra birlikte birleştirmek için bir heyecan plaka üzerine iki şişeleri (C32 ve 122) yerleştirin. Folyo ile örtün ve 24 saat boyunca 400 rpm'de karıştırılarak oda sıcaklığında bırakın. Nihai ürün, C32-122 olarak adlandırılır.
8. C32-122, her 5 g parti için 5 x 50 ml Falcon tüpleri dışarı tartılır. Bir defterinizdeki her tüpün kütlesi unutmayın.
9. Her bir 50 ml Falcon tüpüne transfer susuz dietil eter içinde 30 ml.
10. Aktarım her biri 50 ml Falcon tüpüne C32-122 10 ml.
11. Vortex Falcon tüpleri şiddetli bir şekilde, daha sonra 2 dakika boyunca 2500 rpm'de santrifüj. Not: ekstre polimer tüpün tabanında toplayacaktır.
12. Üst çözüm atmak ve adımları 1.9 ve 1.11 iki kez daha tekrarlayın.
13. Gece boyunca kurutma cihazı ve vakumla ekstre C32-122 ihtiva eden açık tüpleri yerleştirin. Emin olun bütün tüpler ışıktan korunur.
14. Nihai kütlesini belirlemek için C32-122 içeren tüm tüpler tartmakekstre polimer.
15. 100 mg / ml 'lik bir konsantrasyonda susuz DMSO içerisinde özü çıkarıldı polimer çözülür.
16. Nem ve ışıktan korunan -20 ° C de çözülmüş polimer saklayın.

2. Hücre Serpilmesi

1. Ön kaplama,% 0.1 (ağırlık / hacim) jelatin ile bir T-150 doku kültürü şişenin tabanı. Jelatin, 30-45 dakika boyunca bir şişe içinde kalmalıdır. Jelatin kaplama ADSCs yapışmasını sağlar.
2. Önceden kaplanmış T-150 şişesi aspire jelatin.
3. % 10 FBS,% 1 penisilin / streptomisin ve 10 ng / ml bFGF ihtiva eden DMEM, 20 ml şişeye 4 x 10 ⁶ ADSCs (≤ geçit 3) eklenir.
4. 37 ° C, bir gece boyunca% 5 _CO2 ile kuluçka makinesi içinde T-150 şişesi yerleştirin.
5. Ertesi gün transfeksiyon prosedürü başlayın.

3. Nanopartikül Hazırlama ve transfeksiyonu

1. Aşağıdaki prosedür, ortalama 16.1 ug plazmid DNA içeren nano partiküllerin hazırlanması için30:1 ağırlık oranını plazmid için bir polimer olarak 1.0 x 10 ⁶ hücre.
2. Plasmid DNA (1 mg / ml, pVEGF165, Aldevron, ND, ABD) bir 15 ml Falcon tüpü içinde bir sodyum asetat (25 mM) içinde 120 ug / ml 'lik nihai bir konsantrasyona kadar seyreltilir.
3. Ikinci bir 15 ml Falcon tüpü içinde bir sodyum asetat (25 mM) içinde 3.6 mg / ml 'lik bir nihai konsantrasyona kadar C32-122 (100 mg / ml) seyreltin.
4. Hemen 10 saniye için yüksek tek bir 15 ml Falcon tüpü ve girdap her bir Falcon tüpleri birleştirin.
5. Tüp ortaya nanopartikül oluşması için 10 dakika boyunca oda sıcaklığında bekletin.
6. Kuluçka sırasında, transfekte edilmiş 1.0 x 10 ⁶ hücre başına 7.8 ml tam olarak desteklenmiş DMEM ile doku kültür şişesi içinde orta yerine.
7. Doku kültürü şişesine nanoparçacık çözüm aktarın ve öne doğru ve geriye doğru eşit yaymak.
8. 37 ° C, 4 saat boyunca% 5 _CO2 ile kuluçka makinesi içinde doku kültürü şişesi yerleştirin.
9. 2 saat sonra, nanopar değiştirmekDMEM ile medya içeren TICLE.
10. 37 ° C,% 5 _CO2 de 2 saat daha inkübe edildikten sonra hücreler, in vivo enjeksiyon için hazırdır.

4. Hindlimb İskemi Prosedürü

1. Bütün deneyler, Stanford Üniversitesi Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi Prensiplerine ve onaylanmıştır APLAC protokollere uygun olarak yapıldı. Arka bacak iskemisi sıçangil modelinin üretilmesi daha önce tarif edildiği gibi gerçekleştirilir. ⁸ ayrıntılı talimatlar için, referansa bakınız. Kısa bir açıklama aşağıda verilmiştir.
2. Teneffüs ve 1 l / dk oksijen akış hızı ile% 1-3 doz izofluran ile anestezi altında fare yerleştirin. Ayak tutam, solunum hızında azalma, ve uyuşukluk ile anestezi derinliği sağlamak.
3. Tıraş kremi ile fare karın bölgesi ve hem de hindlimb bölgelerden saç çıkarın.
4. Orta çizgisine doğru medial uyluk merkezindeki kesi yapar ve sonra eski için üstteki yağ yastığı kestifemoral arter poz.
5. Distal sitesi (diz yakın) ve proksimal sitesi (inguinal ligament hemen distalinde): İki siteleri arteri bağlayın.
6. Ligasyonları oluşturmak için, damardan arter ayırmak ve arter etrafında 5-0 ipek sütür iplik. Ligasyonu yapmak için iki knot ile arter kapalı kravat.
7. İki nokta arasında ligasyon arter çıkarın.
8. PBS ile cerrahi bölgeyi yıkayın ve sonra dikin kesi kapatıldı.
9. Anestezi artık çıkarılabilir. Yeniden uyanış kadar fare sıcak tutun. Post-operatif bakım, 2-4 mg / kg Lidokain kesi yerinde subkutan yeniden uyanış önce enjekte edilebilir. Daha fazla ağrı yönetimi 12 ve 24 saat sonra 0.05-0.1 mg / kg deri altından Buprenorfin teslim içerebilir. Solunum paterni, açık ağrı veya sıkıntı, ve cilt renk değişiklikleri gözlemleyerek yedi gün boyunca günde bir kez farelerin sağlık durumunu izlemek.
10. Lazer Doppler perfüzyon görüntüleme hindlimb iskemi onaylayın.

5. Hücre Enjeksiyonlar

1. Transfekte edilmiş hücreler ile farenin hazır olduğunda, trypsinize, PBS ile transfekte edilmiş hücrelerin santrifüj, yıkama ve ardından sayılır.
2. PBS içerisinde ml başına 10 x 10 ⁶ hücre yoğunluğunda hücreler yeniden süspanse edin.
3. Hücre süspansiyonları, 110 ul'lik bir hacimde ayrı bir Eppendorf tüpleri içine ayrılmalıdır. Bu, her bir fare hücre eşit miktarda almasını sağlayacaktır.
4. (% 2.5 izofluran, 1 L / dk oksijen akış hızı) anestezi altında her bir fare yerleştirin.
5. Alkol mendil ile enjeksiyon yerinde temizleyin.
6. 27 G tüberkülin şırınga kullanarak, homojen bir süspansiyon elde sağlamak için şırınga içine yukarı ve aşağı hücreleri çizmek. Enjektöre hücre süspansiyonu hacmi 100 ul kadar çizin.
7. Adduktor kas bölgeye yarım hücre süspansiyonu enjekte edilir ve sonra baldır kas bölgeye diğer yarısını enjekte. Enjekte edilmesi üzerine, en az 15-30 saniye için yerinde bırakın şırıngaHücre süspansiyonunun sızmasını önler.
8. Hayvan çalışma için uygun kontroller içerir: a kodlayıcı olmayan plazmid (herhangi bir biyolojik etkinliğe sahip, örneğin plazmid) ile transfekte 1) hücreleri, tek başına 2) hücreler ve 3) PBS.
9. Enjeksiyonlar tamamlandığında, anestezi fareyi çıkarın ve fare yeniden uyanır kadar sıcak tutun.

6. Biyoparlaklık Görüntüleme

1. Biyolüminesans görüntüleme (BLI) başlamak için, yukarıda tarif edildiği gibi fareler anestezi.
2. Alkol mendil ile enjeksiyon yerinde temizleyin.
3. Kullanarak insülin şırınga, 15 mg / ml D-luciferase (ateşböceği lusiferaz için alt-tabaka) yük 100 ul. Işıktan uzak tabakayı tutun.
4. Periton içine enjeksiyonu gerçekleştirmek için, onların ön cilt gergin çekmek, onların arkasında cilt tarafından fareler tutun. Periton karın bölgesi içine iğneyi ve alt-tabaka 100 ul enjekte edilir.
5. Anestezi altında IVIS lusiferaz görüntüleme odasında fare yerleştirin.
6. 1.0 dakikalık bir pozlama süresi ile görüntü fareler. Parametreler ayarlandığında, görüntüler elde etmek için başlar.
7. Görüntü elde edildiğinde, lusiferaz sinyalini ölçmek için, ilgili bölgeyi işaretleyin. Bu durumda, hücre-enjeksiyon yerinde iskemik ekstremite işaretleyin.
8. Sinyali bir zirveye ulaşır ve azalmaya başlayana kadar lusiferaz sinyalini her 3-5 dakikada ölçmek için devam edin. Bu fareler üzerinde ve çeşitli zaman noktalarında fazla karşılaştırılması için kullanılan değerdir.
9. Tamamlandığında, odacık ve anesteziden fareler çıkarın. Yeniden uyanış kadar sıcak fareler tutun.

7. Lazer Doppler Perfüzyon Görüntüleme

1. Laser Doppler perfüzyon görüntüleme daha önce tarif edildiği gibi gerçekleştirilir. ⁸ prosedür kısaca tarif edilmektedir.
2. Önce fare yüzünden saça objeyi engellemek için arka ayakların ve karın bölgesi hem de örten alanlarda temiz traşlı olmalı görüntüleme Doppler için.
3. Doppler görüntü hazır olduğunda, mouyukarıda tarif edildiği gibi anestezi uygulanmış se olmalıdır.
4. Rektal termometre ile vücut sıcaklığını izlerken sıcak bir plaka üzerinde 36 ° C fare ısıtın.
5. Yansıtıcı olmayan siyah zeminde fare koyun ve burun konisi tarafından anestezi tutmak. Fare bacakları eşit maruz ile dorsal yüzeyinde yer almalıdır.
6. Yaklaşık 15 cm fare üzerinde ve fare kasık bölgesine doğru sensörden gelen laser gösterici yönlendiren lazer Doppler sensörü yerleştirin.
7. Fare ve Doppler sensör konumunda olduğunda, görüntüler Başlat düğmesine basarak LDPIwin yazılım kullanan alınabilir.
8. Bağıl perfüzyon ölçümleri ilgi (ROI) bölge olarak (iskemik ve non-iskemik) hem de arka ayakların belirtilerek alınabilir. Iskemik olmayan hindlimb için ortalama iskemik perfüzyon oranı nispi perfüzyon gösterir.

8. Doku Hasat Prosedürü

1. Hasat fare tis hazır olduğundahistoloji ve / veya biyokimyasal işleme dava, fare ötenazi olmalı. Burada, fare, servikal dislokasyon ile fare ötenazi, daha sonra 3-5 dk boyunca 5% izofluran maruz ötenazi edilir.
2. Hindlimb için uzak karın bölgesi ve proksimal çevresel hindlimb çevreleyen örten cilt kesin. Cilt cilt ayak için, arka bacağın üzerinde geri çekilebilir, öyle ki dorsal yüzeylere ventral kesilir.
3. Cildi geri çekerek üzerine, uzuv pelvik ve femur eklem kesmek için künt diseksiyon makas kullanarak Ampute olabilir.
4. İki ana dokular analiz için alınır: medial adduktor kas ve gastrokinemius kasları.
5. Histoloji için cryosectioning için optimal kesim sıcaklığında (Ekim) bir veya iki dokuları gömün.
6. Biyokimyasal analiz için, bir 1.5 ml Eppendorf içine bir ya da her iki doku toplanması ve en az 2 dakika boyunca sıvı azot banyosu içine daldırın. Numuneler olabilir,gelecekteki işleme için -80 ° C'de saklanır.

Results

Karıştırılarak üzerine, nanopartiküller içine pozitif yüklü polimer (C32-122) ve negatif yüklü DNA plazmid kendini toplanır. C32-122 ve plazmid DNA arasındaki kompleks oluşturma elektroforez sırasında DNA'nın mobilizasyonunu engeller, yani Nanopartikül oluşumu elektroforez analizi ile teyit edilebilir. Polimer hedef hücrelere DNA alımını ve gelişmiş kodlayan proteinlerin takip eden ifadesi (Şekil 2) kolaylaştırmak için bir transfeksiyon tepkin maddesi olarak hizmet vermektedir. Hücreler, flores...

Discussion

Burada non-viral, biyolojik nanopartiküller kullanılarak iyileştirici faktörler aşın yetişkin kök hücreleri programlamak için bir yöntem rapor. Bu platform, iskemi ve kanser gibi, burada kök hücreler olabilir, doğal olarak ana hastalıkların tedavisi için özellikle yararlıdır. Ayrıca, non-viral gene dağıtım platformu en doku rejenerasyonu ve yara için uygun olan tedavi edici faktörler, geçici aşırı ekspresyonu sağlar ^9-10 işlemleri iyileşme. Transfeksiyon işlem hücrelere verimli DNA girişi bağlıdır ve genel ol...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	11965
Fetal Sığır Serumu	Invitrogen	10082
Penisilin / Streptomisin	İnvitrojen	15070
Temel Fibroblast Büyüme Faktörü	Peprotech	100-18B
1,4-Bütandiol Diakrilat (% 90)	Sigma Aldrich	411744	Kısaltma: C
5- amino-1-pentanol (% 97)	Alfa Aesar	2508-29-4	Kısaltma: 32
Tetraetilenglikoldiamin > 99 %)	Molecular Biosciences	17774	Kısaltma: 122
Sodyum Asetat	G-Biosciences	R010
Fosfat Tamponlu Salin	Invitrogen	14190-144
Tetrahyofuran Susuz (> 99.9 %)	Sigma Aldrich	401757
Dietil Eter Susuz (> 99 %)	Fisher Scientific	E138-4
DMSO Susuz (> %99,9)	Sigma Aldrich	276855
Jelatin	Sigma Aldrich	G9391
Tripsin-EDTA	Invitrogen	25200
D-luciferin	GoldBio
Optimal Kesme Sıcaklığı (OCT)	Tissue-Tek	4583
Sıçan Anti-Fare CD31	BD Pharmingen	550274
Alexa Fluor 594 sıçan önleyici IgG	Invitrogen	A11007