Method Article

Peptit-Metal Komplekslerinin Yapı ve Koordinasyon Tayini 1D ve 2D 1H NMR Kullanılarak

DOI:

10.3791/50747

⸱

December 16th, 2013

 ,  , 
1Department of Chemistry, The Hebrew University of Jerusalem, 2Wolfson Centre for Applied Structural Biology, The Hebrew University of Jerusalem

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cu (I) içeren bir metalokoperon model peptidin NMR çözelti yapısı belirlendi ve numune hazırlama ve 1D ve 2D veri toplamadan üç boyutlu bir yapıya kadar ayrıntılı bir protokol açıklandı.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bakır (I)'nin metalokoperon taşıma proteinleri tarafından bağlanması, bakır oksidasyonunu ve zararlı redoks reaksiyonlarına katılabilecek toksik iyonların salınmasını önler. MTCSGCSRPG (altı çizili korunur) dizisini içeren bir Cu (I) bağlayıcı metalokoperon proteininin peptit modelinin Cu (I) kompleksi, NMR spektroskopisi ile inert koşullar altında çözelti içinde belirlendi.

NMR, proteinlerin ve peptitlerin çözelti yapılarının belirlenmesi için yaygın olarak kabul edilen bir tekniktir. X-ışını kristalografisine uygun tek kristaller sağlamak için kristalleşmenin zorluğu nedeniyle, NMR tekniği, özellikle katı halden ziyade çözelti durumu hakkında bilgi sağladığı için son derece değerlidir. Burada, NMR ile tam üç boyutlu yapı belirlemeleri için gerekli olan tüm adımları açıklıyoruz. Protokol, bir NMR tüpünde numune hazırlama, 1D ve 2D veri toplama ve işleme, tepe atama ve entegrasyon, moleküler mekanik hesaplamalar ve yapı analizini içerir. Daha da önemlisi, analiz ilk olarak tarafsız bir şekilde güvenilir bir yapı belirlemesi sağlamak için önceden ayarlanmış herhangi bir metal-ligand bağı olmadan gerçekleştirildi.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Peptitler, kendi başlarına protein modelleri, potansiyel ilaç liderleri ve terapötik ajanlar olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. Bununla birlikte, küçük boyutları ve yüksek derecede esneklikleri, kristalleşmedeki zorluklar nedeniyle genellikle X-ışını ile yapı belirlemeyi engeller.

Nükleer manyetik rezonans (NMR), peptit yapılarını ve etkileşimlerini belirlemek için kullanılabilir. Yöntem, yerel ve genel yapı, bağlanma ve daha düşük afinite etkileşimleri hakkında bilgi verebilir ve çözelti durumunda yapılabildiği için zor numunelere uygulanabilir.

Biyolojik sistemlerde bakır taşınması, iyonları oksidasyondan korumak ve toksik bakır2-5 salınımını önlemek için Cu (I) iyonlarını spesifik olarak bağlayan ve bunları bir dizi protein-protein etkileşimi yoluyla hedef proteinlerine ileten hücre içi bakır metalokoperon proteinleri tarafından sağlanır. Bağlanma bölgesi, hem NMR hem de kristalografi ile Cu (I) 'yi iki sistein kalıntısının yumuşak tiyolato ligandları ile bağlamak için gösterilen korunmuş dizi MXH / TCXanyXanyC ile karakterize edilir, ancak ek bir dış ligand da önerilmiştir6-8. Bu proteinlerin yapı-fonksiyon ilişkisi yoğun bir araştırma konusu olmuştur9.

Burada sunulan çalışmada, korunmuş bakır metalokoperon dizisini içeren bir peptit modeli sentezlendi ve inert bir ortamda Cu (I) ile reaksiyona sokuldu. Sunulan protokol, numune hazırlama, veri toplama, veri işleme, yapı oluşturma ve yapısal analiz dahil olmak üzere NMR tarafından yapı belirleme adımlarını açıklamaktadır. Analiz iki adımda yapıldı: İlk yapılar, peptidin bakır iyonuna bağlanma şekli hakkında hiçbir bilgi olmadan üretildi. Bağlama modu ampirik olarak kurulduktan sonra, yüksek çözünürlüklü bir yapı sağlamak için bu kısıtlamalar tanıtıldı. Bağlama şekli, modeldeki temel noktadır ve bu nedenle tarafsız bir şekilde belirlenmiştir.

Model peptitlerin NMR yapısal tayini, kimyagerler ve biyologlar tarafından sıklıkla kullanılan son derece değerli bir tekniktir. Farklı koşullar altında farklı peptitlere nispeten kolay bir şekilde uygulanabilir ve böylece ilgili mekanizmalara ışık tutabilir10. Yapı açıklama sürecini anlamak, önerilen yapıların güçlü ve zayıf yönlerinin daha iyi anlaşılmasını sağlar.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Numune Hazırlama

  1. Apo-numune: Yaklaşık 1-2 mg peptidi 450-500 μl döteryumlu NMR dereceli çözücü içinde çözün (biyolojik numuneler için tercih edilen çözeltiler suda %10 D2O veya numune suda çözünmezse veya onunla reaksiyona girerse d6-DMSO 11-12'dir).
  2. Bakırla reaksiyona giren numune: Yaklaşık 1-2 mg peptidi 450-500 μl NMR çözücüsü içinde eşmolar miktarda metal tuzu ile çözün.
  3. Çözeltiyi bir Sinter camı, filtrasyon kağıdı veya incelenen bileşiklere uyan ve bunları adsorbe etmeyen başka bir teknik kullanarak filtreleyin. Bu, homojenliği etkileyecek herhangi bir metalik parçacığı uzaklaştırmak için gereklidir.
  4. Çözeltiyi bir NMR tüpüne aktarın ve kapatın. Tüp kalitesinin kullanılan mıknatıs gücüne uygun olduğundan emin olun (daha fazla ayrıntı için ekipman tablosuna bakın).
  5. Numune oksijene duyarlıysa, oksidasyonu önlemek için bu adımlar inert bir ortamda yapılmalı ve tüp kapatılmalıdır.

2. NMR Veri Toplama ve İşleme13

  1. Apo ve bakır ile reaksiyona giren numunelerin 1D 1H spektrumlarını kaydedin ve karşılaştırın. Bakır içeren peptit spektrumu, amid bölgesinde önemli bir kimyasal kayma değişikliği göstermeli ve apo-peptit esnek olduğundan ve ortalama bir konformasyon gösterdiğinden pikler çözülmelidir, ancak bakır ile reaksiyona girdiğinde, bağlı peptit amidleri tek bir yapıya sahiptir (Şekil 2).
    1. Spektrum değişmezse, reaksiyonun başarısız olduğu varsayılır.
    2. Numune yeşile dönerse, bakır atmosferde oksitlenmiş olur ve bu da bağlanma özelliklerini değiştirebilir.
    3. Her iki durumda da numunenin yeniden yapılması gerekecektir.
  2. Dar çizgi genişliklerine sahip amid kalıntılarının minimum örtüşmesini sağlayan NMR ölçümleri için en uygun sıcaklık koşullarını bulun.
  3. Aynı koşullar altında (sıcaklık, pH vb.) COSY14, TOCSY15 ve NOESY16 veya ROESY17 NMR deneylerini kurun ve sırayla çalıştırın.
    1. COSY (Şekil 3) ve TOCSY (Şekil 4) deneyleri, sırasıyla bitişik ve daha uzun menzilli komşu proton-proton etkileşimlerinin karşılıklı bağ etkileşimlerini tespit edecektir. COSY spektrumu HN-Hα korelasyonları hakkında bilgi verirken, TOCSY spektrumu ek olarak HN ve ilişkili kalıntıların diğer H alifatik protonları hakkında bilgi verir.
    2. NOESY ve ROESY (Şekil 5) deneyleri, yapısal bilgi vermek için bağlara bağımlı olmadan uzayda yakınlığı tespit eder. İkisi arasındaki seçim, bileşiğin etkin boyutuna ve alan kuvvetine göredir. Bu tür bazı kombinasyonlar teorik sıfır sinyalleri verir (Şekil 6) ve NOE etkileşimlerini tespit etmek için bir ROESY deneyinin çalıştırılması gerekecektir10,18.
    3. Numune su içindeyse, deneylerin bir su bastırma bileşenine sahip olması gerekir. Bu, en verimli şekilde gradyanlar19 kullanılarak gerçekleştirilir. Bu durumda, Hα hidrojenleri ile ve Hα hidrojenleri arasında etkileşimler elde etmek için numunenin bir kez atandıktan sonra saf D2O'da yeniden çalıştırılması avantajlıdır.
    4. Spin difüzyonunda minimum kayıpla maksimum sinyal oluşumunu bulmak için bir dizi kısa deney yaparak TOCSY ve NOESY veya ROESY karıştırma sürelerinin süresini optimize edin. Bunun, birikme eğrisinin doğrusal bölgesi olduğundan emin olun. 600 MHz alanlarındaki peptitler için yaygın olan değerler, TOCSY için yaklaşık 100 msn ve NOESY veya ROESY deneyleri için 150 msn karıştırma sürelerini içerir.
    5. Numune bileşiminin veri toplama boyunca sabit kaldığından emin olmak için her deney arasında 1B deneyler yapın (Şekil 7).
  4. Minimum sinyal gücü kaybıyla maksimum çözünürlük elde etmek için uygun apodizasyon fonksiyonlarını kullanarak spektrumları işleyin ve t1 boyutunda sıfır dolgu ekleyin.
    1. İkinci dereceden bir polinom fonksiyonu ile F2 ve ardından F1 boyutundaki taban çizgisini daha da düzeltin.
    2. Spektrumların kimyasal kaymasını, bilinen standartlardan (sırasıyla TMSP veya TMS) kaymalarına göre ilgili çözücülerdeki artık su veya DMSO tepe noktalarına göre dikkatlice kalibre edin.

3. SPARKY20 Kullanarak Tepe Atama ve Entegrasyon

  1. NOESY veya ROESY spektrumu üzerine yerleştirilmiş bir dizi COSY ve TOCSY spektrumu hazırlayın (Şekil 8).
  2. Spektrumdaki tüm NOE tepe noktalarını Wüthrich21 tarafından geliştirilen sıralı atama metodolojisine göre atayın.
    1. Parmak izi bölgesindeki TOCSY sinyalleriyle örtüşen tepe noktaları atamakla başlayın, çünkü bu, SPARKY programıyla sonraki tepe atama girişlerini kolaylaştıracaktır (Şekil 9). Atamayı kaydedin kimyasal kayma (Şekil 10) ve 3JHNHα değeri (Şekil 11).
  3. Tepeleri mesafe kısıtlamalarına ve 3JHNHα değerlerini dihedral açılara çevirin.
    1. Bu, tepe noktalarını program içinden entegre ederek ve bunları bilinen mesafenin bir etkileşimini kullanarak (metilen grubunun iki protonu arasındaki mesafe veya bir aromatik amino asidin aromatik hidrojen atomları gibi) mesafe kısıtlamalarına çevirerek yapılabilir.
    2. Tepe noktaları çakışıyorsa ve entegrasyon yöntemleri kullanılamıyorsa, görsel tahminle güçlü-orta-zayıf-çok zayıf olarak etiketlenebilirler ve bu tanımlamalar sırasıyla 2.5, 3.5, 4.5 ve 5.5 Å'ye kadar olan mesafelere çevrilebilir. Bu, peptitlerle yapılan çalışmalarda en etkili olmaktır.
    3. 3JHNHα değerleri, verilen kuplaj değerlerinin çoğunun birden fazla dihedral açıdan kaynaklanabileceği Karplus denklemine göre dihedral açıların göstergesidir. Bunlar, ikincil yapının (sarmallar veya tabakalar), rastgele bobinin veya bunların konformasyonel ortalamalarının göstergesi olabilir. Bu nedenle, kısıtlamaları dikkatli bir şekilde kullanmak veya bunları uygun sonuçların teyidi olarak kullanmak önemlidir.

4. XPLOR22 Kullanarak Yapı Topluluğu Oluşturmak için Moleküler Mekanik Hesaplamaları

  1. Mesafe kısıtlamalarını ve dihedral açıları XPLOR için doğru formatla içe aktarın. (Şekil 12, yalnızca kalıntılar arası kısıtlamalar). XPLOR, deneysel olarak bulunan mesafe kısıtlamalarına ek olarak, yukarıdaki parametrelerin hiçbirinin ihlal edilmediği bir topluluk oluşturmak için bağ uzunlukları, açılar, kiralite vb. gibi kanonik geometrik kimyasal kısıtlamalara uyan yapıları bulmak için konformasyonel alanı arayacaktır. Bu, başlangıç topluluğunu oluşturacaktır.
  2. İlk yapı belirleme çalışması, metal üzerinde herhangi bir kısıtlama kullanılmadan yapılacaktır. Bu, hangi kalıntıların herhangi bir önyargı olmaksızın metal bağlamaya katıldığını gösterecektir. Adım 4.4'e atlayın.
  3. NMR'den türetilen mesafe kısıtlamalarına ek olarak, belirlenen kalıntılara metal bağlama kısıtlamaları ekleyin.
    1. Metal iyonunu ve topolojisini tanımlamak için uygun parametreler ekleyin.
    2. Uygun fiziksel bilgiler (kütle, diğer atomlarla bağ uzunlukları, açılar ve bağlanmayan itme parametreleri) parametre dosyasına konulmalıdır.
    3. Bağlama bilgilerini topoloji dosyasına ekleyin: Hangi bağların oluştuğu ve kırıldığı ve bağlama sonucunda hangi resmi yüklerin değiştirildiği.
  4. Genellikle 10 üyeden oluşan küçük bir topluluk oluşturun.
    1. Omurgadan omurgaya etkileşimlerden başlayarak, ardından omurgadan yan zincire, ardından yan zincirden yan zincire etkileşimlerden ve artık içi, sıralı etkileşimlerden giderek daha uzun aralıklı etkileşimlere geçerek kısıtlamaları kademeli olarak tanıtın. Bu, atamadaki hataların belirlenmesini kolaylaştırır.
    2. NOE enerjisini, 50 kcal/mol•Å2 sabit kuvvet sabiti olan bir kare kuyu potansiyeli olarak tanıtın. Simüle edilmiş tavlama, 1.500 K'da 1.500 3 fsec adımla ve 3,000 K'ya soğutma sırasında 1 500 fsec adımla yapılmalıdır. Son olarak, 4.000 yineleme için eşlenik gradyan enerji minimizasyonu kullanarak yapıları en aza indirin; bunlar XPLOR içinde değiştirilebilen değişkenlerdir.
  5. Genellikle 50 üyeden oluşan son bir topluluk oluşturun. Adım 4.4'ten itibaren tüm toplulukta adımları gerçekleştirin.
    1. Şekil 13'te gösterildiği gibi, bulunan her bir NOE etkileşimi türünün sayısını bildirin.
  6. Kanonik kimyasal geometriye ve ampirik NMR'den türetilmiş kısıtlamalara uyan bir yapılar topluluğu oluşturun.
    1. Toplam konformasyon sayısını, NMR'den türetilen kısıtlamaları ihlal edenlerin sayısını ve hem omurga hem de tüm ağır atom RMSD değerleri olmak üzere tüm topluluğun RMSD'sini bildirin.

5. Yapı Analizi

  1. Çözülmüş topluluk, NMR ölçümü sırasında peptit tarafından benimsenen konformasyonel boşluğu temsil eder. Yerel esneklik, molekülün farklı bölgelerinde değişebilir ve bu, yapısal veya işlevsel nedenlere bağlanabilir (yapısal analizin amacı, stabilite ve etki mekanizması için yapısal temeli belirlemektir).
    1. Bir başlangıç topluluğu oluşturmak için yapının tüm konformasyonlarını MolMol programına23 aktarın (Şekil 14).
  2. Molekülün yerel stabilitesini belirlemek için topluluğu inceleyin.
    1. Omurga ve yan zincir RMSD değerlerini, dizi boyunca sonraki dört kalıntı bölgesini seçerek ve programın RMSD'yi en düşük enerji yapısına veya ortalamaya kadar hesaplamasını sağlayarak belirleyin.
    2. Yerel RMSD'yi dizinin bir fonksiyonu olarak çizerek molekülün hangi bölgelerinin yerel stabilite gösterdiğini belirleyin (Şekil 15).
    3. Topluluğu molekülün bu bölgesi boyunca kaplayın ve daha fazla analiz için bu topluluğu kullanın (Şekil 16).
  3. NMR'den türetilen kısıtlamalara (ihlal edilmemiş) uyan düşük enerjili konformasyonları seçin. Bunlar "düşük enerji topluluğunu" oluşturacaktır.
    1. Topluluktaki konformasyonların sayısını, bunları seçme kriterlerini ve adım 4.6.1'de tanımlandığı gibi RMSD değerlerini bildirin.
    2. Metal ciltleme modu zaten belirlenmişse, bir sonraki adıma geçin. Aksi takdirde: Düşük enerji grubunu analiz edin ve metal iyonunu bağlayabilmek için hangi kalıntı yan zincirlerinin birbirine doğru yakınlıkta olduğunu belirleyin. Bunlar belirlendikten sonra, adım 3.3'e geri dönün ve bakır bağlama verileri de dahil olmak üzere analizi yeniden yapın (topluluk için Şekil 17 ve düşük enerjili konformer için Şekil 18).
  4. Topluluğu inceleyin ve MolMol programının varsayılan arama parametrelerini kullanarak molekül içindeki yerel ikincil yapıyı belirleyin. İkincil yapılar hidrojen bağı ile tutulur ve molekülün kararlı bölgelerini gösterir.
    1. Her bir konformerin ikincil yapısını belirleyin (Şekil 19).
      1. Her ikincil yapıyı gösteren topluluğun konformerlerinin yüzdesini gösteren bir tablo oluşturun.
      2. İkincil yapı bölgelerinin, local-RMSD tarafından kararlı bölgeler olarak belirlenen bölgelerle örtüşüp örtüşmediğini belirleyin. Bu genellikle böyledir.
  5. Molekül içindeki mesafeleri ve hidrojen bağını belirleyin.
    1. Topluluğu Chimera24'e aktarın.
    2. Metal bağlanmasından şüphelenilen atomlar arasındaki molekül içi mesafeleri belirlemek için Chimera'yı kullanın. Topluluktaki ortalama mesafeleri hesaplayın.
    3. Programın varsayılan gevşemiş hidrojen bağı parametrelerini (%20 oranında) kullanarak, topluluğun her bir konformerindeki molekül içi hidrojen bağlarını belirlemek için Chimera'yı kullanın.
    4. Her bir hidrojen bağını gösteren topluluğun konformerlerinin yüzdesinin bir tablosunu oluşturun. Konformasyonların çoğunda tekrarlayan hidrojen bağları, yapının stabilitesine katkıda bulunan kararlı bir bağı gösterir.
  6. Molekül içindeki elektrostatik etkileşimleri belirleyin.
    1. Yüklü yan zincirler arasındaki etkileşimleri belirleyin.
    2. Her elektrostatik etkileşimi gösteren topluluğun konformerlerinin yüzdesini gösteren bir tablo oluşturun.
  7. Delphi 26 programı içindeki Amber25 kuvvet alanını kullanarak elektrostatik potansiyel dağılımını hesaplayın.
    1. Elektrostatik potansiyel hesaplamalarının gerçekleştirileceği topluluktan tek bir temsili konformasyon seçin.
    2. Poisson-Boltzman denklemini ve tam bir Coulombic hesaplamasını kullanarak elektrostatik potansiyel türetin. Gerekli parametreler arasında çözeltinin iyonik kuvveti, çözeltinin dielektrik değerleri (su için 80; DMSO için 40); iç peptit (genellikle 5.0 civarında); ızgaranın boyutu (genellikle 65'65'65 puan); ve peptit ile ızgaranın kenarı arasındaki minimum mesafe (10 Å). Sonuçlar genellikle bu değerlere göre oldukça sağlamdır, çünkü ana sonuç peptidin kendisi tarafından yönetilir (Şekil 21).
    3. Peptitin Van der Waals yüzeyine eşlenen elektrostatik potansiyeli inceleyin (Şekil 22).
    4. Aynı potansiyele sahip pozisyonları tanımlayan elektrostatik potansiyel izo yüzeylerini inceleyin. Diğer proteinleri veya ligandları çekebilecek veya itebilecek genişletilmiş pozitif veya negatif yüzeyler gibi biyolojik alaka düzeyini gösteren izo yüzeyleri veya amfipatik dağılım veya farklı özelliklere sahip yamalar gibi anlamlılık gösteren dağılımları bulun (Şekil 23).
  8. Birbirlerini nasıl güçlendirdiklerini görmek için tüm yapısal bulguları toplayın.
  9. İlgili yerlerde 4.3-5.7.4 adımlarını tekrarlayın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bakır bağlayıcı protein modelleri üzerine devam eden bir çalışmanın parçası olarak, doğrusal peptit MTCSGCSRPG içindeki korunmuş dizi MT/HCXXC'nin yapısı, çözelti durumu NMR ile belirlendi. Peptit, inert ortamda CuCl ile reaksiyona sokuldu ve pH, evrensel bir çubukla ~ 3.0 olarak ölçüldü. Peptitin amid bölgesi, bakır ile reaksiyona girdikten sonra 6.7-8.5 ila 6.6-9.0 ppm arasında bir genleşme gösterdi (Şekil 2). Hafif bakır oksidasyonu nedeniyle hat genişlemesi, taban çizgisinde belirgindir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yapısal bilginin bağlanma mekanizmalarını anlamaya katkısı iyi kabul edilmektedir. Peptitler, protein bağlanması ve etkileşimleri için modeller olarak faydalıdır; ancak yapı belirleme için ana yöntem olan X-ışını kristalografisine uygun değildirler. NMR, yapılar çözelti içinde kolayca çözülebildiğinden, bu sistemler için özellikle yararlıdır. Bu, özellikle metal iyonunun oksidasyonunu önlemek için inert bir ortam altında ek olarak yapı belirleme gerektiren metalloşaperon mimetikleri için geçerlidir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, rekabet eden hiçbir mali çıkarları olmadığını beyan ederler.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mali destek için Human Frontier Science Program'a (Genç araştırmacı hibesi (RGY)0068-2006) teşekkür ederiz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Avance DMX 600 MHz SpektrometreBruker
NMR numune tüpleri Wilmad535-PP
Torpido gözüMBraunLM05-019
Liyofilizatör   VirTistezgah üstüK
PeptidBioChemiaÖzel yapım>%95 saflıkta
Bakır (1) klorürAldrich224332
Hidroklorik asitBioLab231-595-7
Sodyum hidroksitGadot1310-73-2
d6-DimetilsülfoksitAldrich236926
Döteryum oksitAldrich151882

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Robinson, J. A. Protein epitope mimetics as anti-infectives. Curr. Opin. Chem. Biol. 15, 379-386 (2011).
  2. Huffman, D. L., Function O'Halloran, T. V. structure, and mechanism of intracellular copper trafficking proteins. Annu. Rev. Biochem. 70, 677-701 (2001).
  3. Tapiero, H., Townsend, D. M., Tew, K. D. Trace elements in human physiology and pathology. Copper. Biomed., & Pharmacotherapy. 57, 386-398 (2003).
  4. Boal, A. K., Rosenzweig, A. C. Structural Biology of Copper Trafficking. Chem. Rev. 109, 4760-4779 (2009).
  5. Rubino, J. T., Franz, K. J. Coordination chemistry of copper proteins: How nature handles a toxic cargo for essential function. J. Inorg. Biochem. 107, 129-143 (2012).
  6. Wernimont, A. K., Huffman, D. L., Lamb, A. L., O'Halloran, T. V., Rosenzweig, A. C. Structural basis for copper transfer by the metallochaperone for the Menkes/Wilson disease proteins. Nat. Struct. Biol. 7, 766-771 (2000).
  7. Singleton, C., Hearnshaw, S., Zhou, L., Le Brun, N. E., Hemmings, A. M. Mechanistic insights into Cu(I) cluster transfer between the chaperone CopZ and its cognate Cu(I)-transporting P-type ATPase, CopA. Biochem. J. 424, 347-356 (2009).
  8. Hearnshaw, S., et al. A Tetranuclear Cu(I) Cluster in the Metallochaperone Protein CopZ. Biochem. 48, 9324-9326 (2009).
  9. Shoshan, M. S., Tshuva, E. Y. The MXCXXC class of metallochaperone proteins: model studies. Chem. Soc. Rev. 40, 5282-5292 (2011).
  10. Shoshan, M. S., et al. NMR characterization of a Cu(I)-bound peptide model of copper metallochaperones: Insights on the role of methionine. Chem. Comm. 47, 6407-6409 (2011).
  11. Schmitt, W., Zanotti, G., Wieland, T., Kessler, H. Conformation of different S-deoxo-Xaa(3)-amaninamide analogues in DMSO solution as determined by NMR spectroscopy. Strong CD effects induced by beta I, beta II conformational change. J. Am. Chem. Soc. 118 (3), 4380-4387 (1996).
  12. Behrens, S., Matha, B., Bitan, G., Gilon, C., Kessler, H. Structure-activity relationship of the ring portion in backbone-cyclic C-terminal hexapeptide analogs of substance P - NMR and molecular dynamics. Int. J. Peptide and Protein Res. 48, 569-579 (1996).
  13. Overview TopSpin NMR - Software for NMR Data Analysis and NMR Spectra Data Procession | Bruker Corporation [Internet]. , Bruker Corporation. Available from: http://www.bruker.com/products/mr/nmr/nmr-software/software/topspin (2013).
  14. Aue, W. P., Bartholdi, E., Ernst, R. R. 2-Dimensionsl spectroscopy- application to nuclear magnetic resonance. J. Chem. Phys. 64, 2229-2246 (1976).
  15. Bax, A., Davis, D. G. MLEV-17-based two-dimensional homonuclear magnetization transfer spectroscopy. J. Magn. Reson. 65, 355-360 (1985).
  16. Kumar, A., Ernst, R. R., Wüthrich, K. A two-dimensional nuclear overhauser enhancement (2D NO) experiment for the elucidation of complete proton-proton cross-relaxation networks in biological macromolecules. Biochem. Biophys. Res. Comm. 95, 1-6 (1980).
  17. Bax, A., Davis, D. G. Practical aspects of two-dimensional transverse NOE spectroscopy. J. Magn. Reson. 63, 207-213 (1985).
  18. Williamson, M. P. Chapter 3 Applications of the NOE in Molecular Biology. Annu. Reports on NMR Spectroscopy. 65, 77-109 (2009).
  19. Piotto, M., Saudek, V., Sklenar, V. Gradient-tailored excitation for single-quantum NMR-spectroscopy of aqueous solutions. J. Biomol. NMR. 2, 661-665 (1992).
  20. Sparky - NMR Assignment Program. , Available from: http://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky (2008).
  21. Wüthrich, K. NMR of proteins and nucleic acids. , J. Wiley & Sons Inc. (1986).
  22. Nilges, M., Kuszewski, J., Brünger, A. T. Comp. aspects study biol. macromol. by NMR. , Plenum Press. (1991).
  23. Koradi, R., Billeter, M., Wüthrich, K. MOLMOL: A program for display and analysis of macromolecular structures. J. Molecular Graphics. 14, 51(1996).
  24. Pettersen, E. F., et al. UCSF chimera - A visualization system for exploratory research and analysis. J. Computational Chem. 25, 1605-1612 (2004).
  25. Pearlmen, D. A., et al. AMBER, a package of computer programs for applying molecular mechanics, normal mode analysis, molecular dynamics and free energy calculations to simulate the structural and energetic properties of molecules. Comp. Phys. 91, 1-41 (1995).
  26. Honig, B., Sharp, K., Yang, A. S. Macroscopic models of aqueous solutions- biological and chemical applications. J. Phys. Chem. 97, 1101-1109 (1993).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Peptide metal ComplexesNMR SpectroscopyCopper BindingStructure Determination1D NMR2D NMRPeak AssignmentDistance ConstraintsMolecular MechanicsLow Energy Ensemble

Related Articles