Hata Düzeltmesi: Bıçak Kenarı Tarama Mikroskopisi için Numune Hazırlama, Görüntüleme ve Analiz Protokolleri

Özet

Bıçak Kenarı Taramalı Mikroskopi için Numune Hazırlama, Görüntüleme ve Analiz Protokolleri üzerinde bir düzeltme yapılmıştır. Nissl boyama protokolünde önemli modifikasyonlar gerçekleştirilmiştir.

Özet

Bıçak Sırtı Tarama Mikroskopisi için Numune Hazırlama, Görüntüleme ve Analiz Protokolleri başlıklı makalede bir düzeltme yapılmıştır. Nissl boyama protokolünde önemli değişiklikler gerçekleştirilmiştir.

Protokol

Bıçak Kenarı Tarama Mikroskopisi için Numune Hazırlama, Görüntüleme ve Analiz Protokolleri başlıklı çalışmada bir düzeltme yapılmıştır. Nissl boyama protokolü şu şekilde değiştirilmiştir:

2. Numune hazırlama: Nissl

1. Fare, intraperitoneal olarak enjekte edilen ketamin ve ksilazin ile derin anestezi altına alınır; ardından oda sıcaklığında 50 mL fosfat tamponlu salin (pH 7.4), ardından oda sıcaklığında 250 mL %10 nötral tamponlu formalin (pH 7.4) ve son olarak 3.0 cc seyreltilmemiş çini mürekkebi kullanılarak transkardiyak perfüzyonu yapılır.
2. Kardiyovasküler sistemdeki kanın temizlenmesi ve dokuların fikse edilmesi için salin ve fiksatif ile tüm vücut perfüzyonu gereklidir. Kardiyovasküler sistemin damarsal yapısının tamamen doldurulması için çini mürekkebi ile perfüzyon gereklidir.
3. Elde edilen beyin, ardından bir dizi dereceli etil alkol (%25-%100) ileyerek dehidre edilir ve yukarıdaki 1.8-1.9'daki protokol izlenerek araldite plastiğe gömülür. Eğer gömme ortamı olarak LR white kullanılıyorsa, yukarıdaki 1.10'daki protokol izlenir.
4. Fare, intraperitoneal olarak enjekte edilen ketamin ve ksilazin ile derin anestezi altına alınır; ardından oda sıcaklığında 50 mL fosfat tamponlu salin (pH 7.4), ardından oda sıcaklığında 250 mL %10 nötral tamponlu formalin (pH 7.4) ve son olarak 3.0 cc seyreltilmemiş çini mürekkebi kullanılarak transkardiyak perfüzyonu yapılır.
5. Kardiyovasküler sistemdeki kanın temizlenmesi ve dokuların fikse edilmesi için salin ve fiksatif ile tüm vücut perfüzyonu gereklidir. Kardiyovasküler sistemin damarsal yapısının tamamen doldurulması için çini mürekkebi ile perfüzyon gereklidir.
6. Elde edilen beyin, ardından bir dizi dereceli etil alkol (%25-%100) ileyerek dehidre edilir ve yukarıdaki 1.8-1.9'daki protokol izlenerek araldite plastiğe gömülür. Eğer gömme ortamı olarak LR white kullanılıyorsa, yukarıdaki 1.10'daki protokol izlenir.
7. Fare, intraperitoneal olarak enjekte edilen ketamin ve ksilazin ile derin anestezi altına alınır; ardından oda sıcaklığında 50 mL fosfat tamponlu salin (pH 7.4), ardından oda sıcaklığında 250 mL %10 nötral tamponlu formalin (pH 7.4) ve son olarak 3.0 cc seyreltilmemiş çini mürekkebi kullanılarak transkardiyak perfüzyonu yapılır.
8. Kardiyovasküler sistemdeki kanın temizlenmesi ve dokuların fikse edilmesi için salin ve fiksatif ile tüm vücut perfüzyonu gereklidir. Kardiyovasküler sistemin damarsal yapısının tamamen doldurulması için çini mürekkebi ile perfüzyon gereklidir.
9. Elde edilen beyin, ardından bir dizi dereceli etil alkol (%25-%100) ileyerek dehidre edilir ve yukarıdaki 1.8-1.9'daki protokol izlenerek araldite plastiğe gömülür. Eğer gömme ortamı olarak LR white kullanılıyorsa, yukarıdaki 1.10'daki protokol izlenir.

şuna:

2. Numune hazırlama: Nissl

1. Bu protokol, Mayerich ve ark. tarafından sunulan protokolü yakından takip etmektedir⁷
2. Fare, intraperitonal olarak enjekte edilen ketamin ve ksilazin kullanılarak derinlemesine anesteziye alınır; ardından oda sıcaklığındaki 50 mL fosfat tamponlu salin (pH 7.4) ve bunu takiben 250 mL soğuk %4 fosfat tamponlu paraformaldehit (pH 7.4) ile transkardiyak perfüzyonu gerçekleştirilir.
3. Fare daha sonra deiyonize su içinde %0.1 thionin boyası içeren 100 mL'lik bir çözelti ile perfüze edilir ve gövdesi 24 saat boyunca buzdolabına (4 °C) yerleştirilir.
4. 24 saat sonra beyin, kalvaryumdan çıkarılarak taze %0.1 thionin çözeltisine yerleştirilir ve 7 gün boyunca 4 °C'de bekletilir. Bu prosedürün uzun süreli olması, thionin'in en bloc preparata tam olarak sızmasını sağlamak içindir.
5. Beyin daha sonra, %50 etanol ve su ile başlayıp 6 haftalık bir süre zarfında %100 etanole kadar artan dereceli bir etanol serisi aracılığıyla boyası giderilir ve dehidre edilir. %50'den %70'e kadar olan etanol değişimleri buzdolabında (4 °C) saklanır ve %70'in üzerindeki tüm etanol değişimleri oda sıcaklığında saklanır.
6. Üç kez aseton değişimi yapıldıktan sonra (oda sıcaklığında her çözeltide 2-4 gün), beyin yukarıdaki 1.8-1.9'daki protokole uygun olarak araldite plastiğe gömülür. Eğer gömme ortamı olarak LR white kullanılıyorsa, yukarıdaki 1.10'daki protokol uygulanır.