Diğer T hücresi alt kümelerinin farklı efektör işlevleri ile, Th17 hücreleri merkezi inflamatuar otoimmün implike edilmiştir. Bu in vitro Th17 farklılaşma protokolü naif CD4 + T lenfositleri Th17 hücrelerine ayırt edebilir, ve daha fazla otoimmün ve konak cevabı rollerini incelemek belirlemek için bir araç sağlar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
İzolasyon ve naif CD4 T Lenfositler Th17 Farklılaşma
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Th17 hücreleri 17 (IL-17), interlökin üretmek için tespit edilmiştir T hücrelerinin bir alt kümesi ayrı olan ve Th1, Th2 ve düzenleyici T hücreleri dahil olmak üzere, diğer T hücre alt ikinci fonksiyon farklıdır. Th17 hücreler çok oto-bağışıklık hastalıkları ile ilişkili çok istekli inflamatuar immün cevapların merkezi bir suçlu olarak ortaya çıkmıştır. Bu yöntemde biz C57BL / 6 farelerinin dalak ve lenf düğümleri T lenfositleri arındırmak ve kontrol ve Th17 uyaran ortamlarda saflaştırılmış CD4 + T hücrelerini teşvik eder. Th17 uyaran ortam anti-CD3 ve anti-CD28 antikorları, IL-6 ve TGF-β varlığında uyarımı içerir. En az 72 saat süre ile inkübe edildikten sonra ve 37 ° C'de en fazla beş gün boyunca, hücreler daha sonra sitometrisi, QPCR, ELISA ve akış boyunca IL-17 üretmek için yeteneği açısından analiz edilir. Th17 farklılaşmış CD4 + CD25-T hücreleri daha Th17 hücreleri otoimmün ve ev sahibi de başlangıcı ve ilerlemesinde oynadığı rolü aydınlatmak için kullanılabilirfense. Ayrıca, farklı kemirgen nakavt / hastalık modellerinde CD4 + CD25-lenfosit Th17 farklılaşma hücre kaderi plastisite anlamamıza katkıda bulunabilir.
Giriş
CD4 + T lenfositler (T hücreleri), bulaşıcı mikroorganizmalara karşı bağışıklık sistemi aracılı savunma önemli bir rol oynamaktadır. Tersine, T-hücreleri, aynı zamanda iyice bu tip 1 diyabet, sistemik lupus eritematozus, romatoid artrit gibi otoimmün hastalıkların başlaması ve ilerlemesi ile ilişkilidir. CD4 + T lenfositleri, T hücresi reseptörü kognat antijeni / majör histokompatibilite kompleksi II (MHC II) molekülleri ile (TCR) etkileşimlerinin bir kombinasyonu ile aktif hale gelir ve B7.1/B7.2 ile CD28 reseptör etkileşimleri 15 ligandları. TCR ve CD28 uyarımı ko-stimülasyon sağlanmasına ek olarak, antijen sunan hücreler de bu şekilde belirli bir antije....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm hayvan kullanımı Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanan protokoller uyarınca gerçekleştirilmiştir.
1.. Karışımları ve Medya hazırlanması
- Steril PBS pH 7.3 (1 L)
0.23 g NaH 2 PO 4
1.15 g Na 2 HPO 4
9.0 g NaCl
DI su ile sesini alın. Otoklav ile sterilize edin. - Hücre Kültürü Ortamı (100 mi)
89 ml RPMI
10 mi% 10 FBS
1 ml antibiyotik antimikotik (ABAM) 100 ug, 50 mM 2-merkaptoetanol (96.5 ug PBS'ye 3,5 ug stok 2-merkaptoetanol) - , Steril PBS ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu Th17 farklılaşma protokol dalak kaldırılması ve aksiller, brakiyal, mezenterik, servikal ve kasık lenf düğümleri ile başlar. Her yerlerinin bir gösterimi, Şekil 2 ve 3 de bulunabilir. Şekiller 1 ve 5 de bu protokolde tarif edilen yöntemlere görsel bir gösterimini sağlar.
Bu Th17 protokol CD4 + CD25-T lenfosit nüfus farklılaşma üzerinde duruluyor. Bu autoMACS Pro Hücre ayırma havuza alınan toplam lenf nodu ve dalak
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada in vitro Th17 farklılaşma ulaşmak için protokol tanımlanmıştır. T farklılaşma insan patojenleri 13 etkin bir şekilde ortadan kaldırılması için kritik olan Th17 alt kümesi içine lenfositler gibi Th17 farklılaşma çalışma önemlidir. Tersine, IL17 üretim otoimmün hastalık ilerlemesi 13 ile ilişkilendirilmiştir. Bu, bağışıklık düzenleme ve otoimmünitenin çok sayıda farklı kemirgen modelleri için uygulanabilir olarak Th17 farklılaşma gibi bir yöntem birçok araştırma ayarları için geçerlid.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Ilan etmek hiçbir açıklama.
Teşekkürler
Bu çalışma Florida TL1 TR000066 ve UL1 TR000064, Ulusal Sağlık Enstitüsü, BD Biosciences reaktif hibe Veli Grant R01AI056152 bir çeşitlilik takviyesi Üniversitesi NIH / NCATS Klinik ve Translasyonel Bilim Ödülleri ve Üniversite tarafından kısmen desteklenen Florida.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Reagent/Material | |||
| Steril Poliester Petri Kabı | Fisher Scientific | 0875713A | 60 mm x 15 mm |
| autoMACS Çalıştırma Tamponu | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Premium Mikroskop Slaytları, Buzlu | Fisher Scientific | 12-544-3 | 3" x 1"1 mm |
| 5 ml 21G1 Lateks İçermeyen Şırınga ve İğne | BD Biosciences | 309632 | |
| Corning 15 ml Santrifüj Tüpleri | Sigma-Aldrich | CLS430791 | |
| Naylon 40 mikron | Miami Su Ürünleri | Naylonu 40/26 | |
| Microtest doku kültürü plakası 96 kuyu U alt | BD Biosciences | 35-3077 | |
| Corning Costar 24 kuyulu hücre kültürü plakaları | Sigma-Aldrich | CL3524 | |
| Eppendorf Tüpleri 1.5 ml | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Saflaştırılmış NA/LE Hamster Anti-Fare CD3e | BD Biosciences | 553057 | |
| Saflaştırılmış NA/LE Hamster Anti-Fare CD28 | BD Biosciences | 553294 | |
| Fare IL-6 Rekombinant Protein | eBioscience | 14-8061-62 | |
| TGFbeta | R& D Sistemleri | 240-B-002 | |
| Tripan mavisi çözeltisi 0.4 | Sigma-Aldrich | 66H2364 | |
| Pac Mavi Sıçan Anti-Fare CD4 | BD Biosciences | 558107 | |
| APC Sıçan Anti-Fare CD8a | BD Biosciences | 553035 | |
| PE Konjuge Anti-fare CD25 | eBioscience | E01155-516 | |
| Alexa Fluor 700 Sıçan Anti-fare IL-17 | BD Biosciences | 560820 | |
| Hücre İçi Sitokin Boyama Başlangıç Kiti-Fare | BD Biosciences | 51-2041AK (559311) | |
| MACS CD4+CD25+ düzenleyici T hücre izolasyon kiti, fare | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| ABAM | Cellgro | 30-004-CI | |
| RPMI | Corning, Cellgro | 10-040-CM | |
| B 2-Mercapt– thanol | MP Biyomedikal | 194834 | Tehlikeli |
| Phorbol 12-Myristat 13-Asetat (PMA) | |||
| İyonomisin Kalsiyum Tuzu | Sigma-Aldrich | 13909-1ML | Tehlikeli |
| Brefeldin A (BFA) | MP Biyomedikal | 159027 | |
| ELISA IL-17A Yakalama mAb | BD Biosciences | 555068 | |
| ELISA IL-17A Algılama mAb | BD Biosciences | 555067 | |
| ELISA IL-17A Standardı | eBioscience | 14-8171-80 | |
| IL-2 ELISA Kiti | BD Biosciences | 555148 | |
| TMB Substrat Reaktif Seti | BD Biosciences | 555214 | |
| Equipment | |||
| autoMACS Pro Hücre Ayırıcı | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| Sorvall Legend RT + Santrifüj | ThermoScientific | ||
| Napco serisi 8000 WJ CO2 İnkübatör | ThermoScientific | ||
| PTC-200 Peltier Termal Döngüleyici | Biorad |
Kaynaklar
- Chen, Z., Lin, F., et al. Foxp3 and RORγT: transcriptional regulation of Treg and Th17. International Immunopharmacology. 11, 536-542 (2011).
- Cua, D. J., Sherlock, J., et al. Interleukin-23 rather than interleuk....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
