Yöntem makalesi

Hücresel Dielektrik Spektroskopisi kullanarak İdiopatik Skolyoz Prognostik Tahmininde Hücre-tabanlı Deney Protokolü

DOI:

10.3791/50768

⸱

16 Ekim 2013

 ,  , 
1Viscogliosi Laboratory in Molecular Genetics of Musculoskeletal Diseases, Sainte-Justine University Hospital Research Center, 2Department of Stomatology, Faculty of Dentistry and Department of Biochemistry, Faculty of Medicine, Université de Montréal

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bir yapılandırılmış protokol hücresel dielektrik spektroskopi (CDS) kullanarak idiopatik skolyoz prognozu tahmin etmek için bir fonksiyonel test olarak bir hücre bazlı deney için sunulmuştur. Deney, taze ya da dondurulmuş periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMC) ile yapılabilir ve prosedür 4 gün içinde tamamlanır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol asemptomatik ve etkilenen çocuklarda idiopatik skolyoz prognozu tahmin etmek için fonksiyonel bir test olarak laboratuvarda geliştirilen bir hücre bazlı tahlil için deneysel ve analitik yordamı ayrıntıları. Deney üç fonksiyonel grup (FG1 içine bir otomatik CDS tabanlı alet, ve çocukların sınıflandırması kullanılarak, hücresel dielektrik spektroskopisi (CDS) periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC) in Gi ve Gs proteinlerinin fonksiyonel durumunun değerlendirilmesi oluşmaktadır Gi ve Gs proteinleri uyarılmaya yanıt derecesi arasında dengesizlik profili ile ilgili olarak, FG2, FG3). Sınıflandırma ayrıca grupları ve hastalığın ciddi bir ilerleme FG2 tarafından başvurulan arasında Gi uyarılmasına yanıt osteopontin (OPN) ayırıcı etkisi ile teyit edilir. Yaklaşık olarak, kanın 10 ml 'lik bir hacim Ficoll-gradyanı sağlamakta ve hücreler tarafından PBMC elde etmek için gerekli olan daha sonra sıvı azot içinde saklanır. P yeterli sayıdaBMCS deneyi gerçekleştirmek için hücre kültür iki gün sonra elde edilir. Esasen, hücreler önce phytohemmaglutinin (PHA) ile inkübe edilir. 24 Saat inkübe edildikten sonra, ortam önce hücre tohumlama ve OPN tedavisine ilave bir 24 saat boyunca bir PHA-içermeyen kültür ortamı ile değiştirilir. Hücreler daha sonra, spektroskopik olarak, sırasıyla, aynı kökenli reseptörleri aracılığıyla Gi ve Gs proteinleri aktive somatostatin, izoproterenole yanıtları için taranır. Somatostatin isoproterenol ve her ikisi de eş zamanlı olarak entegre bir akar bilimi sistemine enjekte edilir ve hücrelerin tepkileri, 15 dakika süre ile izlenir. Deney, taze ya da dondurulmuş PBMC ile yapılabilir ve prosedür 4 gün içinde tamamlanır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İdiopatik skolyoz genellikle vertebra rotasyon 1 eşliğinde 10 dereceden daha büyük bir yanal eğrilik olarak tanımlanan nedeni bilinmeyen bir omurga deformitesi olduğunu. Durum pediatrik nüfusun% 4 etkiler ve en sık 9 ila 13 yaşındaki 2,3,4 yaşları arasında teşhis edilir. Tanı öncelikle dışlanmanın ve sadece bu vertebra malformasyon, nöromüsküler veya sendromik bozukluklar gibi omurga deformitesi diğer nedenleri ekarte edildikten sonra yapılır. Geleneksel olarak, trunkal asimetri Adams öne eğilme testi ile saptandı ve fiziksel muayene sırasında 5 scoliometer ile ölçülür. Tanı sonra radyografik eğrinin gözlenmesi ve Cobb yöntem 6 kullanılarak açı ölçümü ile teyit edilebilir.

Bir kez tanı, scoliotic çocukları yönetmek hekimler için birincil endişe eğrisi ilerleme olup olmadığıdır. Gerçekten de, eğri ilerleme genellikle önceden tahmin edilemez vedaha sık kızlar arasında görülen erkek 7 daha hızlıdır. Eğer tedavi edilmezse, eğri önemli fiziksel deformite ve hatta kardiyopulmoner sorunlar yaratarak, dramatik ilerleyebilir. Bu bulgular eğrisi 70 ° 8,9 aştığında hayatı tehdit haline gelir. Eğri ilerlemesini engellemek ya da durdurmak için mevcut tedavi seçenekleri canlandırıcı ve cerrahi içerir. Cerrahi eğrileri 45 ° den büyük ya da takviye yanıtsız için ayrılmış ise, genel olarak, takviye 25-40 ° arasında eğrileri için tavsiye edilir.

Yaklaşık olarak, idiopatik skolyoz tanısı alan çocukların% 10 düzeltici cerrahi gerektiren 10 eğri ilerlemesini var. Şu anda, hiçbir kanıtlanmış bir yöntem ya da bu hasta kategorisini tanımlamak için kullanılabilir bir test yoktur. Sonuç olarak, tüm teşhis çocuklar iskelet olgunluğuna ulaşmak genellikle kadar, birkaç yıl içinde birden fazla radyograma tabi tutulur. Skolyoz ile tipik hastalarda olacağı tahmin edilmektedir3 yıllık süre 11 yılı yaklaşık 22 radyolojik tetkikler. Çünkü çoklu radyografik incelemelerin potansiyel risk, iyonize radyasyona maruz kalmadan çocuklar idiopatik skolyoz prognozu performans izin verebilecek alternatif yaklaşımlar şiddetle arzu edilir. Bu ihtiyacı karşılamak amacıyla, daha önce er idiopatik skolyoz gelişme riski asemptomatik çocukların belirlenmesi için bir prognostik test olarak bir hücre tabanlı tarama tahlili geliştirdi. Test Gi proteinlerinin fonksiyonel durumunu inceleyerek ve CDS ile ölçülen Gi protein uyarım 12 maksimum yanıtın derecesine göre üç fonksiyonel gruplar (FG1, FG2 ve FG3) içine çocuk sınıflandırarak hem asemptomatik ve etkilenen çocuklarda klinik sonucunu tahmin tabanlı sistem. Bu sistem, çok çeşitli hücre tipleri 13,14,15,16 G proteinleri yoluyla sinyal iletimini değerlendirmek için kullanılır. Bu, ilgili bilgi verirhücre yüzeyi reseptörlerinin aktivasyonu empedansı aşağıdaki değişiklikleri ölçerek dış uyarılara karşı hücrelerin toplam entegre cevabı. Hücreler, kuyuların altındaki elektrotlar içerir ve sistem, hücre dışı ve hücre üzerinden akımlarını hasıl küçük bir gerilim uygular bu mikro içine tohumlanır. Kuyuya bileşiği enjeksiyonundan sonra, hücre yüzeyi reseptörleri uyarılır ve sinyal transdüksiyon etkinlikleri hücre dışı ve hücre üzerinden akım akışını etkileyen hücresel değişikliklere yol açan, ortaya çıkar ve bu şekilde ölçülen büyüklüğünü etkiler. Bu yaklaşımla, skolyoz gelişme riski scoliotic hastalar ve çocuklar daha sağlıklı kontrol grubu ile karşılaştırıldığında Gi protein stimülasyon daha az duyarlı ve sınıflandırma kontrol grubuna göre azalma göreceli derecesi yüzde dayanmaktadır. Sınıflandırma aralıkları FG3, 40 ve FG2 için% 60 ve 60 ve FG1 12 için% 90 10 ve% 40 arasında sabitlenir.

Daha yakın zamanlarda, biz üç fonksiyonel gruplar açıkça Gi ve Gs uyarılmasına tepki arasındaki dengesizlik profiline göre ayırt edilebilir olduğunu göstererek bu yaklaşımı değiştirdiniz. Gerçekten de, belirgin bir dengesizlik FG2 gözlenmiştir ise Gi uyarısına yanıt FG3 içinde hakim olduğu bulunmuştur. Bunun aksine, FG1 Gs uyarılmaya yanıt için baskın sergiledi. Buna ek olarak, biz FG2 ait hastalar ameliyat 17 ihtiyacı noktasına ilerliyor riski daha fazla olduğunu kanıtlar sağlamıştır. Bu sınıflandırma testin hassas başka fonksiyonel gruplar arasında Gi uyarılmasına yanıt osteopontin (OPN) bir diferansiyel etkisini gösteren ile iyileştirilmiştir.

İşte biz şu anda bizim laboratuvarda yapılan bu fonksiyonel test deneysel ve analitik prosedürlerin ayrıntılı adımlar belgelemek.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm prosedür steril biyolojik başlık altında gerçekleştirilir ve bütün solüsyonlar ve ekipmanlar hücreleri ile temas haline geliyor steril olması gerekmektedir.

1.. Temel Çözümleri hazırlanması

  1. Tablo 1'e göre çözümler hazırlayın.
  2. Kullanım zamanına kadar 4 ° C, oda sıcaklığı ve diğer tüm çözümlere dengelenmiş tuz çözeltisi (BSS) tutun.
  3. Kullanılmadan önce bir kaç dakika için bir su banyosu içinde 37 ° C sıcak soğuk ortam.

2. PBMC'ler hazırlanması ve Depolama

  1. Her bir kısım için 5 ml 'si kullanılarak PBMC iki alikotları hazırlamak için EDTA ile muamele edilmiş toplama tüpleri içinde, tam kan 10 ml toplayın.
  2. 50 ml'lik bir tüpe EDTA ile muamele edilmiş toplama tüpünden Transfer, bütün haldeki kan 5 ml.
  3. BSS eşit hacim eklemek ve yukarı ve aşağı yumuşak pipetleme örnek karıştırın.
  4. Iki 15 ml Falcon tüpleri içinde 3 mL Ficoll yerleştirin.
  5. Dikkatle 4.5 ml katmanHer bir tüp içinde Ficoll üzerinde kan karışımı seyreltilmiştir.
  6. Tüpler kan ve Ficoll'ün net bir ayrım lehine kadar 5 dakika bekletin.
  7. Herhangi bir fren ile, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj tüpleri.
  8. Katmanlarını rahatsız etmeyecek şekilde dikkatlice santrifüj tüpleri kaldırmak. PBMC'ler BSS / Ficoll arayüzünde görebilir.
  9. Bir pipet ile hem tüplerin arayüzünde PBMC'lerin bulanık tabaka hasat ve yeni bir 50 ml'lik tüpe transfer.
  10. Tam ortam ile 20 ml ilave edilir.
  11. Oda sıcaklığında 7 dakika boyunca 288 x g'de santrifüje tüpü.
  12. Aspirasyon ile süpernatantı.
  13. Ek medya 500 ul hücre pelletini.
  14. Dondurma ortamının eşit bir hacim.
  15. Kriyotüpe hücre süspansiyonu aktarın.
  16. Izopropanol ile bir cryofreezing kap içine cryovial yerleştirin.
  17. -80 ° C sıcaklıkta gece boyunca dondurucu konteyner saklayın.
  18. Transfer dondurulmuş PBMC, uzun süreli saklama için sıvı nitrojen kısım.

3. İşlevsel Deneyi

1.. Gün 1

  1. Bir dakika ya da çözülmüş kadar 37 ° C'de su banyosu içerisinde sıvı azottan kısım yerleştirin.
  2. Steril bir pipet ile bir 50 ml tüp hücre süspansiyonu aktarın.
  3. Tam ortam 15 ml ilave edilir ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 xg'de hücreleri aşağı doğru döndürün.
  4. Aspirasyon ile süpernatantı.
  5. PHA yavaşça ortam 1 ml hücre pelletini askıya.
  6. Aynı medya ile 20 ml hacmi tamamlayın.
  7. Hava girmesine izin gevşek tüp kap.
  8. Hareketsiz lenfositler hızla çoğalan lenfoblastların haline dönüştürmek için izin vermek için bir CO2 inkübatör içinde 37 ° C'de gece boyunca tüp bırakın.

2. 2. Gün

  1. Kuluçka tüp almak, tamamen vidalı kapakları ve 5 dakika boyunca 200 xg'de hücreleri aşağı spinoda sıcaklığında gerçekleştirilir.
  2. Aspirasyon ile süpernatantı.
  3. Yavaşça tam ortam içinde 1 ml hücre pelletini askıya.
  4. Aynı medya ile 20 ml hacmi tamamlayın.
  5. Hava girmesine izin gevşek tüp kap.
  6. Hücre sayıları genişletmek için bir CO2 inkübatör içinde 37 ° C'de gece boyunca tüp bırakın.

3. 3. Gün

  1. Kuluçka tüp olsun, tamamen vidalı kapakları ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 xg'de hücreleri aşağı doğru döndürün.
  2. Aspirasyon ile süpernatantı.
  3. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj ile RPMI-1640, 10 ml ile iki kez hücreleri yıkayın.
  4. Yavaşça RPMI-1640 içinde 600 ul hücre pelletini.
  5. , Otomatik bir hücre sayacı ve canlılığı analiz cihazı kullanılarak, hücre canlılığı konsantrasyon ve ölçün.
  6. 1.5 x 10 5 cells/20 ul bir hücre konsantrasyonu ayarlamak için RPMI-1640 uygun hacim.
  7. Eppendorf tüpleri içinde, 1.5 ml rekombinan APN (rOPN) veya araç (PBS) hücreleri ile tedavi.
    1. Iki steril 1.5 ml Eppendorf tüplerine hücre süspansiyonu 100 ul aktarın.
    2. 0.5 ug / ml 'lik bir nihai konsantrasyona kadar bir tüp içinde rOPN ekleyin.
    3. Ikinci tüp içinde PBS eşit hacim.
    4. Yavaşça yukarı ve aşağı pipetleme iki kez 100 ul steril bir pipet seti kullanarak her koşul karıştırın.
  8. Küçük bir örnek, 96 oyuklu mikroplak hazırlayın.
    1. Her bir oyuğa RPMI-1640 içinde 5 ul ekle.
    2. Herhangi bir hava kabarcıklarını çıkarmak için 3 dakika boyunca 200 x g'de plaka santrifüj.
  9. Muamele edilmemiş hücrelerin yanı sıra rOPN veya PBS ile tedavi edilen hücreler tohum.
    1. Mikroplakaya tüp hücreleri aktarmadan önce, hafifçe yukarı pipet ve aşağı bir zamanlar hücrelerin homojen bir süspansiyon sağlamak.
    2. ROPN veya PBS için çift olarak, muamele edilmemiş hücreler için dört kez oyuk başına hücre süspansiyonu 40 ul muamele edilmiş hücreler. Retasarımı için Şekil 1 fer. Bu tasarım, 12 hasta ile aynı mikroplaka üzerinde test edilmesine olanak sağlar.
    3. Hücreler inkübatör yerleştirmeden önce dinlenme ve kuyunun dibine eşit yerleşmek için izin vermek için 5 dakika için steril başlık altında hücre plaka bırakın.
  10. OPN etkisini optimize etmek için bir CO2 inkübatör içinde 37 ° C'de 18 saat süreyle inkübe edin.

4. 4. Gün

  1. Bileşikleri ile plaka çalıştırın.
    1. Kuluçka plaka almak ve yaklaşık 30 dakika oda sıcaklığında bekletin.
    2. RPMI-1640 içinde 990 ul stok çözeltisi (10 mM) 10 ul eklenmesi ile RPMI-1640 içinde ve somatostatin, izoproterenol, 100 uM, 1 ml hazırlayın.
    3. Şekil 2'de gösterildiği gibi uygun kuyulara 20 ul tevzi ile bileşik plaka doldurun.
    4. Önce buharlaşma nedeniyle bileşik konsantrasyonu değişimi önlemek için önceden kesilmiş bir delinebilir bir mühür ile bileşik Rozetveya CDS-tabanlı sistemde inkübasyon sırasında.
    5. Yük hücresi plaka, pipet uçları ve CDS-tabanlı sistem içine levha bileşik.
    6. CDS-tabanlı enstrüman yazılım plaka adlandırın.
    7. Uygun protokolü seçin. PBMC'Ier ile sınıflandırma için düzenlenen protokol 'Agonisti Yapışmayan hücreler Küçük örnek Plate RT 15 dk' denir. Protokol kutusuna gitmek ve protokoller listesinde bu protokolü seçin
    8. 'Başlat' tıklayarak protokolünü başlatabilir.
    9. Entegre akar bilimi sisteminin aynı anda 50 ul toplam hacim içinde 10 uM bir nihai konsantrasyon elde etmek için oyuk başına 5 ul enjekte edilerek tüm oyuklara bileşikleri ekler.
    10. CDS-tabanlı sistemi otomatik bir bileşik ilave edildikten sonra 15 dakika için veri toplar.
  2. Veri analizi
    1. Olmayan için ekstrakt değerlerinin hesaplanmasında kullanılacak frekansların düşük ve yüksek aralıkları seçinyapışan hücreler.
    2. Zamanla bazal empedans ölçümlerinde doğrusal değişiklik düzeltmek için sürüklenme düzeltmesini seçin.
    3. Nedeniyle elektronik gürültü ve bileşik ilavesinden kinetik tepki ölçüm varyasyonları azaltmak için veri filtreleme seçin.
    4. Tam analiz süre Max-Min yöntemini seçin.
    5. Plaka biçimi seçeneği altında Excel'e İhracat verileri.
    6. Aşağıdaki formül kullanılarak Gs stimülasyonu (RmGs) yanıt büyüklükte ortalama Gi stimülasyonu (RmGi) yanıt büyüklükte ortalama çıkarılarak delta G (ΔG) hesaplayınız:
      ΔG = RmGi - RmGs
    7. (PBS varlığında uyarılması GI yanıt büyüklükte ortalama APN (RmGiOPN) mevcudiyetinde Gi uyarılmasına tepki büyüklüğü ortalamasını bölünmesiyle Gi-aracılı yanıt OPN kıvrım etki (Fe) yüzdesini hesaplayın RmGiPBS) aşağıdaki formül kullanılarak:
      Fe = 100 x (RmGiOPN / RmGiPBS)
    8. T bakınızhastaları sınıflandırmak için 2 mümkün.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre canlılığı, 86 ve% 96 aralığında değerleri ile tutarlı bir bütün örnekler arasında karşılaştırılabilir. Buna karşın, yüksek varyasyonları örnekleri (Tablo 3) arasında hücre sayıları kaydedildi. Kullanılan 32 örnekleri, iki hücrelerin yetersiz sayıda vardı ve sınıflandırılmış olmamıştır. Gi ve Gs sinyali arasındaki dengesizlik derecesine göre fonksiyonel sınıflandırma sonuçlarının bir örneği Şekil 3 'de gösterilmiştir. Bu rakamın dikey eksen FG2 için +10 ile -10 arasında, FG3 için> 10 olarak kurulan dinamik aralıkları ile fonksiyonel gruplar tasvir üç bölüme ayrılır ve nihayet <-10 FG1 içindir. Burada test 30 hastadan, 14, 6, ve 5 hasta açıkça FG2, FG3 sınıflandırılır ve sırasıyla FG1, beş hastada, özellikle 345, 353, 370, 371, ve 382, ​​aralıkları sınırda iken. Gi uyarısına yanıt OPN etkisinin değerlendirilmesi OPN pa yanıtını arttırdığını ortaya çıkmıştı353 ve 371 rın. Bunun aksine, hastanın tepki 345 ve 382 den fazla% 50 ve rOPN tedaviden sonra hastada 370 'den daha az% 50 oranında azaltıldı. Yani, bizim sınıflandırma kriterleri (Tablo 2) göre, biz FG1 hasta 353 ve 371 kategorize başardık, hastalar 345 ve FG2 382 ve FG3 hasta 370. Buna paralel olarak, tüm hastalar Gi protein uyarılmasına tepki açısından tarandı ve kontrol grubu ile karşılaştırılmıştır. Beklendiği gibi, tüm hastalar kontrol grubuna göre daha az duyarlı olduğunu ve yeni prosedür ile aynı fonksiyonel grupta sınıflandırılan hastaların maksimum cevabı (Şekil 5) benzer düzeylerde sergiledi. Ayrıca, her fonksiyonel grubun hastalar arasında farklılık yeni prosedür doğrulayarak, sınıflandırma 12 bizim klasik dizi ile tutarlıdır. Düzenli Sainte-Justine Hastanesinin özel kliniğimizde takip scoliotic hastaların büyük bir kohort sınıflandırılması ortaya koyduğu üçFG2 hastalığın ciddi ilerlemesi riski daha olarak fonksiyonel bir grup halinde sınıflandırılır hastaların tespit edilmesi ve bu sınıflandırma testi de yararlı olabilir gösteren ciddi vakalarda arasında (Şekil 6) baskın ise, fonksiyonel gruplar aynı şekilde, orta vakalar arasında dağıtıldı idiopatik skolyoz prognoz.

Çözelti A Susuz D-glukoz % 0.1
CaCl2 2H 2 O 0.05 mM
MgCI2 0.98 mM
KCl 5.4 mM
Tris 145 mM
Çözüm B NaCl 140 mM
Dengeli Tuz Çözeltisi (BSS) Çözelti A 1 hacim
Çözüm B 9 hacmi
RPMI-1640 500 mi
Antibiyotik-Antimikotik % 1
FBS % 10.
Tamamlayıcı medya RPMI-1640 50 mi
Antibiyotik-Antimikotik % 1
FBS % 40
Donma medya RPMI-1640 50 mi
Antibiyotik-Antimikotik % 1
FBS % 40
DMSO % 20
PHA medya RPMI-1640 500 mi
Antibiyotik-Antimikotik % 1
FBS % 10.
Fitohemaglutinin % 1

Tablo 1. Essentialçözümleri.

ΔG ile dinamik aralıkları Fonksiyonel Gruplar Fe ile dinamik aralıkları
ΔG <-10 FG1 Fe>% 100
-10 <ΔG <10 FG2 Fe <% 50
ΔG> +10 FG3 % 50

ΔG ve Fe ile kurulan dinamik aralıklara göre fonksiyonel grupların Tablo 2.. Kategorizasyonu.

Hastalar Canlılık (%) Hücre konsantrasyonu (× 10 6 / ml) Yorumlar
343 88.7 11.64
344 90.5 13.6
345 94.4 8.54
346 94.3 25.79
347 94.2 27.36
348 94.6 8.52
349 91.2 0.82 Hücrelerin yetersiz sayıda
350 90.3 8.92
352 92.6 8.28
353 91.3 12.75
354 86.9 7.62
355 91.2 7.51
356 90.3 9.36
358 95.1 16.94
359 92.3 13.89
360 89.4 7.67
361 93.5 7.84
365 86.5 2.2 Hücrelerin yetersiz sayıda
368 92.6 15.69
369 93.4 10.9
370 92.5 19.93
371 88.8 10.68
374 93.9 16.86
376 92.9 15.67
377 93.1 9.99
378 93.6 13.57
379 92.6 19.86
380 91.1 8.46
381 93.9 14.82
382 92.1 23.06
383 92.9 11.82
384 89.1 7.73

Tablo 3. , Otomatik bir hücre sayacı ve canlılığı analiz cihazı kullanılarak belirlenen yüzde canlılığı ve hücre konsantrasyonu.

figure-results-1
Hücre tohumlama için Şekil 1.. Tasarımı.

figure-results-2
Şekil 2.Bileşikleri dağıtımı için tasarlayın.

figure-results-3
Şekil 3. CDS-tabanlı bir sistem kullanarak fonksiyonel sınıflandırmanın Dinamik aralığı. Grafik Gi ve idiyopatik skolyoz hastalardan elde edilen PBMC'ler Gs uyarılmasına yanıtları arasında dengesizlik derecesine değerlerini göstermektedir. Değerler somatostatin ve izoproterenol 10 uM tepki olarak CDS-bazlı sistemi ile ölçüldü. Her bir nokta iki kopya halinde her iki tepkilerinin ΔG temsil eder.

figure-results-4
Şekil 4,. PBMC'ler içinde Gi uyarılmasına yanıt rOPN etkisi. Hücreler varlığında ya da 0.5 ug / ml rOPN yokluğunda, 18 saat serumsuz ve daha sonra 10 ile uyarıldı 56; somatostatin M Gi aracılı hücresel yanıtı başlatmak için. Grafikteki veri maksimum-minimum empedans oluşturulan ve iki kez yanıt ortalamasına karşılık gelir edilmiştir.

figure-results-5
Şekil 5. Kontrol ve scoliostic kişilerin PBMC'lerinden Gi proteinin fonksiyonel durumu. Kontrol grubunda ve scoliotic hastaların PBMC endojen somatostatin reseptörü vasıtasıyla Gi proteinlerinin teşvik etmek için somatostatin artan konsantrasyonlarda maruz bırakılmıştır. Işlem bölümünde tarif edildiği gibi hücresel yanıt CDS-tabanlı bir sistem ile ölçülmüştür. Eğriler, maksimum-minimum empedans elde edilmiştir. Her eğri doğrusal olmayan regresyon temsil eder. Veri kontrol grubunda hücrelerde maksimum yanıta göre normalize ve her bir nokta her iki kez yanıt ortalamasına karşılık gelir edilmiştir./ 50768/50768fig5large.jpg "target =" _blank "> büyük rakam görmek için buraya tıklayın.

figure-results-6
Skolyoz farklı evreleri arasındaki fonksiyonel grupların Şekil 6.. Dağılımı. Düzenli Sainte-Justine Hastanesinin ardından 794 orta (10-44 ° arasında eğrilikler) ve 162 (fazla 45 ° eğrilik) ağır olguların scoliotic hastaların büyük bir kohort, Gi ve Gs yanıt arasındaki dengesizlik onların derecesine göre sınıflandırıldı uyarım. Yanıtlar somatostatin ve izoproterenol 10 uM tepki olarak CDS-bazlı sistemi ile ölçüldü.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu taze olarak izole edilen veya sıvı azot içinde bir yıla kadar donmuş halde muhafaza edilmiş periferal kan tek-çekirdekli hücreleri için de geçerlidir idiyopatik skolyoz için hücre bazlı bir prognostik testi (PBMC) ayrıntılı bir prosedür tarif eder. Bireylerin büyük sayıda test ederken taze olarak izole edilen PBMC'ler kullanılarak ağır olduğu için, bu prosedür klinik ortamda daha pratik bir alternatif sunmaktadır dondurulmuş PBMC verildi. Dondurulmuş PBMCler başlangıçta arası tahlil değişkenliği bazen lider, kullanılan Ancak, çözüldükten sonra hücre topaklanma ile karşılaşılan sorunları. Tahlil tekrarlanabilirliğinin maksimize etmek için, biz donma-çözülme döngüsü kaçınarak ve sadece bir kez dondurulmuş örnek kullanmanızı öneririz. Prosedür kısa sürede kusurlu Gi protein fonksiyonunun doğru tespiti sağlayan, çok basittir. Bu prosedürü kullanarak, asemptomatik ve scoliotic çocukların kolaylıkla daha iyi sağlık için herhangi bir tehlike olmadan klinik sonucunu tahmin etmek sınıflandırılabilir. HoSağlıklı kontrol grubunda 12 Gi uyarım göreli maksimum yanıtın derecesine göre sınıflandırma yaparken wever, kontrol grubu için çeşitli gerekler yerine getirilmelidir. Gerçekten de, uygun bir karşılaştırma kohort amacıyla, kontrol grubu ilaç her türlü olabilir ve bu gibi geçmiş bireysel / ailesel tıbbi geçmişi gibi özel bilgi sağlamak değil, yaş ve cinsiyet uyumlu olmalıdır. Bu gereksinimler kontrol konuların alımı için önemli bir engel teşkil edebilir. Bu nedenle, aynı bireyde Gi ve Gs protein uyarılmasına tepki arasındaki dengesizlik derecesini inceleyerek sınıflandırma performans denetimi konuları kullanmanın gerekliliğini ortadan kaldırmak için idealdir.

Bu testi gerçekleştirmek için prognostik CDS-dayalı bir sistemin kullanılması, aynı zamanda, aynı tahlilde Gi ve Gs-aracılı hücresel yanıtları sağlamak açısından önemlidir. Birçok hasta am ile sınıflandırılabilir rağmenbu raporun sonuçları ile gösterildiği gibi biguity Bu deney için sabit dinamik aralığı kullanılarak, hasta, az sayıda, aralıkları sınır çizgisine değerleri gösterirler. Bu bireyler ayrımcılık için, OPN üç fonksiyonel gruplar arasında Gi-aracılı hücresel cevap üzerinde bir etki fark neden olduğunu gösteren Gi tarafından uyarılmaya yanıt OPN etkisinin değerlendirilmesini girmiştik. Gerçekten de, OPN, FG1 Gi uyarım artışlara tepki varlığında bu FG2 daha yüksek bir oranda, FG2 ve FG3 de azalır bulundu. OPN maliyeti yüksek olmasına rağmen, bu kemokin kullanımı belirsiz durumlarda ayırt, ve bu nedenle sınıflandırma tahlil doğruluğunu geliştirmek için gereklidir. Bununla birlikte, bu deney, göz başına 1.5 x 10 5 hücre minimum deneysel koşullar altında CDS-tabanlı sistem ile hücresel cevabı gözlemlemek için gerekli olduğu bir dezavantajı vardır. Belirli hasta numuneleri, yeterli sayıda bir olmazTest edilecek olan hücreler. Bu durumda, medikal ve laboratuvar personeli için aileleri için endişe verici ve sinir bozucu olabilir ek kan toplama için hasta hatırlamak gerekir. Prospektif çalışmalar bu sorunu gidermek için laboratuarımızda planlanmaktadır.

Bununla birlikte, mevcut protokol test hücrelerin karşılıklarının izlenmesi için geçerli bir etiket içermeyen bir sistem 13, 14 kullanılarak otomatik olarak ise hücrelerini hazırlamak için basit ve kanıtlanmış bir yöntemle gerçekleştirilir. Diğer hastalıkların prognozu için mevcut genetik platform ile karşılaştırıldığında test platformu nispeten ucuzdur. Ayrıca, kan toplama tüpleri, ipuçları, özel elektrot mikroplaklar, ve konik ve Eppendorf tüpleri dahil tüm tek kullanımlık malzemelerin maliyeti, çok pahalı değil ve yaklaşık bin hasta için bir test tamamlamak için en az 3000 $ olarak tahmin ediliyor. Bu tahmin örneklerinin hazırlanması için işçilik maliyetleri içermez rağmenve testi, bu test çok daha uygun yeni nesil dizileme platformlarda daha kalır. Dikkate değer, genetik platformlara maliyet karşılaştırma değil sadece, ama daha spesifik AIS alanı ile ilgili, radyolojik görüntüleme ile ilgili maliyetleridir. Bugün, ABD'de bir milyondan fazla çocuk ve Kanada'da yaklaşık 100.000 çocuk idiopatik skolyoz tanısı, ve X-ray maruz kalma tanı ve scoliotic çocukların izlenmesi toplam maliyeti Kuzey Amerika'da yılda 2.5 milyar doların üzerinde olan. Böylece, hücre bazlı deney prosedürü rutin tarama ve sağlık riski olmaksızın ve daha düşük maliyetle idiyopatik skolyoz olan çocukların izlenmesi için uygun olması beklenecektir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Birçok patent yol açtı Bu çalışma çeşitli ülkelerde askıda Sainte-Justine Üniversite Hastanesi ve diğerleri tarafından tutun. Dördüncü Boyut Omurga LLC Sainte-Justine Üniversite Hastanesi münhasır lisans sahibidir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma (Dr. Moreau'ya) La Fondation Yves Cotrel de l'Institut de France, Paris, Fransa hibe tarafından desteklenen, Sağlık Araştırma Kanada Enstitüleri (Dr Moreau'ya PP2-99466 hibe) ve Dördüncü Boyut Omurga LLC , New York, ABD (Dr Moreau'ya Araştırma hibe).

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Materials
RPMIWisent, Inc350-005-CL
FBSTherno Bilimsel HycloneSH3007103
DMSOSigma AldrichD2650
Ficoll-Plaque PlusGE Sağlık17144003
Antibiyotik-Antimikotikİnvitrojen15240-062
Fitohemaglutininİnvitrojen (Gibco)10576-015
Rekombinant İnsan OsteopontinR& D Systems, Inc1433-OP / CF
SomatostatinTocris1157
IsoproterenolTocris1743
PBSWisent, Inc311-010-CL
Steril pipet uçlarıAxygen Scientific301-06-451
Steril Eppendorf tüpleriUltident24-MCT-150-C
50 ml konik tüplerVWR International89039-658
Cellkey küçük numune 96W mikroplakaMoleküler Cihazlar1026496
Cellkey ipuçlarıCybioOL3800-25-559N
Önceden kesilmiş delinebilir contalarExcel Scientific, IncXP-100
Equipment
Vicell XRBeckman Coulter731050Otomatik hücre sayacı
Hücre kültürü başlığıForma Scientific1284Sınıf II
Sıvı nitrojen depolamaThermo ScientificCY5093570
Su banyosuVWR International89032-204
Standart ışık mikroskobuLeica MicrosystemsDMIL LED
Hücre kültürü inkübatörüThermo Scientific51019557%5 CO2 37 ° C'de; C
Düşük hızlı santrifüjThermo Scientific75004364
Cellkey sistemiMoleküler Cihazlar1019185CDS tabanlı cihaz

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kane, W. J. Prevalence: a call for a statement of terms. Clin Orthop. Relat Res. 126, 43-46 (1977).
  2. Bunnell, W. P. Selective screening for scoliosis. Clin Orthop Relat Res. 434, 40-45 (2005).
  3. Asher, M. A., Burton, D. C. Adolescent idiopathic scoliosis: natural history and long term treatment effects. Scoliosis. 1 (1), 2(2006).
  4. Fong, D. Y., et al. A meta-analysis of the clinical effectiveness of school scoliosis screening. Spine (Phila Pa 1976). 35 (10), 1061-1071 (2010).
  5. Chowanska, J., Kotwicki, T., Rosadzinski, K., Sliwinski, Z. School screening for scoliosis: can surface topography replace examination with scoliometer? Scoliosis. 7 (9), 1748-7161 (2012).
  6. Kim, H., et al. Scoliosis imaging: what radiologists should know. Radiographics. 30 (7), 1823-1842 (2010).
  7. Wong, H. K., Hui, J. H., Rajan, U., Chia, H. P. Idiopathic scoliosis in Singapore schoolchildren: a prevalence study 15 years into the screening program. Spine. 30 (10), 1188-1196 (2005).
  8. Nachemson, A. A long term follow-up study of non-treated scoliosis. Acta Scand. 39 (4), 466-476 (1968).
  9. Enneking, W. F., Harrington, P. Pathological changes in scoliosis. J. Joint Surg. 51 (1), 165-184 (1969).
  10. Miller, N. H. Cause and natural history of adolescent idiopathic scoliosis. Orthop. Clin. North Am. 30 (3), 343-3452 (1999).
  11. Nash, C. L. Jr, Gregg, E. C., Brown, R. H., Pillai, K. Risks of exposure to X-rays in patients undergoing long-term treatment for scoliosis. J. Bone Joint Surg. Am. 61 (3), 371-400 (1979).
  12. Akoume, M. Y., et al. Cell-based screening test for idiopathic scoliosis using cellular dielectric spectroscopy. Spine. 35 (13), 601-608 (2010).
  13. Verdonk, E., et al. Cellular dielectric spectroscopy: a label-free comprehensive platform for functional evaluation of endogenous receptors. Assay Drug Dev. Technol. 4 (5), 609-6019 (2006).
  14. Peters, M. F., et al. Evaluation of cellular dielectric spectroscopy, a whole-cell, label-free technology for drug discovery on Gi-coupled GPCRs. J. Biomol. Screen. 12 (3), 312-319 (2007).
  15. Peters, M. F., Scott, C. W. Evaluating cellular impedance assays for detection of GPCR pleiotropic signaling and functional selectivity. J. Biomol. Screen. 14 (3), 246-255 (2009).
  16. Peters, M. F., Vaillancourt, F., Heroux, M., Valiquette, M., Scott, C. W. Comparing label-free biosensors for pharmacological screening with cell-based functional assays. Assay Drug Dev. Technol. 8 (2), 219-227 (2010).
  17. Akoume, M. Y., et al. Disrupted Gi-coupled receptor signaling occurs in adolescent idiopathic scoliosis. J. Clin. Invest. , Submitted (2013).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Periferik Kan Monon kleer H creleridiyopatik Skolyoz PrognozuFonksiyonel Grup S n fland rmasOsteopontin TedavisiGi Gs Protein AktivasyonuFitohemaglutinin Stim lasyonuSomatostatin zoproterenol AnaliziFicoll Gradyan zolasyonuOtomatik H cre Say c

İlgili makaleler