Yöntem makalesi

Isı Kaynaklı Antijen Alımı: Yetişkin Hipokampal Nörojenez Sırasında Progenitör Hücre Tiplerini Tespit Etmek ve Tanımlamak İçin Etkili Bir Yöntem

DOI:

10.3791/50769

⸱

30 Ağustos 2013

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurologic Surgery, Mayo Clinic College of Medicine, 2Department of Anatomy, Korea University College of Medicine, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, Mayo Clinic College of Medicine

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Erişkin hipokampal nörogenez sırasında, hareketsiz bir nöral kök hücre sırayla ilerlediğinde ve devrede işlevsel olarak entegre bir nörona dönüştüğünde farklı bir genetik belirteç seti ifade edilir. Isı kaynaklı antijen alımı kullanılarak, aksi takdirde tespit edilmesi zor olan progenitör hücre tipleri, geliştirilmiş etkinlik ile tanımlanır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Doku fiksasyonunu takip eden geleneksel immünohistokimya (IHC) yöntemleri, çeşitli hücre tiplerinin görüntülenmesine izin verir. Bunlar tipik olarak antijenleri bağlamak ve doğal biyoloji ve gelişimin bir fonksiyonu olan özelliklere sahip hücreleri tanımlamak için antikorların uygulanmasıyla devam eder. Erişkin hipokampal nörogenez, hareketsiz bir nöral kök hücrenin aktive olabildiği ve proliferasyon, farklılaşma, olgunlaşma ve fonksiyonel entegrasyon aşamalarından geçebildiği sıralı bir süreçtir. Her faz, karakteristik bir morfoloji ve genlerin yukarı regülasyonu ile farklıdır. Bu aşamaların tanımlanması, oyundaki düzenleyici mekanizmaları ve zayıflatıcı bozuklukların patofizyolojisinin altında yatan bu süreçteki herhangi bir değişikliği anlamak için önemlidir. Isı kaynaklı antijen alma yaklaşımımız, tespit edilen sinyalin yoğunluğunu artırır ve progenitör hücre tipinin doğru bir şekilde tanımlanmasını sağlar. Bu yazıda tartışıldığı gibi, özellikle belirli progenitör hücre tiplerinin tespitindeki mevcut sorunları aşmamıza izin verir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nöral kök hücrelerden yeni nöronların üretilmesi olan nörogenezin, artık beyindeki iki özel bölgede yetişkinliğe kadar sürekli olarak meydana geldiği bilinmektedir. Bunlar, koku alma ampulünün subventriküler bölgesini (SVZ) ve hipokampustaki dentat girusun subgranüler bölgesini (SGZ) içerir. Son on yılda, yetişkin hipokampal nörojenez alanı önemli çalışmalar gördü. SGZ'deki yenidoğan nöronları, belirli beyin fonksiyonlarını1-5 sürdürebilen gelişmiş nöral plastisiteye katkıda bulunduğundan, bölge büyük ilgi görmüştür. Erişkin hipokampal nörogenez, duygudurum düzenlemesi, yenilenme ve öğrenme ve hafızada önemli roller oynamakla ilişkilendirilmiştir. Bu nedenle, bu zengin nörojenik nişteki nöronların gelişimini ve düzenlenmesini anlamak için ortak bir çaba sarf edilmiştir.

Erişkin hipokampal nörojenezi incelemenin kaçınılmaz ve önemli bir yönü, aktive edilmiş bir nöral kök hücrenin tamamen işlevsel bir nöron olma yolunda geçtiği ayrı aşamaların tanımlanmasıdır. Bu süreçte, hareketsiz nöral kök hücre aktive edilir ve bir dizi erken aktif ve geç aktif progenitör hücre tipi boyunca ilerler (Şekil 1). Nöral progenitörlerin bu farklı popülasyonları, morfoloji ve RGL'lerin kendi progenitör hücre tiplerine dönüşümünü yönlendiren MCM2, nestin, Tbr2 ve Doublecortin (DCX) ve NeuN gibi moleküler belirteçlerin ekspresyonu ile tanımlanabilir. Nestin, radyal glia benzeri hücreler ve bazı erken progenitör hücre tipleri boyunca eksprese edilen bir ara filament proteinidir. Diğer bir belirteç, amplifiye edici progenitör hücrelerde spesifik olarak eksprese edilen Tbr2'dir. Tbr2 transgen ekspresyonu başlangıçta Tip-1 hücrelerde (radyal-glia benzeri) kapatılır, Tip-2a, Tip-2ab ve Tip-2b progenitörlerinde açılır ve daha farklılaşmış Tip-3 ve olgunlaşmamış nöronlar arasında kapatılır (Şekil 1). DCX, Tip-2ab, Tip-2b ve Tip-3 nöral progenitörlerde eksprese edilen bir nöronal migrasyon belirtecidir. Bu üç işaretleyicinin kombinasyonunu kullanarak, nöral progenitörlerin farklı alt tiplerini etiketleyebiliriz. Bunlar arasında Tip-1 (MCM2+nestin+Tbr2-), Tip-2a (MCM2+nestin+Tbr2+), Tip-2ab (kısmi MCM2+nestin-Tbr2+ ve kısmi MCM2+Tbr2+DCX-), Tip-2b (MCM2+Tbr2+DCX+) ve Tip-3 (MCM2+Tbr2-DCX+). Olgunlaşmamış ve fonksiyonel olarak entegre nöronlar gibi post-mitotik hücreler, DCX ve olgun nöronal belirteç NeuN kullanılarak tanımlanabilir.

Geleneksel IHC yöntemleri, gen ekspresyonlarına dayalı olarak belirli hücre tipleri için antijenleri tanımlamak için antikorlar kullanır. Konfokal mikroskopi gibi yüksek çözünürlüklü görüntüleme teknikleri ile daha sonraki görselleştirme, bunların tanımlanması için kullanılabilir. Bununla birlikte, şu anda, radyal glia benzeri hücrelerin ve erken progenitör hücre tiplerinin verimli bir şekilde tanımlanmasına izin vermeyen bu yöntemlerle ilgili sorunlar vardır. Bu belirli hücre tiplerini tanımlamak zordur, çünkü uygulanan antikor nestin proteinine nüfuz edemez ve etkili bir şekilde bağlanamaz. Nestin, radyal glia benzeri hücre tarafından üretilen radyal süreçleri içeren ara filament proteinidir. Bir antikorun antijene verimsiz bağlanması, fiksasyon süresi, sıcaklık ve kullanılan teknik gibi birçok faktörün bir sonucu olabilir6-7. Bu tür sorunları çözmeye yardımcı olmak için bir antijen geri kazanımı veya "kaynatma" yöntemi geliştirdik. Nestinin yanı sıra, bu antijen elde etme yöntemi ayrıca Ki67, BrdU, glial fibriler asidik protein (GFAP), Tbr2 ve MCM2 gibi diğer belirteçler için boyamayı da iyileştirir. Yöntemimiz kimyasal ve fiziksel yaklaşımları bir araya getirir. Dokunun paraformaldehitte kimyasal olarak sabitlenmesini ve ardından ince koronal hipokampal bölümlerin denatüran ve kaotropik bir tedavi tamponunda yüksek sıcaklıkta kaynatılmasını içerir. Bu, antijenin antikora erişilebilirliğini artırır, antikor özgüllüğünü iyileştirir ve progenitör hücre tiplerinin daha iyi tanımlanmasını sağlar. Yaklaşımımızın kullanımı basittir ve laboratuvarda çoğunlukla mevcut olan araçları ve reaktifleri gerektirir. Nöral kök hücrelerin gelişimini ve bunların içsel genetik veya dışsal çevresel faktörler aracılığıyla düzenlenmesini incelemek için yaygın olarak kullandık8.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Pre-immünohistokimya: Perfüzyon ve Histoloji

  1. Fareler için uyarlanmış genel bir transkardiyal protokole göre fareleri perfüze edin ve beyinleri %4 paraformaldehite (PFA) çıkarın9.
  2. Beyni gece boyunca 4 °C'de PFA'da bırakın (örneğin, PFA ile doldurulmuş 10 ml'lik konik bir tüp). Tam fiksasyon için PFA'da en az 12-24 saat, en fazla 36 saat tutun. Gece boyunca fiksasyondan sonra, PFA'yı konik tüpten boşaltın, ancak beyinleri içeride bırakın. % 30 sükrozu tüpe dökün ve kalan PFA'yı çıkarmak için beyinleri 5 saniye boyunca kısa bir süre yıkayın. Son olarak, beyinleri tekrar %30 sükroz ile doldurun. Beyinler tüpün dibine batana kadar beyinleri 4 ° C'de sakarozda tutun.
  3. Bir mikrotom üzerinde 40 μm beyin bölümleri kesin. Dentat girusun başından sonuna kadar bölümleri toplamaya başlamak için bir fare beyin atlasına danışın. İmmünohistokimya için hazır olana kadar bölümleri antifriz solüsyonunda (basit bir tarif, 500 ml 0.1 M PBS ve 300 ml etilen glikol içinde 300 g sükrozdur) koruyun.
  4. Kesilen dokuyu, dokuya güçlü bir şekilde yapışması için özel olarak tasarlanmış mikroskop slaytlarına monte edin. Bu slaytlar kaynama aşamasında dokuya güçlü bir tutuş sağlar. Mendili monte ettikten sonra, lütfen slaytı 10 dakika veya tamamen kuruyana kadar kurumaya bırakın. Slayt, alt kenarı bir kağıt havlu üzerinde olacak şekilde dikey bir yüzeye yaslanırsa kurutma hızlandırılabilir. Birden fazla sürgü monte ediliyorsa, diğer sürgü(ler) bir sonraki adıma geçmeye hazır olana kadar bu süre zarfında (1-2 saat tamam) kuru bırakılabilir.
  5. Slayt kuruduktan sonra, PBS ile her biri 5 dakika boyunca üç kez yıkayın ve tekrar kurutun (PBS tamponu = 0.137 M NaCl, 0.0027 M KCl, 0.0119 M Na2PO4). Bu, önceki herhangi bir kimyasalın (donma önleyici depolama solüsyonundan gelen gliserol gibi) yeterince uzaklaştırılmasını sağlar ve dokunun slayta yapışmasını bozmaz.

2. Reaktiflerin ve Küçük Ekipmanların Hazırlanması

  1. Doku bölümlerinin kaynatılacağı Çözelti A'yı (0.1 M veya 19.21 g/l sitrik asit) ve Çözelti B'yi (0.1 M veya 24.9 g/l tris-sodyum sitrat) hazırlayın.
  2. Dereceli bir silindirde, 9 ml Çözelti A ve 41 ml Çözelti B'yi birleştirin ve bu karışıma 450 ml ddH2O ekleyin.
  3. Bu karışımı mikrodalgaya uygun boş bir kaba (örn. boş bir pipet ucu kutusu) dökün.

3. Isı Kaynaklı Antijen Alımı

  1. 2. adımda yapılan çözeltiyi standart bir mikrodalgada standart ayarda 5 dakika kaynatın. Çözelti 100 °C'de veya üzerinde kaynamaya başlayacaktır.
  2. Kaynatma işlemi tamamlandıktan sonra, kabı mikrodalgadan dikkatlice çıkarın ve kurutulmuş slaytları içine yerleştirin, hipokampal bölümlere sahip slayt yüzünün aşağı baktığından ve sıvıya tamamen maruz kaldığından emin olun. Mümkünse, slaytları kutunun duvarlarına doğru bir açıyla yerleştirin ve diğer slaytları etraflarına istifleyin. Kutunun içindeki "uyumlarının" sıkı olduğundan emin olun, böylece kızakların üst üste hareket edecek yeri kalmaz.
  3. Bu karışımı slaytlarla mikrodalgada standart ayarlarda 7 dakika kaynatın. Çözelti bu süre zarfında 100 ° C'de veya üzerinde kaynayacaktır.
  4. Bu kaynatma aşamasında, iki buz kovasını yarısına kadar buzla doldurun.
  5. Adım 3.3'te kaynatma işlemi tamamlandıktan sonra, kabı mikrodalgadan çıkarın ve buz kovalarından birinin içine yerleştirin. Diğer kovadaki buzun geri kalanını kabın her tarafına dökün ve tamamen örtün. 1 saat bekletin.

4. Primer ve Sekonder Antikor Boyama

  1. 1 saatlik bekleme süresinin sonunda slaytları kaptan çıkarın ve TBS-T tampon 3x ile 5'er dk yıkayın. Bu temel yıkamaları gerçekleştirmek için herhangi bir aparat kullanılabilir. (Tampon TBS = 50 mM Tris HCl, 150 mM NaCl, TBS-T =% 0.05 Triton X-100 TBS tamponu, TBS-TT =% 4 eşek serumu TBS-T tamponu).
  2. Yıkadıktan sonra, slaytları karanlık bir yerde (örneğin bir tezgah çekmecesinin içinde, çekmecenin içine bir kağıt havlu yerleştirin ve slaytı buna doğru eğin) 5-10 dakika veya slayt tamamen kuruyana kadar kurumaya bırakın. Bu süre zarfında, gece boyunca primer antikor boyaması için bir oda hazırlayın. Basit bir boyama odası, ddH2O ile doldurulmuş geniş yüzey alanına sahip bir kap ve kabın içinde, üzerine sürgünün ddH2O'nun üzerine oturtulabileceği bir aşama içerebilir.
  3. Slayt kuruduktan sonra, su itici bir kalem kullanarak doku bölümlerinin etrafına bir taslak çizin. Adım 4.5 sırasında, bu taslak antikor karışımının akmasını önleyen bir bariyer görevi görür.
  4. TBS-TT'de birincil antikor karışımını hazırlayın. Örneğin, bir slaytın tamamını kaplamak için en az 500 μl gereklidir, örneğin antikor stoğu 1:500 konsantrasyondaysa, 500 μl TBS-TT'ye 1 μl özel antikor ekleyin). Reaktifler tablosunda belirtildiği gibi birincil antikorları kullanın.
  5. Kurutulmuş slaytı boyama odasındaki sahnenin üzerine yerleştirin. 500 μl primer antikorları yavaşça ekleyin ve tüm yüzeyi kaplayın. Tüm cihazı örtün ve dış ışığı engellemek için alüminyum folyoya sarın. Gece boyunca oda sıcaklığında bekletin.
  6. Ertesi gün, slaytı her biri TBS-T tamponu ile 5 dakika boyunca üç kez yıkayın. Adım 4.2'de açıklandığı gibi karanlık bir alanda kurumaya bırakın.
  7. Adım 4.4'e benzer şekilde ikincil antikor karışımı hazırlayın. İkincil antikorlar için reaktifler tablosuna bakın.
  8. Kurutulmuş slaytı adım 4.2 ve 4.5'te açıklandığı gibi boyama odasına yerleştirin. 500 μl sekonder antikorları yavaşça ekleyin ve tüm yüzeyi kaplayın. Boyama haznesini dış ışıktan korumak için alüminyum folyoya sarın. Oda sıcaklığında en az 2 saat boyunca üstü kapalı ve dış ışıktan korunarak bekletin.
  9. İkincil boyamanın tamamlanmasından sonra, slaytı her biri TBS-T tamponu ile 5 dakika boyunca üç kez yıkayın. Slaytı karanlık bir alanda kurumaya bırakın. Kuruduktan sonra, montaj solüsyonunu koyun ve sürgünü bir kapak kaymasıyla, herhangi bir kabarcık girmesini önleyerek dikkatlice örtün. Sonraki analizden önce slaytı en az 2 saat karanlık bir alanda bekletin.
  10. Lekeli doku üzerinde hızlandırılmış veya konfokal analiz yapın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yetişkin hipokampal nörogenez, her aşamadaki temsili progenitör hücre tipinin bir dizi marker kombinasyonu ile tanımlanabildiği ardışık bir süreçtir. Özenli kimyasal fiksasyon ve antijen geri kazanımı, aksi takdirde tespit edilmesi zor olan markerların etkinliğini ve erişilebilirliğini artırır. Bunlardan biri, radyal glia benzeri nöral kök hücrelerde ve bazı erken aktif progenitör hücre tiplerinde eksprese edilen nestindir. Kök hücre veya progenitör daha sonra olgun bir nörona farklılaştığında ekspresyonu kaybolduğu için...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Progenitör hücre tiplerinin başarılı bir şekilde antijen alımı ve boyanması için en kritik adımlar şunlardır: 1) optimal koronal kalınlıkta iyi perfüze edilmiş ve sabitlenmiş doku kullanılması; 2) antijen alımı sırasında kaynatma ve ardından soğutma için yeterli zaman tanımak; 3) Sabit koronal bölümlerin montajında el becerisi ve bunu yaparken hasar görmelerini önleme.

IHK'de yeterli fiksasyona uğramış ancak aşırı fiksasyona uğramamış perfüze doku kullanılması kritik öneme sahiptir. Birincil z...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metodoloji ilk olarak Dr. Hongjun Song'un Johns Hopkins Tıp Fakültesi Nöroloji Anabilim Dalı Hücre Mühendisliği Enstitüsü'ndeki laboratuvarında geliştirilmiştir. Bu çalışma NIMH (R00MH090115), NARSAD, Kardeşlik Kartalları Düzeni Mayo Kanser Araştırma Fonu ve Mayo vakfından M.H.J. ve Kore Ulusal Araştırma Vakfı (NRF) aracılığıyla Temel Bilim Araştırma Programı, Eğitim, Bilim ve Teknoloji Bakanlığı (A3014385) tarafından finanse edilen ve W.R.K.'ye verilen bir başlangıç paketidir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
SuperFrost Plus SlideFisherbrand12-550-15Kaynatma sırasında hipokampal dokuya güçlü yapışma sağlar
PVA/DABCO Montaj OrtamıSigma Aldrich10981-100 ml
Nestin (tavuk) Aves LabNESNöral kök hücre işaretleyici
GFAP (tavşan)Dako Kuzey AmerikaZ033401-2Astrosit ve nöral kök hücre belirteci
MCM2 (fare)BD Transdüksiyon Laboratuvarı610701Proliferasyon belirteci
DCX (keçi)Santa Cruz BiyoteknolojiSC8066Olgunlaşmamış nöron belirteci
Tbr2 (tavşan)AbcamAb23345Amplifiye edici progenitör belirteç
NeuN (fare)MilliporeMAB377Olgun nöron belirteci
Cy2 (tavşan karşıtı)Jackson İmmünoaraştırma111-226-047
Cy2 (tavuk karşıtı)Jackson İmmünoresearch303-165-006
Cy5 (fare karşıtı)Jackson İmmünoaraştırma315-175-047
Cy5 (keçi karşıtı)Jackson İmmünoaraştırma305-165-047
DAPIYaşam Teknolojileri ŞirketiD1306
Dako KalemS2002DakoSu geçirmez kalem

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian central nervous system. Annual Reviews of Neuroscience. 28, 223-250 (2005).
  2. Santarelli, L., Saxe, M., et al. Requirement of hippocampal neurogenesis for the behavioral effects of antidepressants. Science. 301 (5634), 805-809 (2003).
  3. Sahay, A., et al. Increasing adult hippocampal neurogenesis is sufficient to improve pattern separation. Nature. 472 (7344), 466-4670 (2011).
  4. Clelland, C. D., Choi, M., et al. A functional role for adult hippocampal neurogenesis in spatial pattern separation. Science. 325 (5937), 210-213 (2009).
  5. Wang, J. W., David, D. J., et al. Chronic fluoxetine stimulates maturation and synaptic plasticity of adult-born hippocampal granule cells. Journal of Neuroscience. 28 (6), 1374-1384 (2008).
  6. D'Amico, F., Skarmoutsou, E., Stivala, F. State of the art in antigen retrieval for immunohistochemistry. Journal of Immunological Methods. 341 (1-2), 1-18 (2009).
  7. Daneshtalab, N., et al. Troubleshooting tissue specificity and antibody selection: Procedures in immunohistochemical studies. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 61 (2), 127-135 (2010).
  8. Jang, M. H., Bonaguidi, M. A., et al. Secreted frizzled-related protein 3 regulates activity-dependent adult hippocampal neurogenesis. Cell Stem Cell. 12 (2), 215-223 (2013).
  9. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. J. Vis. Exp. (65), e3564(2012).
  10. Porcelli, M., Cacciapuoti, G., et al. Non-thermal effects of microwaves on proteins: Thermophilic enzymes as model system. FEBS Letters. 402 (2-3), 102-106 (1997).
  11. Stone, J. R., Walker, S. A., Povlishock, J. T. The visualization of a new class of traumatically injured axons through the use of a modified method of microwave antigen retrieval. Acta Neuropathologica. 97 (4), 335-346 (1999).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

mm nohistokimyaKonfokal MikroskopiDoku FiksasyonuPrimer Antikor BoyamasSekonder Antikor BoyamasBeyin Kesit AlmaMikrodalga Kaynatma

İlgili makaleler