Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Cryo-Elektron Tomografi kullanma Frozen-hidratlı Devlette neurites görselleştirme İlköğretim Nöronlar hazırlanması

70.5K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/50783

⸱

12 Şubat 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Physiology and Biophysics, Baylor College of Medicine, 2Department of Neuroscience, Baylor College of Medicine, 3Department of Neuroscience, University of California at San Diego, 4National Center for Macromolecular Imaging, Verna and Marrs McLean Department of Biochemistry and Molecular Biology, Baylor College of Medicine

Bu makalede

Özet

Ince yapı analizi için nöronal işlemleri korumak için, camsı bir buz tabakası içinde süspansiyon haline numune verecek şekilde flaş dondurma, ardından elektron mikroskobu taramalarında primer nöron kaplanması için bir protokol açıklar. Bu örnekler nanometre ölçeğinde yapıları görselleştirmek için bir kriyo-elektron mikroskobu ile muayene edilebilir.

Özet

Nöritler, hem dendrit ve aksonlar, nöronlar arasındaki elektriksel uyarıların iletimini sağlayacak nöronal hücresel süreçleri vardır. Neurites yapısının tanımlanması, bu işlemler, sinaptik iletişim destek malzemeleri ve sinyalleri nasıl hareket anlamak için çok önemlidir. Elektron mikroskopisi (EM) geleneksel nevritlerin içindeki ultrastrüktürel özellikleri değerlendirmek için kullanılmıştır, ancak dehidrasyon ve reçine yerleştirmesi sırasında organik çözücüye maruz kalma yapıları bozabilmektedir. Önemli bir karşılanmamış hedefi böyle eserler etkilenmez yapısal değerlendirmeler için izin prosedürlerin oluşturulmasıdır. Burada, biz büyüyen ve kriyo-elektron tomografisi (kriyo-ET) ile muayene ile takip elektron mikroskobu ızgaraları farklı primer nöronlar flaş dondurma bütün nevrotiler için detaylı ve tekrarlanabilir bir protokol kurduk. Bu teknik asse kolaylaştıran, nanometre çözünürlükte donmuş, hidratlı neurites 3-D görselleştirme sağlarmorfolojik farklılıklar ssment. Bizim protokol dorsal kök ganglion (DRG) nevritler ve onların yakın yerli devlet hipokampal neurites bir görselleştirme görülmemiş bir görünüm verir. Gibi, bu yöntemlerin normal nöronlar ve nörolojik bozukluklar etkilenenlerin hem neurites gelecek çalışmalar için bir temel oluşturabilir.

Giriş

Nöronlar alt nöronlar ile iletişim kurmak için bilgi ve aksonlar, genellikle oldukça uzun, almak için dendrit detaylandırılması, merkezi ve periferal sinir sistemlerinin işlev için karmaşık devre esasını kurmak. Nörit gelişimi, sinir sisteminin eleştirel işlevini destekleyen embriyonik gelişim ve nöronal farklılaşma ve neurites bakımı sırasında temel bir rol oynamaktadır. Nöritik işlemleri de nöronal hasar ve rejenerasyon, hem de sinir sistemi bozukluklarında kritik bulunmaktadır. Nöronal mimari çalışma hem normal ve hastalıklı beyin anlamak için çok önemlidir. Neyse ki, fizyolojik olarak ilgili nöronal hücre kültürü sistemleri karmaşık ve heterojen hücre yapıları özetlemek için mevcuttur. Katı deneysel platformlarda, nöronal morfoloji kalitatif ve kantitatif analizleri sağlayacak etkili görselleştirme stratejileri aydınlatılması dayanarak ihtiyaç vardır. Özellikle yararlı olurnanometre ölçeğinde nevritlerle, hem akson ve dendrit görselleştirmek için tutarlı bir platform sağlar ayrıntılı bir metodoloji.

Geleneksel elektron mikroskobu gerçek durumundan örneklerinde bozulmalara neden olabilir ki, dehidrasyon ve reçine yerleştirmesi sırasında organik çözücünün kullanılmasını gerektirir. Böylece bulgular 4,9,25 yorumlanmasını sınırlayıcı - Bugüne kadar, nanometre ölçeğinde en fazla yapısal karakterizasyon gibi sert kimyasallara maruz kalan daha büyük hücrelere veya dokulara dayanmaktadır. Ayrıca, elektron ışını penetrasyon için, 1 mikron kesit 12 daha büyük olan bir kalınlık arzeden organizma veya hücre uzantılar için gereklidir. Nihayet, neurites uzatılmış özelliği hantal tanımı yaparak, ayrık dilim özgü veri setleri toplama doku sonuçları kesitli veya öğütülmüş. Hatta cryo-EM için, bir dondurulmuş, hidratlanmış numune kesit mümkün olduğu, yöntem, sıkıştırma artif getirmektedir1, hareket eder.

Son yıllarda, araştırmacılar EM ızgaraları ve flaş dondurma sonradan cryo-ET 8,10,18,23 kullanarak nevritlerle görselleştirmek için sıvı etan onları doğrudan hipokampal nöronlar büyümeye nasıl öğrendim. Ancak, bu tür çalışmalar, bir ısmarlama cihaz 10,23, ya da rutin görselleştirme 8,18 için yeterince ince vitreus buz üretmek için kurutma adım eksikliği bilgilerini kullanın ya. Örneğin, bir çalışma EM ızgara 10 lekeleme için 30-40 sn kullanılmasını önerir, ancak bu değer genel kullanım için optimize edilmiş değil ama bu ölçüye dalma-dondurma cihaz için özeldir. Dalma-dondurma örnek öncesinde nem korumak için özel yapılmış bir cihaz yerine piyasada mevcut bir 17 Kullanımı yaygın tekrarlanabilirlik için bir engel teşkil edebilir.

Bu çalışmalar Cryo-ET tarafından nevritlerle görselleştirme çığır olsa da, biz ap keşfetmek için bir adım daha almışnöronal numuneler (hipokampal ve dorsal kök ganglion nöronlarının) çeşitli cryo-ET plicability. Ayrıca, optimal ve optimal sonuçları yanı sıra, böyle bir numune için kriyo-ET kullanarak karşılaşabileceği potansiyel eserler hem de tartışmak.

Yakın bir yerli devlet korunması ve nanometre ölçeğinde bütün nevritlerle görselleştirmek için detaylı bir teknik tanımlama ultrastrüktürel çalışmalar yürütmek için daha fazla araştırmacılar için yeteneğini geliştirmek olacaktır. Bu amaçla, nevritler görselleştirmek için sabitlenmemiş, boyanmamış nöronlar hazırlamak için ticari olarak temin edilebilen ekipman kullanılarak etkili ve detaylı bir protokol açıklar. Bu sağlıklı neurites ultrastrüktürünü detaylandırma ve yapısal farklılıkları sinir sistemi hastalık modellerinde mevcut ne anlamak için zemin hazırlamaya yönelik önemli bir ilk adımdır. Cryo-ET nanometre ölçeğinde 3-D sabitlenmemiş, boyanmamış nörit özelliklerini çözebilirsiniz yana, yöntem mümkün asla gibi olacaktır yapacaknevritik mimarisini 12 tanımlamak için fore.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1.. Kaplama İlköğretim Nöronlar EM Izgaralara Yemekleri Hazırlama

  1. En az 25X büyütmede ışık mikroskobu kullanarak altın EM ızgaraları holey karbon bütünlüğünü inceleyin. Emin karbon delikleri>% 98 sağlam olduğundan emin olun.
  2. Birincil nöronları kaplama için, EM ızgaraları alev sterilize ve aynı anda onları hidrofilik işlemek için bir Bunsen beki kullanın. Kenarıyla değil, merkezi ızgarah alanı ile EM ızgara almak için cımbız kullanın. DİKKAT: gözetimsiz yanan bir Bunsen beki bırakmayın ve bu adımları gerçekleştirirken plastik bileşenleri ile eldiven veya cımbız kullanmayın:
    1. Bunsen Ocağı yakmadan önce, bir minimal açık pozisyona hava ve gaz ayarı ayarlayın.
    2. Bir forvet çakmaktaşı ya da bütan çakmak kullanarak Bunsen beki yakin.
    3. Uzun boylu, açık mavi / mor alev içinde küçük, mavi bir iç alev elde etmek için hava ve gaz ayarı değiştirin. Iç alev ucu alevin sıcak parçasıdır. Altında topuzubrülör namlu hava brülör girme miktarını ayarlamak için açılabilir iken neath brülör, gaz brülör tüpü girme miktarını ayarlar. Hava ayarı saat yönünde çevirerek (mor alev sonuçlanan) havayı azaltır ve saat yönünün tersine (sarı bir alev sonuçlanan) havayı artırır.
    4. Karbon tarafı yukarı bakacak şekilde, iki kez alev aracılığıyla hızlı bir şekilde geçmek, EM ızgara tutun metal cımbız (hiç plastik parça) kullanma. Karbon tarafı daha mat (daha az parlak) görünür ve diğer tarafında daha grimsi tonu daha fazla olacaktır.
    5. Hemen Bunsen beki 10 cm mesafede yerleştirilmiş cam alt çanak merkezi haline ızgara (karbon-tarafı yukarı) aktarın. Çanak başına bir EM ızgara (Şekil 1) kullanın. Sadece presterilized olan cam alt yemekler, yani yoluyla gama radyasyon kullanın.
  3. Hala cam Bott içindeki EM ızgara korurken ızgara bütünlüğünü (karbon delikler sağlam) kontrol etmek için bir ışık mikroskobu kullanınom çanak (kirlenmesini önlemek için). Nöronlar ile temas edecek ızgara ya da bir şey üzerinde herhangi bir maddeyi uygularken, steril prosedür ve steril pipet uçları kullanın.
  4. Steril bir prosedür kullanılarak, bir doku kültürü kaputu, Petri kabı, merkezi cam bölgeye yavaş ve dikkatli bir şekilde, uygun olan kaplama maddesinin 250 ul geçerlidir. Uygun kaplama maddesi tamamı EM ızgara kapsar emin olun.
    1. Hipokampal nöronlar, daha önce tarif edildiği gibi hazırlanmıştır 19, kaplama maddesinin, poli-L-lisin (PLL, 1 mg / ml) kullanın. 250 ul tabak başına, EM ızgara başına gerekli olduğunu unutmayın, bu yüzden buna göre toplu ölçek. Dorsal kök ganglion (DRG) nöronlar için, aşağıdaki gibi hazırlamak, kaplama madde olarak (Malzeme ve reaktiflerin tabloya bakınız) Engelbreth-Holm-Swarm (ÇSG) fare sarkoma hücreleri tarafından salgılanan bir protein jelatinli karışımı kullanın. 250 ul tabak başına, EM ızgara başına gerekli olduğunu unutmayın, bu yüzden buna göre toplu ölçek.
      1. Bir stok şişe Çözülme4 ° C de bir gece Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) fare sarkom hücreleri tarafından salgılanan jelatinimsi protein karışımının
      2. Soğuk Ol Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), fare sarkoma hücreleri, buz üzerinde tutarak, yani çözelti yapılması için kullanılan bütün bileşenleri, salgılanan protein jelatinimsi karışım.
      3. Buz üzerinde, bir 1:20 seyreltme vermek üzere, Neuro temelli ortam içinde bu, jelatinimsi protein karışımı seyreltik da (örneğin, Neuro temelli 10 ml jelatinimsi protein karışımının 500 ul seyreltik).
      4. Bölme 1 ml alikotlar halinde, jelatinimsi protein karışımı seyreltildi ve hemen -20 ° C'de fazladan alikotları depolamak
      5. Bölüm 1.4 'de tarif edildiği gibi, çanak başına EM grid başına 250 mikrolitre uygulayın.
  5. Onun üst Petri kabı kapağı ve (hipokampal numuneler için iki PLL ile, OR DRG örnekler için, jelatinimsi protein karışımı ile) inkübe doku kültürü kaputu oda sıcaklığında 1 saat karıştırıldı.
  6. Aspi(hipokampal numuneler için) tüm PLL veya yemekler (DRG numuneler için) jelatinli protein karışımı değerlendirirsiniz. Bunu yapmak için, doku kültürü kaputu vakum sistemini kullanır. Vakum tüpüne bağlanmış bir steril pipet kullanın. EM ızgara ile doğrudan temastan kaçının.
  7. Dikkatlice EM ızgara tamamen PBS ile kaplanmıştır, öyle ki her bir Petri kabı içinde merkezi cam alanında, EM şebekeye steril PBS (fosfat-tamponlu tuzlu su) içinde 250 ul uygulamak için ayarlanabilir bir hava-yer değiştirme pipet kullanın. Daha sonra, her bir tabaktan PBS aspire. 3x tekrarlayın.
  8. EM ızgaraları ile yemekleri 15 dakika süreyle doku kültürü kaputu altında kurumaya bırakın. Onlar doku kültürü odasında ışık mikroskobu altında kontrol ederek tamamen kuru olduğundan emin olun. Emin kılavuzunda nem hava kabarcığı olmadığından emin olun. Eğer öyleyse, dikkatle aspire yanındaki EM ızgara için bu ekstra nem ortadan kaldırmak için. Kaplanmış ızgara nöronları kaplama için hemen kullanılmalıdır.

2. Hazırlanması ve PlEM Izgaralar üzerinde ating İlköğretim Nöronlar

  1. Daha önce 19 açıklandığı gibi, tek tek hücrelere hippocampi (veya 18 gün eski sıçan embriyoların dorsal kök ganglion) ayırmak için birincil nöronları, ilk teşrih, trypsinize (% 2.5 tripsin kullanarak) ve çiğnemek plaka.
    1. Öğütün özellikle ateş cilalı ucu ile bir cam pipet kullanılarak, tek tek hücreler içine hücre ayrıştırma kümeleri tanımlamak için neurobiologists tarafından kullanılan bir terimdir. Sonuç dikkatlice ve yavaşça pipet aracılığıyla (~ 30), yukarı ve aşağı, birden çok kez hücreleri çekme ve bırakılmasıyla elde edilir.
  2. Fare için daha uygundur önerilen enzimler (papain, kolajenaz / dispaz) kullanmak yerine, sıçan DRG nöronlarını izole edilmesi için (HBSS)% 0.25 tripsin kullanımı dikkate alarak, daha önce DRG diseksiyon ve hücre 24 izolasyonu için açıklanan prosedürleri takip DRG nöronları.
  3. (Örneğin bir hemasitometre kullanılarak) izole nöronların sayısını hesaplayınve tabak başına 50,000 hücre / ml 'lik bir konsantrasyon elde etmek için her bir çanak uygulamak için hücrelerin uygun hacmi hesaplamak için bu değerini kullanın. Uygulamak için maksimum hacmi 250 ul. Bu sadece merkezi cam alanını değil, tüm yemeğin doldurur unutmayın.
  4. 37 ° C 'de, bir CO2 kuluçka makinesi içinde 30 dakika için inkübe yemekler Hücreleri kurtarmak ve uymak için izin verin.
  5. Yavaşça EM ızgara bozmamaya özen, her yemeğin ısıtılmış medya 1.5 ml ekleyin. Ortamının tipi, hücre tipi (hipokamp veya DRG) bağlıdır.
    1. Kullanımdan önce, 37 ° C su banyosu içinde ısıtıldı olmaktır hipokampal nöronlar 19 ya da dorsal kök ganglion nöronlarının 24, her iki için uygun ortam hazırlar. CO2 inkübatör içinde bir gece boyunca inkübe yemekler.
    2. Hipokampalinden için, ertesi gün ortamı değiştirmek. 14 gün boyunca her iki günde bir ileriye ortamın yarısı değiştirin. Kullanımdan önce, 37 ° C su banyosu içinde ortam ısıtın.
    3. DRG nöronları için, diseksiyon / kaplama takip eden gün, bir anti-mitotik ajan (Üridin ve 5'-floro-2'-deoksiüridin) ayrı olarak, her bir 10 mM stok çözelti yapmak ortam ile yeni bir stok hazırlamak, nihai kullanımı Her biri için 10 uM konsantrasyonu. DRG medya (875 ul) yarısı çıkarın ve anti-mitotik madde ile taze medya 875 ul ekleyin.
      1. DRG nöronlar için, ilk hafta için her iki gün, alternatif anti-mitotik medya ve standart DRG medya arasındaki ortam değişiyor. Ikinci hafta için, her iki gün standart DRG ortamı değiştirmek.

3. EM Izgaralar üzerinde Nöronlar camlaştıncı

  1. Kriyojenik sıcaklıkta altın EM ızgaraları dondurulması ve depolanması için ekipman ve tüm malzemeleri hazırlayın: bir nem odası 17 ile vitrifikasyon cihazı, sıvı azot vitrifikasyon makine, uzun düz uçlu cımbız, termosun (ler) için ince nokta uzman cımbız (LN 2), coolant konteyner, EM ızgara saklama kutusu, kalsiyum-ücretsiz filtre kağıdı.
  2. Vitrifikasyon cihazı başlatın. 32 ° C'ye kadar% 100 ve sıcaklık nem ayarlayın "Konsol" bölümünde, sıfır saniye leke saati ayarlayın. Bu, vitrifikasyon makinenin nem odası yan pencereden lekeleme kılavuzu sağlar.
  3. Üç kağıtlar yığılmış şekilde onları katman, eldiven ile kalsiyum ücretsiz filtre kağıdı tutun. Yaklaşık 2 cm uzunluğunda 0.5 cm genişliğinde şeritler halinde yığını kesin. Kağıdın bir tarafı x 0.5 cm yüz (Şekil 2) 0.5 cm olan böyle bir 90 ° açıyla bükün. Cımbız kullanarak, orta kağıdı çıkarın ve kullanıma kadar başka bir kalsiyum ücretsiz filtre kağıdı üzerine yerleştirin.
  4. Vitrifikasyon odası içinde düğme tutucu ızgara depolama düğmesine koyun. Sıvı azot ile soğutma kabın iç bölmeyi doldurmak ve tam buharlaştırma kadar bekleyin. Th dış bölmeyi doldurmaksıvı nitrojen ile e soğutucu kap bir sonraki adıma geçilir için kararlı bir sıcaklık elde edene kadar. Soğutulan odası içinde bir sıvı duruma yoğuşur yüksek saflıkta gaz etan ile iç bölmesini doldurun.
  5. Hemen yakınında vitrifikasyon odasına ulaşım için büyük bir 100 mm polistiren çanak inkübatör çanağı (es) hareket, eğer değil. Dikkatli çanak EM ızgara almak için özel vitrifikasyon cımbız kullanın. Nöronlar EM ızgara üzerinde büyüyor hangi tarafa unutmayın; pozisyon bir sonraki adım için önemli olacaktır. Güvenli EM ızgara üzerinde cımbız kilitlemek için cımbız üzerinde siyah sürgülü kilidini kullanın.
  6. Vitrifikasyon makine nöronlar uzakta vitrifikasyon makinenin yan açıklık deliğinden, sola yüzleri yapıştırılır üzerinde EM ızgaranın şekilde yan içine cımbız yerleştirin. Vitrifikasyon makinenin içine özel cımbız çekin.
  7. Uygun tutucuya soğutucu kap yerleştirinvitrifikasyon Makinenin. Yeterli LN 2 ve sıvı etan ile dolu olmalıdır. Bu nem odası alt ile yıkandı olana kadar vitrifikasyon makinenin uygun ekran komutunu kullanarak, yukarı doğru, soğutucu bölmeyi yükseltmek.
  8. Düz nokta cımbız ile, daha kısa yan (0.5 cm x 0.5 cm yüz) cımbız dik olduğu şekilde, filtre kağıdının bir kenarından kavramak. Bu yüz (Şekil 2B) kaydedilmek üzere EM ızgara ile doğrudan temas edecek. Dikkatlice vitrifikasyon makinenin nem odası yan delik (Şekil 2A) içine filtre kağıdı yerleştirin. Kararlı şekilde 10 saniye için (yan uzak örnekten bakan) EM ızgara karşı kağıdı tutun. Sonra kağıt atmak ve hemen vitrifikasyon makinenin otomasyon kullanılarak sıvı etan örnek dalma-dondurma.
  9. Dikkatli birinde yuvalardan birine dondurulmuş-sulu EM ızgara transferiızgara depolama düğmeleri. Yemekleri ek EM ızgaraları için işlemi tekrarlayın. Bu deneylerde kullanılan EM ızgara depolama düğmeleri çok dondurulmuş hidratlanmış EM ızgaraları depolayabilir.

4. Görüntü Toplama, İşleme ve Annotation

  1. 2-D elektron mikrograflannı ve / veya düşük doz koşul altında bir kriyo-elektron mikroskobu kullanarak neurites 3-D tilt serisi 5 toplamaya devam. 2-D görüntüler 3-D tilt serisi için yararlı olması için buz kalınlığı ve olası alanlar açısından ızgara kalitesini değerlendirmek amaçlanmıştır.
    1. Bu durumda, her görüntü / 7 um ve 4.4 arasında örnekleme underfocus bir hedefe 20k büyütmede mikroskop, tek bir eğim sıvı azot cryo buraya tutucu ile donatılmış bir 200 kV elektron mikroskobu bağlanmış bir 4k x 4k CCD kamera kullanılarak toplandı piksel.
    2. Aşamalı örnek al eğerken örnek bir 3D tomogram edinmek için, projeksiyon görüntüleri bir dizi çekmektransmisyon elektron mikroskobu (TEM) ong bir eksen. Eğim açıları ve diğer deneysel ayarları göz önüne alındığında, otomatik eğim serisini 5 toplamak için mevcut birkaç farklı yazılımlar vardır. Burada gösterilen 3-D tilt serisi ~ 60 e / Å 2 kümülatif dozu ile 5 ° artışlarla 60 ° -60 ° aralığında yarı-otomatik tilt serisi toplama yazılımı kullanarak 26 aynı mikroskop üzerinde toplanmıştır.
  2. Daha önce diğer numuneler 5,29 için açıklanan görüntü işleme yazılımı kullanarak 21 neurites eğim dizi yeniden yapılandırma.
  3. İlk tomogram segmentlere ve daha önce 5 açıklandığı gibi 3 boyutlu görüntü işleme yazılımı kullanarak bir yüzey modeli oluşturarak neurites 3-D özellikleri Renk açıklama.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Önceki cryo-ET ile dondurma ve görüntüleme için, ışık mikroskobu ve görüntüler nöronlar üzerinde büyüdüğü EM ızgaranın alınmalıdır. Nöritler birbirleri ile önemli örtüşme olmaksızın açıkça görünür olmalıdır. Şekil 3A'da renkli bir kutu büyütüldüğünde nevrotiler ızgara kafes boyunca uzandığı Şekil 3B, daha yüksek büyütme göstermek için bir alanı temsil eder. Her ızgara-kare nöronlar ve onların nevritlerle destekleyen bir holey karbon film oluşur. Bu delikler, dışarı doğru çıkıntı nör...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Biz sıçan embriyonik nöronlar (dorsal kök ganglion ve hipokampus) altın, elektron mikroskobu (EM) ızgaralar üzerinde büyümüş ve 2-D cryo-EM ve 3-D kriyo-kullanarak görüntülü onların neurites için yeterince ince vitreus buz donmuş olabileceğini göstermektedir ET. Hipokampal nevrotiler önceden kriyo-ET 8,10,18,23 kullanarak görüntülü olsa da, bir protokol eksik olmuştur piyasada mevcut cihazlar kullanılarak başarılı çoğaltma için yeterince ayrıntılı. Araştırma hipokampal nevritlerle görselleştirmek için kriyo-E...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Teşekkürler

Bu araştırma NIH hibe (PN2EY016525 ve P41GM103832) tarafından desteklenmiştir. SHS Gulf Coast Konsorsiyum (NIH Hibe No T32EB009379) Disiplinlerarası Biyobilim Eğitim WM Keck Merkezi'nin Nanobiyoloji Disiplinlerarası Lisansüstü Eğitim Programı bir burs ile desteklenmiştir.

SHS, disseke büyüdü ve DRG ve hipokampus hücrelerini vitrifiye, cryo-EM ve DRG ve hipokampal akson kriyo-ET toplanan verileri, yeniden ve tilt serisi renk açıklamalı. MRG disseke ve MnR laboratuarında hipokampal hücreleri sağladı. SC tilt serisi açıklama destekli. SHS nöronlar incelemek ve büyümeye nasıl CW tarafından eğitildi. SHS, WCM ve WC deneyler tasarlanmıştı. SHS diğer yazarlar girişi ile el yazması hazırladı.

Bu video t Biozentrum Hücresel Görüntüleme ve NanoAnalytics (C-Cina) için Merkezi'nde çekildiÜniversite Basel diye. C-Cina Basel, İsviçre'de bulunan ETH Zürich arasında Biyosistem Bilimi ve Mühendisliği (D-BSSE) için Bölümü entegre edilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Dumont #7 CımbızElektron Mikroskobu Bilimleri72803-01EM ızgaraları işlemek için Cam
alt tabaklarMatTek Corp.P35G-1.5-10CNumune yetiştirmek için
Elektron mikroskobu ızgaralarıQuantifoilHoley Carbon, Au 200, R 2/2Numune yetiştirmek için
Kalsiyum içermeyen filtre kağıdıWhatman1541-055Leke numunesi için
Büyük düz uçlu uzun cımbızExcelta CorporationE003-000590, 25-SALekeleme numunesi için 
Vitrifikasyon cihazı ve cımbızFEIVitrobot Mark IIINumuneyi dondurmak için
Minigrid saklama kutularıTed Pella, Inc.160-40EM ızgaralarını depolamak için
Kriyo transfer tutucuGatan626 Tek Eğimli Sıvı Nitrojen Kriyo Transfer TutucuGörüntüleme örnekleri için
Yarı otomatik eğim serisi toplama yazılımıSerialEMhttp://bio3d.colorado.edu/SerialEM/Görüntüleme örnekleri için
Görüntü işleme yazılımıIMOD eTomohttp://bio3d.colorado.edu/imod/Görüntü işleme için
JEOL, Tokyoiçin transmisyon elektron mikroskobuJEM2100 LaB6 elektron mikroskobuGörüntüleme örnekleri için
4k x 4k CCD kameraGatanN/AGörüntüleme örnekleri için
3-D not alma yazılımıVisage Imaging GmbHAmira/Avizo3D verileri işlemek
için 2D görüntüleri dijital olarak birleştirme yazılımıAdobeAdobe Photoshop2-D veri işlemek için
DMEM, Yüksek GlikozInvitrogen11965-118Hipokampal kültür için
Borik asitSigma AldrichB-0252Hipokampal kültür için
Sodyum tetraboratSigma AldrichB-9876Hipokampal kültür için
Poli-L-lizin Sigma AldrichP2636-500MGHipokampal kültür için
Filtre sistemiCorning430758Hipokampal kültür için
Nörobazal ortamInvitrogen21103-049DRG kültürü için
B-27 takviyesiInvitrogen17504-044DRG kültürü için
Penisilin / StreptomisinInvitrogen15140-122DRG kültürü için
DRG kültürü içinGlutaMAXInvitrogen35050-061
Rekombinant sıçan b-NGFR& DRG kültürü için D Sistemleri556-NGDRG kültürü için
UridineSigmaU3003-5G
DRG kültürü için5'-Floro-2'-deoksiüridinSigmaF0503-100MG
DRG kültürü içinMatrigelBD Biosciences356234
CryoEM 200-kV

Kaynaklar

  1. Al-Amoudi, A., et al. Cryo-electron microscopy of vitreous sections. EMBO J. 23, 3583-3588 (2004).
  2. Benzing, W. C., Mufson, E. J., Armstrong, D. M. Alzheimer's disease-like dystrophic neurites characteristically associated with senile plaques are not found within other neurodegenerative diseases unless amyloid beta-protein deposition is present. Brain Res. 606, 10-18 (1993).
  3. Binks, B. P. Modern characterization methods of surfactant systems. , Marcel Dekker. New York, New York, USA. (1999).
  4. Briggman, K. L., Denk, W. Towards neural circuit reconstruction with volume electron microscopy techniques. Curr. Opin. Neurobiol. 16, 562-570 (2006).
  5. Chen, S., et al. Electron cryotomography of bacterial cells. J. Vis. Exp. (39), e1943(2010).
  6. DiFiglia, M., et al. Aggregation of huntingtin in neuronal intranuclear inclusions and dystrophic neurites in brain. Science. 277, 1990-1993 (1997).
  7. Dubochet, J., Chang, J. J., Freeman, R., Lepault, J., McDowall, A. W. Frozen aqueous suspensions. Ultramicroscopy. 10, 55-61 (1982).
  8. Fernández-Busnadiego, R., et al. Insights into the molecular organization of the neuron by cryo-electron tomography. J. Electron Microsc. 60, 137-148 (2011).
  9. Frey, T. G., Perkins, G. A., Ellisman, M. H. Electron tomography of membrane-bound cellular organelles. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35, 199-224 (2006).
  10. Garvalov, B. K., et al. Luminal particles within cellular microtubules. J. Cell. Biol. 174, 759-765 (2006).
  11. Grünewald, K., Cyrklaff, M. Structure of complex viruses and virus-infected cells by electron cryo tomography. Curr. Opin. Microbiol. 9, 437-442 (2006).
  12. Gu, J., Bourne, P. E. Structural bioinformatics. , Wiley-Blackwell. Hoboken, New Jersey, USA. (2009).
  13. De Hoop, M. J., Meyn, L., Dotti, C. G. Culturing hippocampal neurons and astrocytes from fetal rodent brain. Cell Biology: A Laboratory Handbook. 1, W.H. Freeman. New York, New York, USA. (1998).
  14. Denk, W., Horstmann, H. Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy to Reconstruct Three-Dimensional Tissue Nanostructure. PLoS Biol. 2, e329(2004).
  15. Fink, C. C., et al. Selective regulation of neurite extension and synapse formation by the beta but not the alpha isoform of CaMKII. Neuron. 39, 283-297 (2003).
  16. Jacob, W. A., et al. Mitochondrial matrix granules: their behavior during changing metabolic situations and their relationship to contact sites between inner and outer mitochondrial membranes. Microsc. Res. Tech. 27, 307-318 (1994).
  17. Jensen, G. J., Briegel, A. How electron cryotomography is opening a new window onto prokaryotic ultrastructure. Curr. Opin. Struct. Biol. 17, 260-267 (2007).
  18. Ibiricu, I., et al. Cryo Electron Tomography of Herpes Simplex Virus during Axonal Transport and Secondary Envelopment in Primary Neurons. PLoS Pathog. 7, e1002406(2011).
  19. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
  20. Koning, R. I., et al. Cryo electron tomography of vitrified fibroblasts: microtubule plus ends in situ. J. Struct. Biol. 161, 459-468 (2008).
  21. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J. Struct. Biol. 116, 71-76 (1996).
  22. Lotharius, J., Brundin, P. Pathogenesis of Parkinson's disease: dopamine, vesicles and alpha-synuclein. Nat. Rev. Neurosci. 3, 932-942 (2002).
  23. Lucić, V., et al. Multiscale imaging of neurons grown in culture: from light microscopy to cryo-electron tomography. J. Struct. Biol. 160, 146(2007).
  24. Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and. 2, 152-160 (2007).
  25. Marsh, B. J. Lessons from tomographic studies of the mammalian Golgi. Biochim. Biophys. Acta. 1744, 273-292 (2005).
  26. Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. J. Struct. Biol. 152, 36-51 (2005).
  27. Medalia, O., et al. Organization of actin networks in intact filopodia. Curr. Biol. 17, 79-84 (2007).
  28. Medalia, O., et al. Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography. Science. 298, 1209-1213 (2002).
  29. Meyerson, J. R., et al. Determination of molecular structures of HIV envelope glycoproteins using cryo-electron tomography and automated sub-tomogram averaging. J. Vis. Exp. (58), e2770(2011).
  30. Nakatomi, H., et al. Regeneration of Hippocampal Pyramidal Neurons after Ischemic Brain Injury by Recruitment of Endogenous Neural Progenitors. Cell. 110, 429-441 (2002).
  31. Peachey, L. D. Electron Microscopic Observations on the Accumulation of Divalent Cations in Intramitochondrial Granules. J. Cell. Biol. 20, 95-111 (1964).
  32. Raza, M., et al. Aging is associated with elevated intracellular calcium levels and altered calcium homeostatic mechanisms in hippocampal neurons. Neurosci. Lett. 418, 77-81 (2007).
  33. Scroggs, R. S., Fox, A. P. Calcium current variation between acutely isolated adult rat dorsal root ganglion neurons of different size. J. Physiol. 445, 639-658 (1992).
  34. Squire, L. R. Fundamental neuroscience. , Academic Press. Amsterdam; Boston. (2003).
  35. Sulzer, D. Multiple hit hypotheses for dopamine neuron loss in Parkinson's disease. Trends Neurosci. 30, 244-250 (2007).
  36. Tapia, J. C., et al. Early expression of glycine and GABA(A) receptors in developing spinal cord neurons. Effects on neurite outgrowth. Neuroscience. 108, 493-506 (2001).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

N rit G rselle tirmeElektron Mikroskobu IzgaralarVitrifikasyon Prosed rHipokampal N ronlarDorsal K k GanglionuNanometre z n rl k3B Rekonstr ksiyon
Cryo-Elektron Tomografi kullanma Frozen-hidratlı Devlette neurites görselleştirme İlköğretim Nöronlar hazırlanması
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.