Ince yapı analizi için nöronal işlemleri korumak için, camsı bir buz tabakası içinde süspansiyon haline numune verecek şekilde flaş dondurma, ardından elektron mikroskobu taramalarında primer nöron kaplanması için bir protokol açıklar. Bu örnekler nanometre ölçeğinde yapıları görselleştirmek için bir kriyo-elektron mikroskobu ile muayene edilebilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Cryo-Elektron Tomografi kullanma Frozen-hidratlı Devlette neurites görselleştirme İlköğretim Nöronlar hazırlanması
Bu makalede
Özet
Özet
Nöritler, hem dendrit ve aksonlar, nöronlar arasındaki elektriksel uyarıların iletimini sağlayacak nöronal hücresel süreçleri vardır. Neurites yapısının tanımlanması, bu işlemler, sinaptik iletişim destek malzemeleri ve sinyalleri nasıl hareket anlamak için çok önemlidir. Elektron mikroskopisi (EM) geleneksel nevritlerin içindeki ultrastrüktürel özellikleri değerlendirmek için kullanılmıştır, ancak dehidrasyon ve reçine yerleştirmesi sırasında organik çözücüye maruz kalma yapıları bozabilmektedir. Önemli bir karşılanmamış hedefi böyle eserler etkilenmez yapısal değerlendirmeler için izin prosedürlerin oluşturulmasıdır. Burada, biz büyüyen ve kriyo-elektron tomografisi (kriyo-ET) ile muayene ile takip elektron mikroskobu ızgaraları farklı primer nöronlar flaş dondurma bütün nevrotiler için detaylı ve tekrarlanabilir bir protokol kurduk. Bu teknik asse kolaylaştıran, nanometre çözünürlükte donmuş, hidratlı neurites 3-D görselleştirme sağlarmorfolojik farklılıklar ssment. Bizim protokol dorsal kök ganglion (DRG) nevritler ve onların yakın yerli devlet hipokampal neurites bir görselleştirme görülmemiş bir görünüm verir. Gibi, bu yöntemlerin normal nöronlar ve nörolojik bozukluklar etkilenenlerin hem neurites gelecek çalışmalar için bir temel oluşturabilir.
Giriş
Nöronlar alt nöronlar ile iletişim kurmak için bilgi ve aksonlar, genellikle oldukça uzun, almak için dendrit detaylandırılması, merkezi ve periferal sinir sistemlerinin işlev için karmaşık devre esasını kurmak. Nörit gelişimi, sinir sisteminin eleştirel işlevini destekleyen embriyonik gelişim ve nöronal farklılaşma ve neurites bakımı sırasında temel bir rol oynamaktadır. Nöritik işlemleri de nöronal hasar ve rejenerasyon, hem de sinir sistemi bozukluklarında kritik bulunmaktadır. Nöronal mimari çalışma hem normal ve hastalıklı beyin anlamak için çok önemlidir. Neyse ki, fizyolojik olarak ilgili nöronal hücre kültürü sistemleri karmaşık ve heterojen hücre yapıları öz....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1.. Kaplama İlköğretim Nöronlar EM Izgaralara Yemekleri Hazırlama
- En az 25X büyütmede ışık mikroskobu kullanarak altın EM ızgaraları holey karbon bütünlüğünü inceleyin. Emin karbon delikleri>% 98 sağlam olduğundan emin olun.
- Birincil nöronları kaplama için, EM ızgaraları alev sterilize ve aynı anda onları hidrofilik işlemek için bir Bunsen beki kullanın. Kenarıyla değil, merkezi ızgarah alanı ile EM ızgara almak için cımbız kullanın. DİKKAT: gözetimsiz yanan bir Bunsen beki bırakmayın ve bu adımları gerçekleştirirken plastik bileşenleri ile eldiven veya cımbız kullanmayın:
- Bunsen Ocağı yakmadan önce, bir minimal açık pozisyona hava ve ga....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Önceki cryo-ET ile dondurma ve görüntüleme için, ışık mikroskobu ve görüntüler nöronlar üzerinde büyüdüğü EM ızgaranın alınmalıdır. Nöritler birbirleri ile önemli örtüşme olmaksızın açıkça görünür olmalıdır. Şekil 3A'da renkli bir kutu büyütüldüğünde nevrotiler ızgara kafes boyunca uzandığı Şekil 3B, daha yüksek büyütme göstermek için bir alanı temsil eder. Her ızgara-kare nöronlar ve onların nevritlerle destekleyen bir holey karbon film oluşur. Bu delikler, dışarı doğru çıkıntı nör.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Biz sıçan embriyonik nöronlar (dorsal kök ganglion ve hipokampus) altın, elektron mikroskobu (EM) ızgaralar üzerinde büyümüş ve 2-D cryo-EM ve 3-D kriyo-kullanarak görüntülü onların neurites için yeterince ince vitreus buz donmuş olabileceğini göstermektedir ET. Hipokampal nevrotiler önceden kriyo-ET 8,10,18,23 kullanarak görüntülü olsa da, bir protokol eksik olmuştur piyasada mevcut cihazlar kullanılarak başarılı çoğaltma için yeterince ayrıntılı. Araştırma hipokampal nevritlerle görselleştirmek için kriyo-E.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.
Teşekkürler
Bu araştırma NIH hibe (PN2EY016525 ve P41GM103832) tarafından desteklenmiştir. SHS Gulf Coast Konsorsiyum (NIH Hibe No T32EB009379) Disiplinlerarası Biyobilim Eğitim WM Keck Merkezi'nin Nanobiyoloji Disiplinlerarası Lisansüstü Eğitim Programı bir burs ile desteklenmiştir.
SHS, disseke büyüdü ve DRG ve hipokampus hücrelerini vitrifiye, cryo-EM ve DRG ve hipokampal akson kriyo-ET toplanan verileri, yeniden ve tilt serisi renk açıklamalı. MRG disseke ve MnR laboratuarında hipokampal hücreleri sağladı. SC tilt serisi açıklama destekli. SHS nöronlar incelemek ve büyümeye nasıl CW tarafından eğitildi. S....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Dumont #7 Cımbız | Elektron Mikroskobu Bilimleri | 72803-01 | EM ızgaraları işlemek için Cam |
| alt tabaklar | MatTek Corp. | P35G-1.5-10C | Numune yetiştirmek için |
| Elektron mikroskobu ızgaraları | Quantifoil | Holey Carbon, Au 200, R 2/2 | Numune yetiştirmek için |
| Kalsiyum içermeyen filtre kağıdı | Whatman | 1541-055 | Leke numunesi için |
| Büyük düz uçlu uzun cımbız | Excelta Corporation | E003-000590, 25-SA | Lekeleme numunesi için |
| Vitrifikasyon cihazı ve cımbız | FEI | Vitrobot Mark III | Numuneyi dondurmak için |
| Minigrid saklama kutuları | Ted Pella, Inc. | 160-40 | EM ızgaralarını depolamak için |
| Kriyo transfer tutucu | Gatan | 626 Tek Eğimli Sıvı Nitrojen Kriyo Transfer Tutucu | Görüntüleme örnekleri için |
| Yarı otomatik eğim serisi toplama yazılımı | SerialEM | http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ | Görüntüleme örnekleri için |
| Görüntü işleme yazılımı | IMOD eTomo | http://bio3d.colorado.edu/imod/ | Görüntü işleme için |
| JEOL, Tokyo | için transmisyon elektron mikroskobu | JEM2100 LaB6 elektron mikroskobu | Görüntüleme örnekleri için |
| 4k x 4k CCD kamera | Gatan | N/A | Görüntüleme örnekleri için |
| 3-D not alma yazılımı | Visage Imaging GmbH | Amira/Avizo | 3D verileri işlemek |
| için 2D görüntüleri dijital olarak birleştirme yazılımı | Adobe | Adobe Photoshop | 2-D veri işlemek için |
| DMEM, Yüksek Glikoz | Invitrogen | 11965-118 | Hipokampal kültür için |
| Borik asit | Sigma Aldrich | B-0252 | Hipokampal kültür için |
| Sodyum tetraborat | Sigma Aldrich | B-9876 | Hipokampal kültür için |
| Poli-L-lizin | Sigma Aldrich | P2636-500MG | Hipokampal kültür için |
| Filtre sistemi | Corning | 430758 | Hipokampal kültür için |
| Nörobazal ortam | Invitrogen | 21103-049 | DRG kültürü için |
| B-27 takviyesi | Invitrogen | 17504-044 | DRG kültürü için |
| Penisilin / Streptomisin | Invitrogen | 15140-122 | DRG kültürü için |
| DRG kültürü için | GlutaMAX | Invitrogen | 35050-061 |
| Rekombinant sıçan b-NGF | R& DRG kültürü için D Sistemleri | 556-NG | DRG kültürü için |
| Uridine | Sigma | U3003-5G | |
| DRG kültürü için | 5'-Floro-2'-deoksiüridin | Sigma | F0503-100MG |
| DRG kültürü için | Matrigel | BD Biosciences | 356234 |
Kaynaklar
- Al-Amoudi, A., et al. Cryo-electron microscopy of vitreous sections. EMBO J. 23, 3583-3588 (2004).
- Benzing, W. C., Mufson, E. J., Armstrong, D. M. Alzheimer's disease-like ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
