Eşzamanlı Elektrofizyolojik Kayıt ve Suprakiazmatik Nucleus Nöronlar Kalsiyum Görüntüleme

Özet

Prosedürler, membran potansiyelinin veya akımının eşzamanlı kayıtlarını ve hücre içi kalsiyum konsantrasyonundaki değişiklikleri gerçekleştirmek için tanımlanır. Suprakiazmatik çekirdek nöronları, tüm hücre yama kelepçesi konfigürasyonunda bir yama kelepçe elektrodu kullanılarak kalsiyum indikatörü bis-fura-2 ile doldurulur.

Özet

Hücre içi kalsiyum konsantrasyonunun düzenlenmesinde membran potansiyeli veya akımındaki değişikliklerin rolünü incelemek için eş zamanlı elektrofizyolojik ve floresan görüntüleme kayıt yöntemleri kullanıldı. Aydınlık-karanlık döngüsü gibi değişen çevresel koşullar, nöronal ve sinir ağı aktivitesini ve memeli beynindeki ana sirkadiyen saatin konumu olan suprakiazmatik çekirdek (SCN) içindeki bir sirkadiyen saat genleri ailesinin ifadesini değiştirebilir. Uyarıcı sinaptik iletim, sirkadiyen saat genlerinin ritmik ekspresyonunu değiştiren sinyal yollarını aktive ettiğine inanılan postsinaptik Ca^{2 +} konsantrasyonunda bir artışa yol açar. SCN içeren hipotalamik dilimler, kalsiyum indikatörü bis-fura-2 içeren bir iç çözelti ile doldurulmuş mikroelektrotlar kullanılarak yama klemplendi. Mikroelektrot ve SCN nöronal membranı arasında bir conta oluşturulduktan sonra, membran hafif emme kullanılarak yırtıldı ve kalsiyum probu hem soma hem de dendritleri dolduran nörona yayıldı. Hücre içi kalsiyum konsantrasyonunun kantitatif oransal ölçümleri, membran potansiyeli veya akımı ile eş zamanlı olarak kaydedildi. Bu yöntemleri kullanarak, sinaptik aktivite ve bireysel nöronların aksiyon potansiyeli ateşlemesi tarafından üretilen hücre içi kalsiyum konsantrasyonundaki değişikliklerin rolünü incelemek mümkündür. Bu sunumda, beyin dilimlerinde tutulan bireysel SCN nöronlarından hücre içi kalsiyum ile birlikte elektrofizyolojik aktiviteyi aynı anda kaydetme yöntemlerini gösteriyoruz.

Giriş

Gen ekspresyonundaki değişikliklerin, sinaptik sinyalleşmenin bir sonucu olarak nöronlarda meydana geldiği bilinmektedir. Uyarıcı nörotransmitter glutamat tarafından yapılan sinyalleme, nöronal membran potansiyelini depolarize edebilir ve sonunda gen transkripsiyonuna ve translasyona^{yol açabilir 1,2}. İyonotropik reseptörlerin glutamat tarafından aktivasyonu, hücre dışı kalsiyum iyonlarının hücreye girmesine izin verir, bu da gen transkripsiyonunu aktive etmede ikinci bir haberci olarak kritik bir rol oynadığı düşünülmektedir. Aksiyon potansiyeli ateşleme frekansı gibi membran elektriksel aktivitesi ile hücre içi kalsiyum konsantrasyonundaki değişiklikler ar....

Protokol

1. Hipotalamik Beyin Dilimlerinin Hazırlanması

1. Hayvanları içeren herhangi bir prosedür için Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) onayını önceden alın. Burada açıklanan hayvan prosedürleri, Hayvanların Ötenazisi için AVMA Yönergeleri 2013 ile uyumludur ve Oregon Sağlık ve Bilim Üniversitesi IACUC tarafından önceden onaylanmıştır.
2. MgCl₂ ve CaCl₂ olmadan 500 ml dilimleme tamponu hazırlayın (Tablo 1). Çözeltiyi oda sıcaklığında %95_O2 ve %5 CO₂ ile köpürtün, ardından havalandırmaya devam ederken MgCl₂ ve CaCl₂ ekleyin. Sükroz ile ....

Sonuçlar

Hipotalamik beyin dilimleri kullanarak, hem voltaj hem de akım klempi koşulları altında, bütün hücre modunda hücre içi kalsiyumdaki değişimleri eş zamanlı olarak kaydettik. Şekil 1A'da gösterilen mikroelektrot, düşük miktarda uygulanan pozitif basınçla, yüksek büyütme altında (40X veya 63X UV objektifleri) uygun konuma indirilir. Nörona temas ettikten sonra, hafif bir vakumla gigaohm sızdırmazlığı oluşturulur. Voltaj klempi modunda hücre membran potansiyeli -60 mV'ye ayarlandıktan sonra, ek vakumla membr.......

Tartışma

Yukarıda açıklanan yöntemler, nöron zarı elektriksel aktivitesi ile hücre içi kalsiyum konsantrasyonu arasındaki bağlantıyı aynı anda kaydetmek için güçlü bir araç sağlar. Yöntemin, çok iyi karakterize edilmiş iki yöntemi birleştirmesi bakımından bir takım güçlü yönleri vardır - tüm hücre yama kelepçesi kaydı ve floresan boyalar kullanılarak hücre içi kalsiyumun ölçümü. Yaklaşımımız, diğer araştırmacılar tarafından tanımlananlara benzer^_6,23.

Yöntem kullanılırken bir dizi .......

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
NaCl	Balıkçı Bilimsel A.Ş.	S271-3
KCl	Fisher Bilimsel A.Ş.	P217-500
NaH2PO4&boğa; H2O	Sigma Kimya A.Ş.	S-9638
MgCl2 boğa; 6H2O	Fisher Scientific Co.	M33-500
CaCl2 boğa; 2H2O	Fisher Scientific Co.	C79-500
D-glikoz	Fisher Scientific Co.	D16-500
NaHCO3	Fisher Scientific Co.	S233-500
Sükroz	Fisher Bilimsel A.Ş.	S5-500
Potasyum D-glukonat	Sigma-Aldrich	G4500
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
Adenozin 5 asal, - trifosfat dipotasyum tuzu dihidrat	Sigma-Aldrich	A8937
Guanozin 5 & asal; -trifosfat tris tuzu	Sigma-Aldrich	G9002
Agaroz (ultra saf)	Hayat Teknolojiler	15510-027	Steril Petri kabına gözenekli jel 6 mm kalınlığında tabaka
KOH	Sigma-Aldrich	P-6310
NaOH	Sigma-Aldrich	S-5881
Bis-fura-2, heksapotasyum tuzu	Invitrogen	B6810	Hücre geçirimli
Ekipman Adı		Şirket Katalog Numarası	Yorumlar
Mikrotom	Leica	VT1000S	Doku dilimleme
Siyanoakrilik yapıştırıcı (Roti-Coll1)	Carl Roth GmbH+Co	Art-Nr. 0258.1
Mikroelektrot çektirme	Narshige International USA	PP-83
Mikroelektrot Kılcal Borular	Dünya Hassas Aletler	1B150F-4
Microfil 34 g	Dünya Hassas Aletler	MF34G-5
Şırınga filtresi	Corning	# 431212
Mikroskobu	Leica	DM LFS	4X, 40X UV ve 63X UV objektifleri ve epifloresan
CCD Kamera	Hamamatsu	ORCA ER	12 bit CCD
Fura-2 Filtre Küpü	Chroma	71500A	UG11 filtreli
Set Polikrom IV	Fotonik GmBH		Monokronometre
Ultraviyole engelleyici güvenlik gözlükleri	Ultraviyole Ürünler
EPC-9 amplifikatör	HEKA Eletronik
Metafluor	Moleküler Cihazlar		Görüntüleme Yazılımı
Patchmaster	HEKA Eletronik		Veri Toplama Yazılımı
Igor sürüm 6	Wavemetrics		Elektrofizyoloji & Ca2+ Veri Analizi
VAPRO 5520	Westcor		Buhar basıncı ozmometresi