Yöntem makalesi

Büyüme, Bakım ve Temel Karakterizasyonu: Atık Su Elektroaktif mikrobiyel filmlerin Türetilmiş

16.5K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/50800

⸱

29 Aralık 2013

 , 
1Department of Environmental Microbiology, UFZ - Helmholtz-Centre for Environmental Research

Bu makalede

Özet

Bir potansiyostat tarafından kontrol edilen üç elektrotlu bir kurulum kullanılarak beslenen kesikli bir reaktörde anodik elektroaktif mikrobiyal biyofilmlerin kronoamperometrik büyümesi gösterilmiştir. Hücre dışı elektron transferi, elektron vericisinin varlığında ve elektron vericisinin yokluğunda döngüsel voltametri kullanılarak karakterize edilir. Temel veri analizi gösterilmiştir.

Özet

Beslemeli kesikli bir reaktörde atık su aşısından anodik elektroaktif mikrobiyal biyofilmlerin büyümesi, bir potansiyostat tarafından kontrol edilen üç elektrotlu bir kurulum kullanılarak gösterilmiştir. Bu nedenle, potansiyostatların kullanılması, elektrot potansiyelinin tam olarak ayarlanmasına izin verir ve tekrarlanabilir mikrobiyal kültür koşulları sağlar. Büyüme sırasında mevcut üretim kronoamperometri (CA) kullanılarak izlenir. Bu verilere dayanarak, maksimum akım yoğunluğu (jmax) ve coulombic verimlilik (CE), biyoelektrokatalitik performansın karakterizasyonu için önlemler olarak tartışılmaktadır. Döngüsel voltametri (CV), tahribatsız, yani noninvaziv yöntem, elektroaktif bakterilerin hücre dışı elektron transferini (EET) incelemek için kullanılır. CV ölçümleri, mikrobiyal substratın varlığında anodik biyofilm elektrotlar üzerinde gerçekleştirilir, yani devir koşulları ve alt tabakanın yokluğunda, yani devir dışı koşullar, farklı tarama oranları kullanılarak. Daha sonra, veri analizi örneklendirilir ve mikrobiyal EET'nin temel termodinamik parametreleri türetilir ve açıklanır: tepe potansiyeli (Ep), tepe akım yoğunluğu (jp), biçimsel potansiyel (Ef) ve tepe ayrımı (ΔEp). Ek olarak, yöntemin sınırları ve son teknoloji veri analizi ele alınmaktadır. Bu nedenle, bu video makale, temel deneysel adımlar ve temel veri analizi için bir rehber sağlayacaktır.

Giriş

Mikrobiyal hücre dışı elektron transferinin (EET) temellerinin aydınlatılması ve mühendislik sistemlerinde kullanılması, hayati ve hızla artan bir araştırma ve geliştirme alanıdır1-3. Saf suşların yanı sıra tanımlanmış ko-kültürler ve karmaşık konsorsiyumlar da dahil olmak üzere bu elektroaktif (veya biyoelektrokatalitik veya elektrokimyasal olarak aktif) mikroorganizmaların incelenmesi, karmaşık bir teknik, yöntem ve protokol cephaneliği gerektirir4. Bu yöntemler, elektrokimya, malzeme bilimi, mikrobiyoloji gibi çeşitli bilimsel disiplinlerden türetilir ve farklı hiyerarşik düzeyler hakkında içgörüler sağlar. tüm mikrobiyal biyofilmden tek moleküllere kadar. Bu nedenle, elektrokimya ve elektrokimyasal yöntemler tüm faaliyetlerin temelini temsil eder.

Geleneksel olarak, yakıt hücresi tipi kurulumlar, bu mühendislik sistemlerinin arketipinde elektroaktif mikrobiyal kültürlerin büyümesi ve sürdürülmesi için sıklıkla kullanılmıştır: mikrobiyal yakıt hücreleri (MFC'ler)5. Ne yazık ki, bu tür MFC'ler genellikle tek bir elektrotun potansiyelinin izlenmesine ve hatta kontrol edilmesine izin vermedi ve bu nedenle, elektrot işlemlerinde yalnızca sınırlı içgörüler mümkün oldu - sadece hücre voltajı rapor edildi. Artık, MFC'lerdeki tek elektrotların potansiyellerinin bireysel olarak izlenmesi ve kontrolünün, yalnızca temel araştırmalar için değil, aynı zamanda mühendislik için de açık bir avantaj sağladığı giderek daha fazla kabul edilmektedir. Ayrıca, mikrobiyal biyoelektrokimyasal sistemler (BES)2,6,7 olarak adlandırılan sistemlerde iyileştirme, tuzdan arındırma, sentez ve hatta biyo-hesaplamayı içeren mikrobiyal elektrokimyasal teknolojilerin uygulamalarının çeşitlenmesiyle birlikte, bireysel elektrot potansiyellerinin harici kontrolü genellikle önemlidir. Bu kontrol genellikle harici güç kaynakları veya potansiyostatlar kullanılarak sağlanır. Bu nedenle, potansiyostatların kullanılması - diğer kurulum türlerinin aksine - bireysel elektrot potansiyelinin tam olarak ayarlanmasına izin verir. Elektrot, hücre dışı elektron transferinin terminal mikrobiyal elektron alıcısını (anotlar için) veya elektron vericisini (katotlar için) temsil ettiğinden, bu çok önemlidir. Şekil 1, anotlardaki mikrobiyal EET hakkındaki mevcut bilgi durumunu göstermektedir - ayrıntılar için bakınız, örneğin 2,4,6,8,9 Katottaki EET hala esas olarak kullanılmamıştır10.

Dolayısıyla, elektrot potansiyelinin kontrolü, yalnızca tekrarlanabilir bir mikrobiyal kültür koşullarının kullanılmasını değil, aynı zamanda EET termodinamiği açısından uyarlanmasını da sağlar11. Bu makalede, elektroaktif mikrobiyal biyofilmlerin karakteristik parametrelerinin kronoamperometri (CA) ve döngüsel voltametri (CV) kullanılarak beslemeli kesikli reaktör deneylerinden nasıl çıkarılabileceği gösterilmektedir. Bu, maksimum akım yoğunluğu (jmax) ve coulombic verimlilik (CE) performans parametrelerinin yanı sıra EET özelliklerini de içerir. Burada, olası ve gerçek elektron transfer bölgelerinin biçimsel potansiyellerinin (Ef) tanımlanması odak noktası olacaktır. Bu parametrelerin ekstraksiyonu, Geobacter spesifikasyonunun hakim olduğu atık sudan türetilmiş karışık kültür biyofilmleri örneğinde gösterilmiştir. 12 Bu atık sudan elde edilen biyofilmler, dünya çapında çok sayıda araştırma grubu tarafından gösterildiği gibi basit bir elektrokimyasal seçim prosedürü ile elde edilir13-16.

Mikrobiyal hücre dışı elektron transferini incelemek için dinamik elektrokimyasal teknikler

Elektroaktif mikrobiyal kültürlerin EET'sinin termodinamik karakterizasyonu için dinamik elektrokimyasal tekniklere ihtiyaç vardır. Genel olarak bu teknikler potansiyel kontrollü, yani voltametrik ve akım kontrollü, yani içerir. Galvanodinamik, teknikler17. Bu nedenle, potansiyel kontrollü teknikler daha yaygındır ve örneğin, kare dalga voltametrisi ve doğrusal süpürme voltametrisi18'i içerir. Bununla birlikte, en popüler olanı döngüsel voltametridir (CV)19,20. CV, pil araştırmalarından malzeme bilimine ve enzim biyoelektrokimyasına kadar elektrokimyanın farklı alanlarında iyi bilinir ve yaygındır21. Canlı mikrobiyal hücrelere uygulanması yalnızca on yıldan daha eskiye tarihlenebilir22 ve son yıllarda önemli ölçüde artar23,24. Özellikle CV ve spektroskopik yöntemlerin kombinasyonu, EET mekanizmaları ve moleküler doğası hakkında benzeri görülmemiş bilgiler sağlamıştır, örneğin 25,26 Buna paralel olarak, mikrobiyal EET'nin termodinamik ve teorik özelliklerinin çıkarılması için teorik çerçeve genişletildi ve derinleştirildi27-30. Bununla birlikte, aksine, deneysel yanlış kullanım veya yetersiz veri analizi, mikrobiyal biyoelektrokimya alanında CV'nin uygun şekilde uygulanmasını sıklıkla engellemektedir. Bu nedenle, atölye çalışmalarına (örneğin AB-ISMET 2012'de) ve öğreticidersler 19'a ek olarak, bu video makalesi elektroaktif bakteriler üzerinde döngüsel voltametrik deneylerin yürütülmesi için temel bir kılavuz sağlayacaktır. Bu nedenle, temel deneysel adımlara ve temel veri analizine odaklanır ve en son kinetik analiz protokollerini sağlamayı amaçlamaz. Aşağıdaki tartışma için en önemli terminaller Kutu 1'de özetlenmiştir (Harnisch ve Freguia19'dan uyarlanmış ve değiştirilmiştir).

Protokol

Biyoelektrokimyasal beslemeli kesikli reaktördeki seçim prosedürü, substrat seçimi ve anoksik koşullar nedeniyle çok spesifik olduğundan, gösterilen örnek için steril koşullarda çalışmak gerekli değildir.

1. Büyüme Ortamının Hazırlanması

  1. Kim ve arkadaşlarına göre bir fosfat tamponu kullanarak uygun miktarda büyüme ortamı hazırlayın.13 (bakınız Tablo 1). Burada, sodyum asetat (10 mM) substrat olarak görev yapmaktadır. Bu makalede kullanılan büyüme ortamı sadece bir örnektir ve deneysel amaca bağlı olarak bileşenlerinde değişiklik gösterebilir.
  2. İnokulum olarak 20 ml büyüme ortamı başına 1 ml birincil atık su ekleyin. Atık su numunesi, mekanik filtrasyondan sonra bir belediye atık su arıtma tesisinden alınır (bkz. örneğin Şekil 2) ve 4 °C'de kapalı bir kapta kullanıma kadar üç aya kadar saklanabilir.
    (Not: Deneyin amacına bağlı olarak, tam ilk hücre sayısı önemli olabilir ve daha sonra belirlenmelidir. Gösterilen örnekte, biyofilm kararlı durum koşullarına ulaştığı için başlangıçtaki hücre sayısı önemli değildir.)
  3. Aşı da dahil olmak üzere ortamı, ortamın havasını almak için en az 30 dakika nitrojen ile yıkayın, ortama bir iğne sokarak ve nitrojen akışını açın. Akış, ortamın tam bir karışımını gözlemleyebileceğiniz kadar güçlü olmalıdır.
    (Not: Ortamın hacmine bağlı olarak, hava alma süresinin uzatılması bile düşünülmelidir. Hava alma kurulumu sırasında, beslemeli kesikli reaktör (adım 2.1-2.2))

2. Beslemeli Kesikli Reaktörün Kurulumu

  1. Uygun bir reaktör kabı alın - burada modifiye edilmiş 4 boyunlu 250 ml'lik yuvarlak tabanlı bir şişe kullanılır.
    (Not: Genel olarak, geminin en az dört girişi olmalıdır. Bunlar üç elektrot ve numune alma/medya değişimi için gereklidir. Numune alma veya ortam değişikliği nedeniyle reaktör düzenli olarak açıldığında üretilen gaz hacimleri ihmal edilebilir, alternatif olarak bir kabarcık sayacı takılmalıdır. İstenmeyen fototropik büyümeyi önlemek için, reaktörler doğrudan ışığa maruz kalmaktan korunmalıdır.)
  2. Üç elektrotlu kurulum için (ayrıntılar için bkz. Şekil 3 ve bölüm 3) referans elektrodu (RE) (burada Ag/AgCl, doy. KCl, 0.197 V'ye karşı SHE), çalışma elektrodunu (WE) ve karşı elektrodu (CE) silikon tapalar aracılığıyla ayrı girişlerden şişeye yerleştirin – hava geçirmez şekilde kapatın.
    (Not: WE ve CE grafit çubuklar kullanıldığından. Elektrotların teli silikon tapadan çekilir ve harici olarak sabitlenir. Referans elektrodu, delinmiş bir delikten silikon tapadan geçirilir. Kısa devreleri önlemek için, karıştırma veya ortam devridaim sırasında bile elektrotların fiziksel teması olmadığından emin olun. Elektrotları tamamen orta çözelti ile kaplanacak şekilde yerleştirin. Sızdırmazlık için, her girişin silikon tapasını Parafilm ile sarın.)
  3. Nitrojenle yıkarken aşı dahil büyüme ortamını (burada 250 ml) numune alma portundan reaktöre dökün.
  4. Son girişi silikon bir tapa ile kapatın ve hava geçirmez şekilde kapatın. Not: Eser miktarda oksijen, karışık türlerin biyofilmlerine zarar vermez. Düşük oksijen seviyelerine dayanabilir ve hatta tüketebilirler, bu da CE'yi azaltabilir.

3. Kronoamperometrik Biyofilm Büyümesi

  1. Elektrotları potansiyostatın ilgili kablolarına bağlayın. Kabı sıcaklık kontrollü bir odaya yerleştirin, burada 35 °Ckullanılır 31, sabit çevre koşullarını sağlamak için.
  2. Potansiyostatı kontrol etmek için yazılımı açın ve tekniği seçin: Kronoamperometri. Örneğin parametreleri aşağıdaki gibi ayarlayın: 500 saatlik (≈ 20 gün) bir t süresi için 0,2 V'luk (Ag/AgCl'ye karşı) sabit bir potansiyel EWE. Akım, her dakika dti zaman adımlarıyla kaydedilir.
    Not: Uygulanan potansiyelin seçimi, çalışılan sisteme/mikroorganizmaya bağlıdır. Genel olarak, anot süreçleri pozitif potansiyelde ve katot süreçleri negatif potansiyellerde incelenir. Elektron vericisinin/alıcısının standart potansiyellerinden ve beklenen mikrobiyal elektron transfer bölgesinin resmi potansiyelinden de uygun bir potansiyel çıkarılabilir, burada bir başlangıç noktası olarak lütfen son literatüre bakın.
  3. Kronoamperometriyi başlatın. Zaman içinde ölçülen akımın bir grafiği yazılım tarafından çizilir, gözlemlenen maksimum akım (imaks), bölüm 4 ve 5'te tartışıldığı gibi önemli bir çevrimiçi parametredir.

4. Biyofilm Bakımı

  1. Çevresel koşullara, örneğin sıcaklığa bağlı olarak, oksidatif bir akım akmaya başlar ve bir platoya ulaşır (bkz. Şekil 4). Tekrar sıfır akıma ulaştıktan sonra, kronoamperometrik ölçümü duraklatın ve ortam çözeltisini doldurun. Daha hızlı bir biyofilm büyümesi için, maksimum akımın platosuna ulaşıldıktan hemen sonra ortamı değiştirin. Numune alma portunu açın ve ince biyofilmi tahrip etmeden dikkatlice ortamı boşaltın. Ortamı yeniden doldururken tekrar nitrojen ile yıkayın. Örnekleme portunu kapatın ve hava geçirmez şekilde kapatın.
  2. Maksimum oksidatif akım sabit bir duruma ulaşana kadar adım 4.1'deki prosedürü tekrarlayın (bkz. Şekil 4).
    (Not: Sabit bir imax'ın kararlı bir kararlı durum biyofilm oluşumunu gösterdiğine inanılmaktadır.)
  3. Substrat analizi için taze ve değiştirilmiş ortam çözeltilerinden 1 ml numune alın, örneğin HPLC ile. İlk substrat (asetat) konsantrasyonu (c 0) ve kalan substrat çözeltisinin konsantrasyonu (c1) daha sonra verimlilik hesaplamaları için gereklidir (bkz. Veri analizi bölümü).
    Not: Örneğin daha fazla alt tabaka tüketimi nedeniyle değiştirilmemiş sonuçlar elde etmek için alt tabaka örneklerini hemen analiz edin. Bu mümkün değilse, numuneleri bir aydan fazla olmamak üzere en az -18 °C'de bir dondurucuda saklayın.)

5. EET Çalışmak için Döngüsel Voltametrinin Uygulanması

  1. Belirtildiği gibi akım akışının maksimum ve minimumunda döngüsel voltametri gerçekleştirin (Şekil 4). İlgilenilen soruya bağlı olarak, CV genellikle karşılaştırılabilir sonuçlar elde etmek için sistem kararlı duruma ulaştığında gerçekleştirilir. (Not: Akımın üretilmesi devir koşulları olarak adlandırılır ve substratın mikrobiyal oksidasyonu ve müteakip elektron transferi ile ilgilidir: mikrobiyal biyoelektrokataliz; oysa devirsiz CV'ler CA'da (neredeyse) sıfır akım akışında gerçekleştirilir.)
  2. Potansiyostat kontrol yazılımında şu tekniği seçin: Döngüsel voltametri ve uygun parametreleri ayarlayın, örneğin: EWE'nin E i'ye -0,5 V'luk bir başlangıç potansiyeli vs. 1 mV/sn'lik bir tarama hızı v=dE/d t ile 0,3 V'luk bir köşe potansiyeli E1'e karşı RE'ye ve başlangıç potansiyeline geri dönüş E2 = Ei -0,5 V.
    Not: Döngüsel voltametri kullanılırken, WE'de uygulanan voltaj, potansiyostat tarafından zamanla doğrusal olarak değiştirilir (bkz. Şekil 5)- Kutu 2, deney parametrelerinin seçilmesi ve sorun giderme için temel kurallar sağlar).
  3. Döngüsel voltametriyi başlatın ve tekrarlanabilir bir CV gerçekleştirmek için gerektiği kadar döngü kaydedin. Genellikle en az 3 döngüye ihtiyaç vardır. Ortaya çıkan grafiğe döngüsel voltammogram denir (ayrıca bkz. Şekil 7). Not: Ölçüm koşullarına bağlı olarak, bir sonraki bölümde gösterildiği gibi farklı bilgiler elde edilebilir.

6. Veri Çizimi

Burada sadece verilerin çizimi ele alınmaktadır. Bir sonraki bölümde daha ayrıntılı bir inceleme takip edilmektedir.

  1. Uygun veri analiz yazılımını kullanın, burada tüm veriler metin olarak dışa aktarılır ve ASCII dosyası olarak içe aktarılır.
  2. Mutlak akımları (i) değil, tercihli olarak akım yoğunluklarını (j) hesaplayın ve kullanın.
    (Not: Ancak, j'yi hesaplamak için farklı protokoller mevcut olduğundan, hangisinin kullanıldığını açıkça belirtin. Burada geometrik başına akım yoğunluğu, yani Öngörülen, elektrotun yüzey alanı kullanılır.)
  3. Kronoamperometri: Ölçülen akım yoğunluğunu zamanın fonksiyonu olarak çizin.
  4. Döngüsel voltametri: Ölçülen akım yoğunluğunu WE E we'nin potansiyelinin fonksiyonu olarak çizin.

Sonuçlar

1. Kronoamperometri

Kronoamperometrik ölçümlerden iki operasyonel karakteristik hesaplanabilir: maksimum akım yoğunluğu (jmaksimum), yani saniye başına maksimum elektron akışı ve kulombik verimlilik (Kılcal Elektroforez), yanitüketilen substrata oranla toplam akım akışı. Şekil 4 beslemeli kesikli bir reaktör kullanılarak gerçekleştirilen birkaç büyüme döngüsüne ait tipik bir kronoamperometrik biyofilm büyüme eğrisi gösterilmektedir. İlk lag fazından sonra ilk akım yoğunluğu maksimumu başlar. Ardından, substrat tükenmesi nedeniyle akım tekrar azalır. Akım akışının (neredeyse) sıfır olduğu noktada, belirtildiği üzere besiyeri değiştirilir. Bu substrat takviyesinden sonra akım yoğunluğu tekrar artar ve takip eden maksimum akım yoğunluğu birincisinden daha yüksek olur. Birkaç büyüme döngüsünden sonra jmaksimum sabittir; bu da kararlı durum biyofilm oluşumuna işaret eder14Kararlı durumla birlikte jmaksimum değer birkaç parametreye bağlıdır, örneğin elektrot malzemesi, reaktör sıcaklığı ve biyofilm kompozisyonu, sıklıkla belirli bir elektroaktif mikrobiyal biyofilm/elektrot sisteminin bir özelliği olarak kabul edilir. (Akışlı reaktörler durumunda değil) jmaksimum, ancak sabit kararlı durum akım yoğunluğu kullanılır.) İkinci işletme karakteristiği ise kulombik verimliliktir (CE) (Denklem 1). Bu, elektrik akım akışı olarak kaydedilen elektron sayısıdır, Qp teorik maksimum elektron sayısı ile ilişkili olarak, beslemeli kesikli kültür (fed-batch) döngüsü başına Qth, bu döngü sırasındaki substrat tüketiminden hesaplanmaktadır.

Statik denge formülü CE=QP/Qth×100; süreç diyagramındaki verimlilik hesaplaması.

(Denklem 1)

Toplam transfer edilen yük, CA eğrisinin entegrasyonu ile elde edilebilir (bkz. Şekil 6):

Elektriksel yük hesaplaması, denklem, \( Q_P = \int_0^t i \, dt \), entegrasyon yöntemi.

(Denklem 2)

Teorik olarak mümkün olan elektrik yükü, Faraday yasası ile hesaplanır:

Termodinamik denklemi Qth=ΔcVzF, kimyasal potansiyel analizi, eğitim amaçlı kullanım.

(Denklem 3)

Burada V büyüme ortamının hacmini, F Faraday sabitini (F = 96,485.34 C/mol), z oksitlenen substratın salınan elektron sayısını (asetat durumunda CO2'ye oksidasyon sırasında 8 elektron salınır) ve Δc = c0-c1 substrat tüketimini (kimyasal analiz yöntemleri, örneğin HPLC ile belirlenir) temsil eder.

2. Siklik voltametri:

Dönüşümsüz koşullar ve dönüşümlü koşullar ( Şekil 4'te belirtildiği gibi) için döngüsel voltammogramlar kaydedilir. Her iki durumda da farklı türde bilgiler elde edilebilir. Aşağıda, olası ve gerçek EET bölgelerinin nasıl tanımlanabileceği tartışılmaktadır.

2.1 Devir dışı koşullar – olası EET bölgelerinin belirlenmesi:

Şekil 7, turnover olmayan koşullar için, yani substrat yokluğunda tipik CV'leri göstermektedir. Şekil 7A, yalnızca bir pik çiftinin ve dolayısıyla tek bir formal potansiyelin Ef belirlenebildiği yüksek tarama hızları (burada 50 mV/sec) için bir biyofilmin CV'sini göstermektedir. Genel olarak, bir redoks çiftinin formal potansiyeli, oksidasyon piki potansiyeli EpA ve ilgili türün redüksiyon piki potansiyeli EpC üzerinden aritmetik ortalama alınarak hesaplanabilir (ayrıca bkz. Şekil 7C):

Elektrokimya denklemi: Ej = (EpA + Epc)/2, voltametri çalışmalarında redoks potansiyelini analiz eder.

(Denklem 4)

Aynı biyofilme yeterince düşük bir tarama hızı (burada 1 mV/sn) uygulandığında, dört adede kadar redoks çifti tanımlanabilir (ilgili formal potansiyeller şurada belirtilmiştir: Şekil 7B). Bunun nedeni, daha düşük tarama hızları kullanıldığında kapasitif arka plan akımının azalmasıdır, ayrıca bakınız Kutu 1 ve örn.17,21 detaylar için. Ancak, turnover dışı CV yalnızca elektrottaki tüm redoks-aktif bileşikleri gösterir ve bu nedenle Ef -in / -un mümkün EET bölgeleri. Sadece turnover CV'sinin analizi, ... sağlar Ef -nın/-nin güncel EET transfer bölgeleri (bkz. adım 2.2.).

Dönüşümsüz CV'ler daha detaylı analiz edildiğinde, pik ayrımı ΔEp (Denklem 5) veya maksimum pik akımı ipA ve minimum pik akımı ipC gibi farklı diğer karakteristik parametreler analiz edilebilir (bkz. Şekil 7C).

Statik denge denklemi ΔEP=EpA-EpC; eğitim amaçlı formül diyagramı.

(Denklem 5)

Bu parametreler, özellikle farklı tarama hızları için kaydedildiklerinde, elektrotlardaki elektron transfer süreçlerinin mekanistik ve kinetik analizi için kullanılabilir. Ancak, kimyasal sistemler için iyice belirlenmiş olan bu kinetik analiz, elektroaktif mikrobiyal biyofilmler için basit değildir, bkz. örneğin19,30

  1. Devir daim koşulları – gerçek EET bölgelerinin belirlenmesi:

Substrat varlığında CV ölçümü gerçekleştirildiğinde bir turnover CV elde edilir (bkz. Şekil 8A). Veriler grafiğe döküldükten sonra tipik s şeklinde, sözde biyoelektrokatalitik eğri17-19 görülebilir. Veriler daha ayrıntılı analiz edildiğinde, birinci türevin maksimumu, yani CV eğrisinin büküm noktası, gerçek EET bölgelerinin formal potansiyelini Ef verir (bkz. Şekil 8B). Genç, yani ince, Geobacteraceae baskın bir biyofilm durumunda (burada CA başlangıcından 168 sa sonra), iki büküm noktası gözlemlenebilir. Ardından türev, biyoelektrokatalitik olarak aktif EET bölgelerinin formal potansiyeline karşılık gelen iki maksimum gösterir: Ag/AgCl'ye (sat. KCl, SHE'ye karşı 0.197 V) karşı -0.376 V ve -0.295 V. Şekil 7B'de bu bölgeler sırasıyla Ef,2 ve Ef,3 olarak adlandırılmıştır. Bu bulgu ayrıca Ef,1 ve Ef,4 formal potansiyelleri ile ilişkili redoks süreçlerinin (nonturnover CV'de) biyoelektrokataliz ile ilgili olmadığını göstermektedir. Biyofilm büyüyüp kalınlaştıkça, CV yalnızca bir büküm noktası, yani türev eğrisinde tek bir maksimum gösterir. Burada Ag/AgCl'ye (sat KCl) karşı -0.32 V olan bu formal potansiyel Ef, ince biyofilmin EET'sine atanan iki formal potansiyelin (örneğin burada Ef,2 ve Ef,3) aritmetik ortalamasına (yaklaşık olarak) eşittir – bkz. Şekil 9. Bu durum, bu temel CV analizinin EET termodinamiği hakkında hızlı ve noninvaziv bir şekilde içgörü sağladığını, ancak dikkat çekici bir şekilde daha ileri mekanistik veya kinetik sonuçlar çıkarılmasına izin vermediğini göstermektedir.

Özellikle, bu protokoldeki spesifik koşullarla elde edilen biyofilmlerin büyük ölçüde Geobacter türleri tarafından domine edildiği görülmektedir (burada gösterilmemiştir)12,15. Seçilen parametrelerin örneğin substrat, sıcaklık vb. değiştirilmesi, mikrobiyal kompozisyonu ve dolayısıyla elektrokimyasal özellikleri de etkileyecektir.

Tablo 1. Kim et al.32’e göre büyüme besiyeri

Bileşen(mg/L) / (ml/L)   
NaH2PO4•H2O2,690.00
Na2HPO44,330.00
NH4Cl310.00
KCl130.00
sodyum asetat820.00
metal çözeltisi12.50
vitamin çözeltisi12.50
Tablo 2. Metal ve vitamin çözeltisinin bileşenleri33.
Eser element çözeltisi:Vitamin çözeltisi:
Bileşenmg/L   Bileşenmg/L   
Nitriloasetik asit1,500.0Biotin2.0
MgSO4•7H2O         3,000.0Folik asit2.0
MnSO4•2H2O         500.0Piridoksin hidroklorür10.0
NaCl  1,000.0Tiamin hidroklorür5.0
FeSO4•7H2O          100.0Riboflavin5.0
CoSO4 veya CoCl2     100.0Nikotinik asit5.0
CaCl2•2H2O            100.0DL-Kalsiyum pantotenat5.0
ZnSO4   130.0Vitamin B120.1
CuSO4•H2O10.0p-Aminobenzoik asit5.0
AlK(SO4)2               10.0Lipoik asit5.0
H3BO3 10.0
Na2MoO4•2H2O     10.0
Not: Nitriloasetik asidi KOH ile pH 6.5 olacak şekilde çözün ve ardından mineralleri eklemeye geçin.


Biyoelektrokimyasal terminoloji diyagramı; elektrokimyadaki denklem ve formülleri içerir.
Optimal CV deneyleri için potansiyel penceresi ve tarama hızı ayarlarına odaklanan, döngüsel voltametri parametre ayarları ve sorun giderme kılavuzu.

Mikrobiyal elektron transfer diyagramı; MET, DET, MIET, DIET yolları; elektron taşıma analizi.
Şekil 1. Olası mikrobiyal hücre dışı elektron transfer mekanizmalarının şeması. Daha büyük resmi görüntülemek için buraya tıklayın.

Su örnekleme süreci; atık su arıtma akışından örnekler toplayan kova örnekleyici.
Şekil 2. Atık su arıtma tesisinde, ızgara tutucudan sonra yapılan örnekleme (atık su arıtma tesisi Almanya). Daha büyük resmi görüntülemek için buraya tıklayın.

Potansiyostat, elektrot kurulumu ile elektrokimyasal hücre şeması ve fotoğrafı; CE, RE, WE etiketlenmiştir.
Şekil 3. Üç elektrotlu kurulum. (A) Şema, (B) gerçek reaktör; CE = karşı elektrot, RE = referans elektrot, WE = elektroaktif mikrobiyal biyofilmli çalışma elektrodu, SP = örnekleme portu. Daha büyük görüntüyü görmek için buraya tıklayın.

Elektrokimyasal grafik; CV analizi; akım ile zaman ilişkisi; kararlı durum yaklaşımı; veriler mikroamper ve saat cinsindendir.
Şekil 4. Beslemeli-kesikli atık su inokulumu tabanlı biyofilm büyümesinin kronoamperometrik grafiği. Oksidatif akım, üç ortam değişim döngüsünden sonra kararlı duruma ulaşır. Lag fazı ile ortam değişim zaman noktaları ve kararlı durum biyofilm koşulları için turnover siklik voltametri (CV) ve nonturnover CV uygulamaları belirtilmiştir (ham veriler Liu'dan14). Resmin daha büyük halini görüntülemek için buraya tıklayın.

Elektrokimyasal analiz, E-t diyagramı, döngüsel voltametri, potansiyel zamana karşı, analitik kimya.
Şekil 5. Döngüsel voltametrinin bir döngüsü sırasındaki temel potansiyel-zaman seyri. CV, başlangıç potansiyeli Ei ile başlar. Uygulanan voltaj daha sonra v tarama hızıyla zamanla doğrusal olarak değiştirilir. Seçilen bir tepe potansiyeli E1 değerinde, voltaj bir bitiş potansiyeli E2 değerine döner; burada E2 = Ei. Daha büyük görüntüyü görmek için buraya tıklayın.

Akım yoğunluğu j'ye karşı zaman t'nin elektrokimyasal analiz grafiği, pik jmax değerini göstermektedir.
Şekil 6. Atık su kaynaklı bir biyofilmin bir büyüme döngüsüne ait tipik kronoamperogramı; burada maksimum akım yoğunluğu jmax, akan (pratik) elektrik yükü Qp, başlangıç substrat konsantrasyonu c0 örneklemesi ve bir büyüme döngüsü sonrası substrat konsantrasyonu c1 belirtilmiştir. Daha büyük resmi görüntülemek için buraya tıklayın.

Elektrokimyasal analiz grafiği; akım ile voltaj sonuçlarını gösteren döngüsel voltametri diyagramları.
Şekil 7. Bir G. sulfurreducens biyofilminden elde edilen turnover dışı döngüsel voltamogramlar. Tarama hızı: (A) 50 mV/sec, (B) 1 mV/sec 23; (C) B bölümünün kesiti, maksimumlarda anonun pik akım yoğunluğunu (jpA) ve ilgili pik potansiyelini (EpA) göstermektedir. Benzer şekilde minimumlarda katodun pik akım yoğunluğu (jpC) ve ilgili pik potansiyeli (EpC) gösterilmiştir. Formal potansiyel Ef ve pik ayrımı ΔEp sırasıyla Denklem 4 ve Denklem 5 sonucunda elde edilmiştir (ayrıntılar için aşağıdaki metne bakınız). Görüntüyü büyütmek için buraya tıklayın.

Elektrokimyasal analiz; voltametri grafiği; akım vs potansiyel; pik tespiti; veri analizi.
Şekil 8. (A) Metabolize olan bir G. sulfurreducens biyofilminin turnover döngüsel voltammogramı. Tarama hızı 5 mV/sec idi. (B) Voltammetrik eğrinin birinci türevleri23. Gerçek EET bölgelerinin formal potansiyelleri belirtilmiştir: Ef,2 ve Ef,3. Daha büyük görüntüye bakmak için buraya tıklayın.

Döngüsel voltametri grafiği; akımya karşı potansiyel; elektrokimyasal analiz; veri sonuçları.
Şekil 9. Daha kalın, metabolize eden bir G. sulfurreducens biyofilminin (A) turnover döngüsel voltammogramı ve (B) birinci türevleri. Tarama hızı 5 mV/sec idi (Şekil 8 ile karşılaştırınız). Daha büyük görüntüyü görmek için buraya tıklayın.

Tartışma

Sunulan protokol, beslemeli bir kesikli reaktörde üç elektrotlu bir kurulum kullanarak atık su aşılarından elektroaktif mikrobiyal biyofilmlerin büyütülmesi için kolay ve anlaşılır bir yol göstermektedir. Kronoamperometri, çeşitli aşılardan elektroaktif mikrobiyal biyofilmlerin büyümesini ve seçilmesini ve ayrıca biyofilmlerin maksimum akım yoğunluğu ve coulombik verimlilik açısından temel karakterizasyonunu sağlar. Noninvaziv bir teknik olan döngüsel voltametri, mikrobiyal biyofilmin EET termodinamiği üzerinde temel çalışmaların yapılmasına ve böylece olası ve gerçek EET transfer bölgelerinin belirlenmesine izin verir. Birlikte, bu parametreler i) aynı koşullar için farklı mikrobiyal biyofilmlerin karakterize edilmesine ve karşılaştırılmasına ve ayrıca ii) farklı çalışma koşullarının özdeş elektroaktif mikrobiyal biyofilmler üzerindeki etkisinin incelenmesine izin verir. Ancak bu deneyler yalnızca bir başlangıç noktası olabilir. Bir yandan, mikrobiyal biyoelektrokimyanın çok yönlü alanı, elektrokimyasal yöntemlerin ve protokollerin daha fazla ve derinlemesine kullanılmasını gerektirir. Bu, örneğin, kinetik ve mekanik verilerin çıkarılması için modellerin yanı sıra elektrokimyasal empedans spektroskopisi34,35 gibi diğer yöntemleri içerir. Öte yandan elektrokimyasal yöntemler, moleküler yapı, mikrobiyal bileşim, uzaysal mikrobiyal organizasyon vb. hakkında hiçbir bilgi sağlayamaz. Burada noninvaziv ve elektrokimyaya bağlı veya invaziv olan başka tekniklere ihtiyaç vardır4. Kutu 2 , deneyleri gerçekleştirirken kritik adımlar ve ilk sorun giderme hakkında kısa bir tartışma sağlar.

Mühendislik perspektifinden bakıldığında, elektroaktif biyofilm anodunun mevcut mikrobiyal biyoelektrokimyasal sistemlerin yalnızca bir bileşeni olduğu ve tam sistemler için çok sayıda başka faktörün analiz edilmesi gerektiği dikkate alınmalıdır36. Yine de, bu video makalesinin gelecekte BES'in temel unsurlarını, yani mikrobiyal elektrotları anlamaya ve uyarlamaya yardımcı olacağını umuyoruz.

Açıklamalar

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

F.H., BMBF ("Yeni nesil biyoteknolojik süreçler - Biyoteknoloji 2020+" Araştırma Ödülü) ve Helmholtz Derneği (Genç Araştırmacılar Grubu) tarafından desteklendiğini kabul eder.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Birincil atık suAtık su arıtma tesisiMekanik filtrasyondan sonra alınır
250 ml Üç ek girişli yuvarlak tabanlı şişelerTh.Geyer Berlin GmbH, Almanya9.011 845İlave girişler, seramik diyaframlı şirket içi cam üfleyicimiz
Ag/AgCl referans elektrodu (sat. KCl, 0,195 V'ye karşı SHE)Sensortechnik Meinsberg, AlmanyaSE 11
Grafit çubuklar (Ø=1 cm, l=3 ve 5 cm)CP-Handels-GmbH, Wachtberg, AlmanyaElektrot malzemesi olarak kullanılır
Paslanmaz çelik, No. 1.4301, Tel Fe/Cr18/Ni10Goodfellow GmbH, Bad Nauheim, Almanya155-923-05
Silikon tapalarTh.Geyer Berlin GmbH, Almanya9.230 512 ve
ParafilmneoLab, Heidelberg, Almanya3-1011Anaerobik koşulları korumak için sızdırmazlık için
Potansiyostat/ Galvanostat Modeli MPG2BioLogic Science Instruments, Fransa
EC-LabBioLogic Science Instruments, Fransaelektrokimya ölçümleri yapmak için yazılım
Origin 8.6OriginLabveri analiz yazılımı
ile takılmıştır

Kaynaklar

  1. Rabaey, K., Angenent, L., Schröder, U., Keller, J. Integrated Environmental Technology Series. Lens, P. , IWA Publishing. London, New York. (2010).
  2. Logan, B. E., Rabaey, K. Conversion of wastes into bioelectricity and chemicals using microbial electrochemical technologies. Science. 337, 686-690 (2012).
  3. Rabaey, K., Rozendal, R. A. Microbial electrosynthesis - revisiting the electrical route for microbial production. Nat. Rev. Microbiol. 8, 706-716 (2010).
  4. Harnisch, F., Rabaey, K. The Diversity of Techniques to Study Electrochemically Active Biofilms Highlights the Need for Standardization. ChemSusChem. 5, 1027-1038 (2012).
  5. Logan, B. E., et al. Microbial Fuel Cells: Methodology and Technology. Environ. Sci. Technol. 40, 5181-5192 (2006).
  6. Harnisch, F., Schröder, U. From MFC to MXC: chemical and biological cathodes and their potential for microbial bioelectrochemical systems. Chem. Soc. Rev. 39, 4433-4448 (2010).
  7. TerAvest, M. A., Li, Z., Angenent, L. T. Bacteria-based biocomputing with Cellular Computing Circuits to sense, decide, signal, and act. Energy Environ Sci. 4, 4907-4916 (2011).
  8. Lovley, D. R. Bug juice: harvesting electricity with microorganisms. Nat. Rev. Microbiol. 4, 12 (2006).
  9. Lovley, D. R. Reach out and touch someone: potential impact of DIET (direct interspecies energy transfer) on anaerobic biogeochemistry, bioremediation, and bioenergy. Rev. Environ. Sci. Biotechnol. 10, 101-105 (2011).
  10. Rosenbaum, M., Aulenta, F., Villano, M., Angenent, L. T. Cathodes as electron donors for microbial metabolism: Which extracellular electron transfer mechanisms are involved. Bioresource Technol. 102, 324-333 (2011).
  11. Schröder, U. Anodic electron transfer mechanisms in microbial fuel cells and their energy efficiency. Phys. Chem. Chem. Phys. 9, 2619-2629 (2007).
  12. Harnisch, F., et al. Revealing the electrochemically driven selection in natural community derived microbial biofilms using flow-cytometry. Energy Environ. Sci. 4, 1265 (2011).
  13. Kim, J. R., Min, B., Logan, B. E. Evaluation of procedures to acclimate a microbial fuel cell for electricity production. Appl. Microbiol. Biotechnol. 68, 23-30 (2005).
  14. Liu, Y., Harnisch, F., Fricke, K., Sietmann, R., Schröder, U. Improvement of the anodic bioelectrocatalytic activity of mixed culture biofilms by a simple consecutive electrochemical selection procedure. Biosens. Bioelectron. 24, 1006-1011 (2008).
  15. Torres, C. sI., et al. Selecting Anode-Respiring Bacteria Based on Anode Potential Phylogenetic, Electrochemical, and Microscopic Characterization. Environ. Sci. Technol. 43, 9519-9524 (2009).
  16. Virdis, B., Harnisch, F., Batstone, D. J., Rabaey, K., Donose, B. C. Non-invasive characterization of electrochemically active microbial biofilms using confocal Raman microscopy. Energy Environ. Sci. 5, 7017-7024 (2012).
  17. Scholz, F., Bond, A. M. Electroanalytical Methods: Guide to experiments and applications. 2, edn,(2010).
  18. Marsili, E., Rollefson, J. B., Baron, D. B., Hozalski, R. M., Bond, D. R. Microbial biofilm voltammetry: direct electrochemical characterization of catalytic electrode-attached biofilms. Appl. Environ. Microbiol. 74, 7329-7337 (2008).
  19. Harnisch, F., Freguia, S. A Basic Tutorial on Cyclic Voltammetry for the Investigation of Electroactive Microbial Biofilms. Chemistry. 7, 466-475 (2012).
  20. Marsili, E., et al. Shewanella secretes flavins that mediate extracellular electron transfer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3968-3973 (2008).
  21. Bard, A. J., Inzelt, G., Scholz, F. Electrochemical Dictionary. , Springer. (2008).
  22. Kim, B. H., et al. Electrochemical activity of an Fe(III)-reducing bacterium, Shewanella putrefaciens IR-1, in the presence of alternative electron acceptors. Biotechnol. Tech. 13, 475-478 (1999).
  23. Fricke, K., Harnisch, F., Schröder, U. On the use of cyclic voltammetry for the study of anodic electron transfer in microbial fuel cells. Energy Environ. Sci. 1, 144 (2008).
  24. Marsili, E., Sun, J., Bond, D. R. Voltammetry and Growth Physiology of Geobacter sulfurreducens Biofilms as a Function of Growth Stage and Imposed Electrode Potential. Electroanalysis. 22, 865-874 (2010).
  25. Busalmen, J. P., Esteve-Núñez, A., Berná, A., Feliu, J. M. C-Type Cytochromes Wire Electricity-Producing Bacteria to Electrodes. Angew. Chem. 120, 4952-4955 (2008).
  26. Millo, D., et al. In Situ Spectroelectrochemical Investigation of Electrocatalytic Microbial Biofilms by Surface-Enhanced Resonance Raman Spectroscopy. Angew. Chem. Int. Edn. Engl. 50, 2625-2627 (2011).
  27. Hamelers, H. V., et al. New applications and performance of bioelectrochemical systems. Applied Microbiol. Biotechnol. 85, 1673-1685 (2010).
  28. Richter, H., et al. Cyclic voltammetry of biofilms of wild type and mutant Geobacter sulfurreducens on fuel cell anodes indicates possible roles of OmcB, OmcZ, type IV pili, and protons in extracellular electron transfer. Energy Environ. Sci.. 2, 506 (2009).
  29. Torres, C. I., Kato Marcus, A., Rittmann, B. E. Proton transport inside the biofilm limits electrical current generation by anode-respiring bacteria. Biotechnol. Bioeng. 100, 872-881 (2008).
  30. Torres, C. I., et al. A kinetic perspective on extracellular electron transfer by anode-respiring bacteria. FEMS Microbiol. Rev. 34, 3-17 (2010).
  31. Patil, S. A., Harnisch, F., Kapadnis, B., Schröder, U. Electroactive mixed culture biofilms in microbial bioelectrochemical systems: The role of temperature for biofilm formation and performance. Biosens. Bioelectron. 26, 803-808 (2010).
  32. Kim, J. R., Min, B., Logan, B. E. Evaluation of procedures to acclimate a microbial fuel cell for electricity production. Appl. Microbiol. Biotechnol. 68, 23-30 (2005).
  33. Balch, W. E., Fox, G. E., Magrum, L. J., Woese, C. R., Wolfe, R. S. Methanogens: Reevaluation of a unique biological group. Microbiol. Rev. 43, 260-296 (1979).
  34. He, Z., Mansfeld, F. Exploring the use of electrochemical impedance spectroscopy (EIS) in microbial fuel cell studies. Energy Environ. Sci. 2, 215-219 (2009).
  35. Ter Heijne, A., et al. Identifying charge and mass transfer resistances of an oxygen reducing biocathode. Energy Environ. Sci. 4, 5035-5043 (2011).
  36. Logan, B. Scaling up microbial fuel cells and other bioelectrochemical systems. Appl. Microbiol. Biotechnol. 85, 1665-1671 (2010).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

At k Su nokulumuD ng sel VoltametriKronoamperometriH cre D Elektron TransferiBeslemeli Kademeli Reakt rElektrotlu D zenekMaksimum Ak m Yo unlu uKulon Verimlili iFormal Potansiyel

İlgili makaleler