Embriyo kültürlerinde kullanılan serum, özellikle sinyalizasyon etkileşimler içeren çalışmalarda deney sonucunu etkileyebilecek bilinmeyen bileşenleri içerir. Burada bir serum içermeyen kültür sistemi kullanılan oksijenli ve 16-40 saat süre ile kültüre orta gebelik fare embriyo utero gelişen embriyo benzer morfolojik gelişimini gösteren göstermektedir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Serumsuz Tüm Embriyo Kültür Sistemde Fare Embriyonik Development
Bu makalede
Özet
Özet
Orta gebelik aşama fare embriyoları oksijenli haddeleme şişe kültür sistemi içinde ticari olarak temin edilebilen, kök hücre ortamı takviyesi hazırlanan bir serum içermeyen kültür ortamı kullanılarak kültürlenmiştir. E10.5 fare embriyoları dikkatlice sağlam yumurta sarısının ile rahim izole edildi ve yolk kesesi ile embriyonun damar sürekliliğini korurken hassas cerrahi manevra kapsayan bir süreçte embriyoların yavaşça sarısı kesesi eksterioze edildi. Bozulmamış yolk kesesi veya uzaklaştırılarak yumurta sarısı ile hazırlanan embriyolar ile karşılaştırıldığında, bu embriyolar, üstün hayatta kalma oranı ve benzer koşullar altında kültüre gelişim ilerlemesi sergiledi. Biz, bu fare embriyoları, ne 16-40 saat boyunca 37 ° C'de% 95 O yuvarlanan şişe kültür cihazı içinde 2/5% CO2 atmosferinde tanımlanmış bir ortam içinde kültürlendi, karşılaştırılabilir morfolojik büyüme ve gelişme sergilerler olduğunu göstermektedir Embriyoların rahimde gelişmekte. Biz inci inanıyorumyöntem embriyonik organogeneziste önemli sinyal etkileşimleri incelemek için, tüm embriyo kültürünü kullanmak için ihtiyaç duyan araştırmacılar için yararlı olacaktır.
Giriş
In vitro bütün embriyolarını kullanarak kültür yöntemleri utero erişimi aksi takdirde zor olan embriyonik organogeneziste alan mekanizmaların sinyalizasyon incelemek için uygundur. Tüm embriyolar doku bütünlüğünü sağlamak ve gerekli mekanizmaları sinyalizasyon zamanında oluşumu için önemli olan doku etkileşimleri için uygun destek organojenez esnasında farklı hücresel süreçler için. Bütün embriyo kültürleri vb nakli çalışmaları, genetik ve doku manipülasyonları, boncuk implantasyon çalışmaları, toksikolojik çalışmalar, gibi uygulamalar bir bolluk için bir platform sağlarken., Şu anda kullanılan embriyo kültür sistemleri embriyoları....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Fare embriyo kültürü:
Tüm deneysel prosedürleri gözden ve devam düzenleyici gözetim korur Gürcistan Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi Üniversitesi tarafından onaylanan protokol # A2010 07-119, aşağıdaki sağlık kuralları National Institutes ile sıkı göre yapılmıştır.
1.. Kültür Medya hazırlanması
- KnockOut DMEM, nakavt Serum Replacement (KSR) (% 10), N-2 Supplement (1x), Albümin, İnek Serum (2%), Penisilin (: aşağıdaki miktarlarda ticari olarak temin edilebilen, kök hücre ortamı ve takviyeleri ile kültür ortamı hazırlayın 50 IU / ml), streptomisin (50 ug / ml) ve Amfoterisin-B (1.25 ug / ml). ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Fare embriyolarının gelişimi ex utero rahim embriyolar kültürlenir süre için vücut izole edilir zaman başlangıç çok sayıda faktöre bağlıdır. Şekil 1 'de gösterildiği gibi, işlem vücuttan uterus ayrılmasından (Şekil 1A), bozulmamış yolk kesesi (Şekil 1 B) ile embriyoların izolasyonu da dahil olmak üzere bir dizi adım içerir, yumurta sarısı kesesinden embriyoların eksteriorizasyon ( Şekil 1C) ve 37 ° C'de% 95 O yuvarlanan şişe kültür cihazı içi.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Orta gebelik aşama fare embriyoları, 37 ° C'de% 95 O 2/5 bir haddeleme şişe kültür cihazı içinde% CO2 atmosferinde bir serum içermeyen kültür ortamı içinde kültürlendi Embriyo gelişme ex utero rahim kültürün tamamlanmasından (Şekil 1) için ötenazi farelerden izole edilir zaman, işlem sırasında her adımında birden fazla faktöre bağımlı idi. Gelişimini etkileyen en önemli faktör kültürü başlatmak için alınan zaman oldu. En çok dikkat gerektiren işlem sırasında diğer krit.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Biz herhangi bir rakip mali çıkarlarını yok.
Teşekkürler
Biz kültür tekniği ile onların yararlı tavsiye için Dr Julie Gordon ve Dr Nancy Manley teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Çocuk Glokom Vakfı ve Sharon-Stewart Aniridi Araştırma Vakfı tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| KnockOut DMEM | Invitrogen | 10829-018 | |
| KnockOut Serum Değiştirme | Invitrogen | 10828-028 | |
| N-2 Takviyesi | Invitrogen | 17502-048 | Stok: 100x |
| Albümin, Bovine Serum | Sigma | A9418-50G'den | Stok: %100 |
| Antibiyotik - Antimikotik Solüsyon | Cellgro | 30-004-Cl | Stok: Penisilin (10.000 IU / ml); Streptomisin (10.000 & mikro; g/ml; Amfoterisin (250 & mikro; g/ml) |
| DMEM | Cellgro | 15-013-CV | |
| Hassas İnkübatör Ünitesi | B.T.C. Mühendislik Milton Cambridge, İngiltere | Id.No. 840-374 | |
| Döner Ünite için Cam Şişeler | B.T.C. Mühendislik | ||
| Silikon Kauçuk Mantar | B.T.C. Mühendislik | ||
| %95 O2/%5 CO2 Silindir | AirGas Inc. | ||
| Stemi SV11 Apo Diseksiyon Mikroskobu | Zeiss | ||
| Stemi SV6 Mikroskop | Zeiss | ||
| CO2 Su Ceketli İnkübatör | Forma Scientific | Model: 3110 | |
| Kültür Davlumbaz | Nuaire Biyolojik Güvenlik Kabinleri Sınıf II TypeA2 | Model: Nu-425-600 | |
| Su Banyosu | Fisher Scientific | IsoTemp205 | |
| Tartı Terazisi | Mettler Toledo | AG285 | |
| Santrifüj Tüpü, 50 ml | Corning | 430291 | |
| Hafif Ameliyat Makası | Roboz | RS-6702 | |
| Çalıştırma Keskin-Kör Makas | Roboz | RS-6812 | |
| Mikrodiseksiyon Forsepsleri, 4 in | Roboz | RS-5211 | |
| Mikrodiseksiyon Forseps - Hudson (cWALD), 4-3/4 in | Roboz | RS-5237 | |
| Mikrodiseksiyon Cımbızı (5/45) | Roboz | RS-5005 | Modifiye - Keskin uçlar künt hale getirildi |
| Mikrodiseksiyon Cımbız (5) | Roboz | RS-5060 | Modifiye - Keskin uçlar künt hale getirildi |
| Mikrodiseksiyon Cımbızı (55) | Roboz | RS-5063 | Modifiye - Keskin uçlar kör hale getirildi |
| Alet Tepsisi | Roboz | RT-1401S | |
| Alet Tepsisi Kapağı | Roboz | RT-1401L | |
| Petri Kabı-100 mm | Fisher Scientific | 087571Z | |
| Petri Kabı-60 mm | Fisher Scientific | 0875713A | |
| Petri Kabı-35 mm | Fisher Scientific | 0875711YZ | |
| Filtre Sistemi ( 0.22 & mikro; m Selüloz Asetat)-150 ml | Corning | 431153 | |
| Filtre Sistemi (0.22 &mikro; m Selüloz Asetat)-250 ml | Corning | 430756 | |
| Filtre Sistemi (0.22 & mikro; m Selüloz Asetat)-500 ml | Corning | 430758 | |
| Pipet Destekli Pipetleyici | Drummond Scientific Co. | D57849 | |
| Serolojik Pipet-10 ml | VWR | 89130-898 | |
| Tek Kullanımlık Serolojik Pipet-25 ml | Corning | 4251 | |
| Transfer Pipeti - 7.7 ml | Thermo Scientific | 202-20S |
Kaynaklar
- Behesti, H., Holt, J. K., Sowden, J. C. The level of BMP4 signaling is critical for the regulation of distinct T-box gene expression domains and growth along the dorso-ventral axis of the optic cup. BMC Dev. Biol. 6, 62 (2006).
- Gray, J., Ross, M. E.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
