Sitopatik etki (CPE)-bazlı analiz, doz-yanıt tahlil ve Time-of-adisyonu (TOA) deneyi de dahil olmak üzere üç deneyleri yanı sıra, gelişmiş optimize edilmiş, doğrulanmış ve Bluetongue virüsüne karşı yeni antiviraller (BTV) tanımlamak için kullanılmıştır yeni tespit antiviraller için olası Mekanizması-of-Eylem (MoA) belirlemek gibi.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Bluetongue Virüs karşı Roman Antiviraller belirlenmesi için Tahliller
Bu makalede
Özet
Özet
BTV karşı potansiyel antiviral belirlemek için, biz geliştirdik optimize edilmiş ve burada sunulan üç deneyleri geçerliliği var. CPE-tabanlı tahlil, bir bileşiğin bir anti-viral etkinlik gösteren ve büyük bir bileşik librarisinin elenmesi için kullanılmıştır olup olmadığını değerlendirmek için geliştirilen ilk deney oldu. Bu arada, antiviral sitotoksisitesi da CPE temelli test kullanılarak değerlendirilebilir. Doz-yanıt deney seçilen antiviral etkinlik için aralığını belirlemek için dizayn edilmiştir,% 50 inhibitör konsantrasyonunu (IC50) ya da etkili bir konsantrasyonu (EC50), hem de sitotoksisite yelpazesini (CC 50), yani. ÖY tahlil BTV viral yaşam döngüsü veya ana hücresel makine üzerindeki olası etkisi sırasında yeni antiviral yatan mekanizmasını belirlemek için ilk MoA çalışma için kullanılmıştır. Bu deneyler, bir hücre kültürü sisteminde antiviral etkinliğinin değerlendirilmesi için çok önemli olan ve bizim yeni araştırmalara yol kullanılmaktadırBTV karşı yeni antiviral bir dizi tanımlanmasına ing.
Giriş
BTV Orbivirüs soyu, Reoviridae ailesi içinde bir prototip çift sarmallı bir RNA virüsüdür. BTV çapında 1,2 3000000000 $ / yıl kaybı, koyun, keçi, sığır ve diğer evcil hayvanlar da dahil olmak üzere evcil hayvanların en önemli hastalıklar, biridir. Egzotik BTV serotipi listelenen önemli bir hayvan patojen olan "USDA Ciddiyeti Yüksek Hayvancılık Patojenlerinin." Son zamanlarda, yeniden ortaya çıkan BTV Kuzey Avrupa'da 3,4 genelinde birçok ülkede önemli bir sığırlarda hastalık salgını ve koyunları neden oldu. , Ekonomik önem taşıyan bir sonucu olarak ve bir model sistem olarak, BTV geniş, moleküler genetik ve yapısal çalışmala....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1.. Hücreler, virüs ve antiviral bileşikleri
- BSR hücreleri,% 5 fetal buzağı serumu (FCS) ihtiva eden bebek hamster böbrek bir türevi, Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle ortamında (BHK) hücreleri, 10, (DMEM) korumak, 100U/ml penisilin ve 100 ug / ml streptomisin.
- Üç analizi için,% 1 FCS, 100U/ml penisilin ve 100 ug / ml streptomisin ile DMEM içerisinde plaka hücreleri, 5, daha önce optimize edilmiş olarak. Bu ortam, her üç deneyleri için deney ortamı olarak adlandırılır.
- % 5 CO2 ve% 80-95 nem ve 37 ° C'de inkübatör içinde tüm hücreleri inkübe edin.
- Plak-saflaştırılması ve daha önce tari....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
1.. Bileşik Antiviral etkinliği
Hücre bazlı CPE deneyi, geliştirilen en iyi ve daha önce tarif edildiği gibi 2,5 BTV karşı yeni antiviral belirlemek için ışık saçan tabanlı CTG kiti kullanılarak in vitro olarak doğrulanmıştır. On doz yanıt deney canlı hücreler 5,11 sunulan hücresel ATP miktarının göre kültür içinde metabolik olarak yaşayan hücrelerin sayısı ölçülerek belirlenmiş bir kurşun bileşiğinin antiviral etkinliği ve sitotoksisite yansıtmak için kullanılmış.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Antiviral hit ilk tanımlanması için, antiviral ilaç keşfi ve geliştirilmesi için önemli adımlardan biri, ölçülebilir bir işaretleyici seçerek basit bir protokol geliştirme, yeterli sinyalleri ve daha az 10% CV elde içeren, sağlam deneyleri geliştirmektir. En çok biyokimyasal veya hücre bazlı ekranlar nedeniyle tarama işleminde gerekli tekrarlanabilirlik ve taranması için moleküllerinin potansiyel olarak çok sayıda, en sağlam, basit ve ucuz bir deneyde, dayanan kimyasal bir başlangıç noktası temin etmek üzere dizayn ed.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.
Teşekkürler
Bu proje hibe 1R03MH08127-01 ve NIH S. Li 7R03MH08127-02 tarafından desteklenen ve UAB Tıp Bölümü'nden IMPACT fonları tarafından S. Li edildi. Molette Fonu ve Auburn Üniversitesi desteği takdir edilmektedir. Biz de işin sırasında Bayan Pulin Che ve Sayın Volodymyr Musiienko gelen teknik yardımların teşekkür ederim.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| DMEM ortamı | Gibco | 1134218 | Hücre kültürü için |
| FBS | Gibco | 16000044 | Hücre kültürü için |
| % 0.05 Tripsin-EDTA | Gibco | 1000185 | Hücre kültürü için |
| DPBS | Gbico | 1049769 | Hücre kültürü için |
| CellTiter-Glo (CTG) kiti | Promega | TB288 | Hücre canlılığı ölçümü için |
| % 70 etanol | Fisher | S25309B | % 95 |
| Antiviral huashilcompound | NIH MLSMR ve de novo sentezinden | ||
| BTV-10 | ATCC | VR-187 | |
| BSR hücresi | Evde | ||
| Synergy-II çok modlu mikroplaka okuyucu | BioTek | Lüminesan sinyal okuma için | |
| MicroFlo select dağıtıcı | BioTek | Hücrelerin, virüslerin ve reaktiflerin eklenmesi | |
| 384 kuyulu düz tabanlı mikroplaka | CORNING | 28908031 | Hücre kültürü için |
| Gen. 5 yazılımı | BioTek | Synergy-II çok modlu mikroplaka okuyucu GraphPad Prism 5'ten gelen okuma çıktılarının analizi için | |
| GraphPad Sürüm | 5 | Biyostatik analiz ve çizim için |
Kaynaklar
- Hemati, B., et al. Bluetongue virus targets conventional dendritic cells in skin lymph. J. Virol. 83, 8789-8799 (2009).
- Gu, L., et al. Novel Virostatic Agents against Bluetongue Virus. PLoS ONE. 7, e43341(2012).
- Meiswinkel, R., et al.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
