Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

CDNA'dan rekombinant Newcastle Hastalığı Virüsü Rescue

20K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/50830

⸱

11 Ekim 2013

 ,  , 
1Department of Microbiology, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Global Health and Emerging Pathogens Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 3Department of Medicine, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 4Department of Microbiology and Immunology, School of Medicine and Dentistry, University of Rochester

Bu makalede

Özet

Newcastle hastalığı virüsü (NDV) yaygın olarak, diğerleri arasında, aşı ve tedavi için yeni vektörler geliştirmek için, son birkaç yıl içinde incelenmiştir. Bu çalışmalar nedeniyle bu tür burada açıklandığı gibi rekombinant virüs cDNA'sından kurtarmak için teknikler, mümkün olmuştur.

Özet

Newcastle hastalığı virüsü (NDV), ailenin Paramyxoviridae 1'in Avulavirus cinsinin prototip üyesi, segmentli olmayan, negatif sens, tek iplikçikli bir aşılama için bir vektör olarak olası uygulamaları ile RNA virüsü (Şekil 1) saran ve bir insan hastalıklarının tedavisi. Bu uygulamaların derinlemesine keşif sadece cDNA 2-5 olarak tam genomu kodlayan plazmid rekombinant virüsleri kurtarmak için ters genetik tekniklerin kurulmasından sonra mümkün hale gelmiştir. Viral cDNA uygun bir virüsün genotipinin değiştirilmesi için ve / veya yeni transkripsiyon birimleri dahil etmek için, standart klonlama prosedürlerini kullanarak, in vitro olarak modifiye edilebilir. Bu tür genetik olarak modifiye edilmiş virüsler Rescue faktörleri çok sayıda enfeksiyon aşamaları etki, hem de antijenlerinin ifadesi ve dağıtımı için vektörlerin geliştirilmesi ve iyileştirilmesi için izin anlamak için değerli bir araç sağlarAşılama ve tedavisi için. Burada rekombinant NDVs kurtarılması için bir protokol açıklar.

Giriş

Newcastle hastalığı virüsü (NDV), Avulavirus cinsine 1 ait bir kuş paramyxovirus, ciddi, tüm dünyada kanatlı hayvancılığın etkileyebilir ekonomik kuruluşları ve dolayısıyla yaygın olarak araştırılmış ve surveilled zoonotik ajandır. Bir insan patojeni rağmen, NDV de iyice bir model olarak paramixovirüsün nedeniyle son derece ilgi çekici doğal onkolitik özellikleri 6'ya hem de veteriner alanının ötesine incelenmiştir. NDV'nin Araştırma ölçüde ilk Conzelmann ve coleagues 2 ile kuduz virüsü için açıklanan tek iplikli, non-segmentli negatif anlamda RNA virüsler için ters genetik tekniklerin geliştirilmesi yararlanmıştır. Yabancı genlerin ya da vahşi tip genomun modifikasyonlarını taşıyan genetik olarak değiştirilmiş NDVs, bir dizi geniş beri incelenmiştir. Bu rekombinant virüsler ile çalışma NDV nin değil, aynı zamanda diğer ilgili huma sadece farklı hastalık oluşturma faktörlerini tanımlamak için önemli olmuşturn, influenza A virüsünün 7 gibi patojenler - veya acil Nipah virüsü 8. Ayrıca, farklı bir dizi çalışma çoğunlukla virüs immün sistemi uyarıcı özelliklerini geliştirerek, NDV 6,9,10 doğuştan gelen anti-tümör aktivitesini geliştirmek için bu tekniklerin kullanımı denenmiştir. Rekombinant NDVs araştırma diğer ilgili alanı, grip 5,11,12 gibi diğer viral hastalıklara karşı aşı adaylarının üretimi olmuştur HIV 13, SARS 15, 14, kızamık, ya da solunum sincytial virüsü (RSV) 16 kaynaklanır. NDV tarafından sağlanan çeşitli önemli avantajlar, insan popülasyonlarında önceden varolan bağışıklık eksikliği olan arasında, yabancı genetik uçlar, recombinatory bir etkinlik eksikliği ve genel olarak yukarıda sözü edilen doğal immün sistemi uyarıcı özellikleri 17, ve yüksek bir güvenlik profili kararlılığı. Ayrıca, p rekombinant bivalent aşıların potansiyel kullanımı çekicidiroultry, NDV karşı hem koruyucu ve çok patojen Avian influenza virüsleri 11,12. Bu nedenle de insanlar için korkunç bir kuş gribi olası arası özel atlama önlemek için yardım, evcil hayvanlara vahşi yayılan ikincisinin şansını azaltmak için mükemmel bir yol olabilir. Son olarak, raportör salgılayan NDV doğuştan gelen bağışıklık tepkilerinin değerlendirilmesi yanı sıra birden fazla virüs 18-27 tarafından kodlanan interferon antagonistinin tanımlanması için kullanılmıştır.

Bir rekombinant kurtarma işlemi, segmentli olmayan, negatif-şeritli RNA virüsüdür temel olarak yapay ribonükleoprotein ve RNP olarak bilinen en az iltihaplı bir moleküler makinaları, (Şekil 2) kodlayan cDNA ile transfekte üreten bir hücre içinde viral replikasyon döngüsü zorlama üzerinde oluşur. RNP viral polimeraz (P ve L proteinleri) oluşur, nükleoprotein (NP) ve virüsün tam uzunluklu antigenomik RNA. Bu RNA + antigenome thAyrıca, viral RNP proteinlerinin geri kalanı ile ilişkili tamamlayıcı RNA-genomların, üretimi için gerekli e şablon, doğal bir virüs enfeksiyonu üzerine hücrenin sitoplazması (Şekil 2A ile ilgili serbest olacağı aynı bulaşıcı kompleksi tartışıldı .) Itibaren bu adımından, viral çevrim doğal olarak devam edebilir ve modifiye genomları encapsidating rekombinant virionları, (Şekil 2B) oluşturulur. Dikkate değer, yerine antigenomik cDNA'nın genomik cDNA transfeksiyon büyük ölçüde engelleyen ya da tamamen ortadan kaldırmaktadır kurtarma verim 2,28-30. Antigenomik cDNA transfekte edilmiş olsa bile, transfekte edilmiş hücreler içinde RNP içine rekombinant RNA encapsidation verimliliği muhtemelen çok düşüktür. Bu nedenle, NDV için kurtarma protokoller genellikle permisif hücreler ve / veya bunları coculturing tarafından orijinal olarak transfekte edilmiş hücrelerden salınan birkaç viral parçacıkların yükseltilmesi için farklı adımlar şunlardırembriyolu yumurtaların enfeksiyonu.

Önceki kurtarmak için, cDNA istenilen değişiklikleri oluşturmak için standart klonlama prosedürleri ile manipüle edilebilir. Farklı gen ürünleri ve virüs düzenleyici sekansların spesifik mutasyonlar doğrudan doğruya bu şekilde elde edilebilir olsa da, yeniden birleştirici NDV ile ilgili yayınlanmış iş birçok NDV genomuna yeni bir transkripsiyonel birim eklenmesini gerektirmiştir. Paramiksovirüs ailesinin diğer üyeleri gibi, NDV genomu farklı olarak, viral yaşam çevriminde kritik 1 azalan bir gradyanı içinde 3 'ucuna konumları bakımından bağlı olarak ifade edilmiştir altı transkripsiyon birimleri halinde sekiz farklı proteinleri kodlar. Bu nedenle, genomu içinde yeni transkripsiyon ünitesinin yeri dikkatlice viral replikasyon ve transgen sentezlenmesi yetmezliği arasında bir denge elde etmek için seçilmelidir. P ve M genleri arasında Ekleme en, t kullanılmıştırhough diğer siteler de 13,31 test edilmiştir.

(I) NDV genomuna dahil edilmesi için yeni bir gen, viral RNA-bağımlı RNA için uygun sinyallerinin kontrolü altında olduğu var ne olursa olsun, insert, NDV cDNA içine klonlama rescuable bir yapı oluşturmak için bazı kurallar takip etmek gerekiyor polimeraz. Bu sekanslar, yeni açık okuma çerçevesinin (ORF) üst akışında eklenmelidir, böylece polimerazı, bir tek nükleotid sekansı intergenik (IG) ile aralıklı, önceki geni (GE) ve yeni transgen (GS) başından sonuna tanıyabilir . Paramyxoviridae ailesinin en üyeleri için olduğu gibi, NDV nin (ii) etkili bir replikasyon, genom uzunluğu birden fazla olmak bağlıdır, geçerli bir Kozak (K) ökariyotik ribozomal Çeviri geliştirmek için dizisi eklenmesi de daha iyi bir yabancı protein ifadesi 32 için önerilir Altı 33, bu nedenle herhangi bir NDV ekleme, bu "altı kural" takip etmelidir. Gerekirse, reqedinilmiş ek nükleotidleri alt yeni ORF eklenebilir ve (iii) transgen sekansı bulmak için kontrol edilmelidir mümkün GE ve kurtarma verimlilik, transgen ekspresyonu ve / veya virüs canlılığını bozabilecek dizileri gibi GS. Eğer mevcutsa, bu diziler sessiz mutagenezi ile temizlenmelidir. Yukarıda belirtilen kurallara yeniden birleştirici tam uzunlukta bir cDNA üretimi etkili bir şekilde burada ayrıntılı biçimde açıklandığı gibi, genetik olarak değişime uğramış NDV üretmek için ilk adımdır.

Sistemde tüm DNA yapıları, T7 RNA polimeraz promoteri (Şekil 3) kontrolü altındadır. Bu sitoplazmik polimerazı, bir modifiye edilmiş rekombinant vaccinia virüsü Ankara (MVA-T7) 34 ile birlikte-enfeksiyon ile trans sağlanır. Şekil 3A, tam uzunluklu antigenomik cDNA 5 kodlayan pNDV-B1 plazmid göstermektedir. Şekil 3B PTM1 plazmidler NP kodlayan gösterir, P ve L ORF. , U kodlayan plazmidler pCITE-GFP,nder T7 promoteri, yeşil floresan proteini (GFP) ve tavuk beta aktin promoteri 35 altında aynı ORF kodlayan pCAGGs GFP 18, kontrol olarak kullanılmıştır. Bu protokolde, lentojenik NDV soyu Hitchner B1 5 (Şekil 4) yeniden birleştirici NDV cDNA'sından kurtarmak için bir işlemi göstermektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1.. Memeli Hücreleri hazırlanması (Şekil 4A, Gün 1)

Bölünmüş HEp-2 ya da A549 hücreleri, 6 oyuklu plakalar içerisinde transfeksiyondan bir gün önce. Hücrelerin yoğunluğu ertesi gün% 80-90 ulaşması gerekmektedir. Genellikle, 100 mm tabak birleşik 8 kuyulara (kuyu başına 6 ila 10 x yaklaşık 1 hücreleri) ayrılabilir. Her virüs kurtarılmaya için, 2-4 farklı kuyular dahil edilmelidir, yanı sıra sırasıyla transfeksiyon ve MVA-T7 enfeksiyon verimliliği takip amaçlanmıştır kontrol pCAGGs-GFP ve GFP pCITE-18 için 2 ilave kuyular,,.

2. Bakteriyofaj T7 RNA polimerazı (MVA-T7) ifade Rekombinant Vaccinia Modifiye Ankara Virüsü ile enfeksiyon Memeli Hücrelerinin (Şekil 4A, Gün 2)

  1. 37 ° C'de PBS 1x/BA/PS ve medya ısınmak
  2. PBS 1x/BA/PS 1 ml ile iki kez, hücreler yıkayın.
  3. Bir enfeksiyon çokluğu (en MVA-T7 virüs ile kültürlenen memeli hücreleri, Infect moi: 1) oda sıcaklığında 1 saat boyunca PBS / BA / PS 200 ul'lik bir nihai hacim içinde pfu / hücre.
  4. 3 de tarif edildiği gibi viral enfeksiyon inkübasyon sırasında transfeksiyon karışımı hazırlayın.

3. Memeli Hücreleri transfeksiyonu (Şekil 4A, Gün 2)

  1. Lipofectamine hazırlanması: kurtarma girişimi OptiMEM başına 250 ul LPF2000 1-2 ug karıştırınız ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe edin.
  2. DNA hazırlanması: OptiMEM 50 ul her bir kurtarma için bir plazmid kokteyl yapın. 0,4 PTM1-NP ug PTM1-P, 0.2 ug, ve tüp başına PTM1-L 0.2 ug ekleyin. Her tüpe kurtarılmaya NDV'nin tam boy cDNA klonu 1 ug ekleyin. Ayrıca iki kontrol transfections, pCAGGs-GFP 2 mikrogram ile birini (transfeksiyon etkinliğini kontrol etmek için) ve (T7 polimeraz MVA-T7 ile ifade tahrik kontrol etmek) pCITE-GFP 2 mikrogram ile diğer hazırlar.
  3. LPF2000-OptiMEM solüsyonu, 5 dakika boyunca (adım 3.1) boyunca önceden kuluçkalanır sonra, ekleme 250DNA tüplere çözeltinin ul (3.2 adım) ve oda sıcaklığında 20-30 dakika inkübe edilir.
  4. MVA-T7 ile inkübasyondan sonra, aspirasyon ile virüs aşının çıkması ve DNA-LPF2000 transfeksiyon karışımı (adım 3.3) ile değiştirin.
  5. Her yemeğin DMEM% 10 FBS / PS 1 ml ekleyin.
  6. 37 ° C,% 5 CO2 6-8 saat (ya da gece boyunca) için enfekte / transfekte edilmiş hücrelerin inkübe edin ve daha sonra taze DMEM,% 10 FBS / PS 1.5 ml transfeksiyon ortamı değiştirin.
  7. 24 saat post-transfeksiyon olarak, kontrol kuyuları transfeksiyon verimi (pCAGGs-GFP) ve T7 polimeraz aktivitesi (pCITE-GFP) (Şekil 5A) değerlendirmek için bir floresan mikroskobu altında gözlemlenebilir. Aşağıda tarif edildiği gibi kuş fibroblastlar ile enfekte / transfekte edilmiş hücrelerin ko-kültürü ile devam edin.

4. Avian Hücreler, memeli hücrelerinin ko-kültür (Şekil 4A, Gün 3)

Genellikle, tavuk konfluent 100 mm doku kültürü çanağı (CEFS) or ördek (Defs) embriyoblastlarında iki transfekte kuyularının başına kullanılır. , Önceden, bütün kurtarma girişimleri başına kuş hücreleri yeterince 100 mm doku kültürü yemekleri hazırlamak için emin olun. Virüsün etkin kurtarılması için, DMEM,% 10 FBS / PS ortam alantoik akışkan, 30 mM MgCl2 ve% 5 ile takviye edilir. Bu noktada, 24 saat pi, memeli hücreleri nedeniyle MVA-T7 enfeksiyon, Şekil 5A'da asevident için sitopatik etki (CPE) arası başlayabilir.

  1. 37 ° C'ye kadar PBS 1x ve medya ısınmak
  2. 1x PBS içinde 1 ml, 2x, memeli hücrelerini yıkayın.
  3. Bu müstakil kadar EDTA-tripsin 0.2 ml memeli hücrelerini tripsinize edin. DMEM,% 10 FBS / PS 1 ml hücrelerin tekrar,% 5'lik alantoik akışkan, 30 mM MgCI2 ve bir 100 mm doku kültürü çanağı transfer. Aynı medya 3 ml ekleyin.
  4. 1x PBS içinde 4 ml ile iki kez, kuş hücreleri yıkayın.
  5. Hücreleri ayırmak kadar 1 EDTA-tripsin ml ile tripsinize kuş hücreleri, 37 ° C'de 1-2 dakika boyunca inkübe edin. Süspanse inci8 DMEM,% 10 FBS / PS,% 5'lik alantoik akışkan, 30 mM MgCl2 ve 8 ml toplam hacim için ko-kültürlenmiştir 100 mm doku kültürü çanağı içinde memeli hücreleri tripsinize edilmiş hücre 4 ml eklemek e hücrelerin ml (4 ml memeli, kuş hücreleri 4 mi).
  6. Yavaşça muntazam bir dağılımının ve daha sonra, 3-4 gün boyunca 37 ° C'de inkübatör içinde yerleştirmek için, el ile 100 mm tabak içinde ko-kültür hücreleri sallayın. 3 ya da 4 gün memeli ve avian hücrelerinin ortak kültürden sonra yumurta enfekte edilmesi için kriterler (hücre yuvarlama, ölüm, yüzeyden ayrılması, vb.) MVA-T7 viral enfeksiyon gözlenmiştir ne kadar sitopatik etki bağlıdır.

5. Tavuk Embriyone Yumurta Enfeksiyon (Şekil 4A, Gün 6-7)

  1. Memeli ve avian hücrelerinin ko-kültür 3-4 gün sonra, yüzen doku kültürünün 1 ml çıkarın ve bir Eppendorf tüpüne ekleyin.
  2. Bir tezgah içinde 12,000 rpm'de 1 dakika için doku kültürü süpernatantı santrifüjhücresel enkaz kaldırmak için üst santrifüj.
  3. Hava kesesi ve Allantoik boşluğu arasındaki arayüzünü görmek için bir ışık ışıklı denetim kutusunu kullanarak yumurta Mum. Arayüz sınır kan damarı yerelleştirme kaçınarak bir işareti yapmak. Steril koşulları kurmak için fazla yumurta% 70 etanol sprey. Yavaşça işaretli noktada kabuğu bir delik yapmak ve allantoik oyuğuna dikey ve doğrudan iğne amaçlayan, bir insülin (1 mi) şırınga kullanılarak süpernatan 500 ul inokülasyon. (Şekil 4B).
  4. Erimiş mum veya parafin ile yumurta kabuğu içinde nick Seal.
  5. 37 ° C sıcaklıkta 2-3 gün boyunca inkübe yumurta

6. Enfekte Tavuk Embriyone Yumurta dan Alantoyik Fluid (Şekil 4A, Gün 8-10) Hasat

  1. Tavuk embriyo öldürmek ve kan pıhtılaşmasını için 4 ° C'de 2-4 saat veya gece boyunca enfekte edilmiş yumurta inkübe edin.
  2. % 70 etanol (steril koşulların muhafaza edilmesi için) ile yumurta püskürtün.
  3. Dikkatli bir kaşıkla hava boşluğunun üzerindeki yumurtanın apikal bölümüne dokunun. Yumurta kabuğu çatlamış sonra, forseps ile parçaları kaldırmak ve tam Allantoik zarı maruz.
  4. Kan damarlarının zarar görmesini ve yumurta sarısı kaçınarak, forseps ve makas ile Allantoik membran kesilmesiyle Allantoik boşluğuna maruz.
  5. Dikkatlice bir spatula ile embriyo aşağı doğru itin ve 10 ml pipet ile upflowing Allantoik sıvı (yumurta başına 8-12 ml) toplamak. Sarısı zarına zarar kaçının. Buz üzerinde bir 15 ml santrifüj tüpüne (yumurta için bir tüp kullanmak) için alantoik akışkan aktarın.
  6. 1500 rpm'de 5 dakika boyunca santrifüj ile, allantoik akışkanın açıklığa kavuşturulacaktır. Pelet bozmadan, yeni bir tüpe transfer süpernatant.
  7. En fazla 1 hafta boyunca 4 ° C'de saklayın örnekleri, hemaglütinasyon testi ile NDV nin varlığı için onları kontrol kadar.

7. Hemaglüsinasyon (HA) Deneyi

Allant virüsün varlığıenfekte yumurtadan oik sıvı hindi, kırmızı kan hücrelerini (RBC) hemagglutinate kabiliyetleri ile makroskopik olarak belirlenebilir. NDV nin durumunda, ml başına yaklaşık olarak 10 birim oluşturan 6 plaka (pfu) HA deneyinde pozitif bir sinyal vermek için gereklidir. HA deneyler, V-dipli, 96 oyuklu plakalar içerisinde gerçekleştirilir. Negatif (PBS 1x, bulaşmamış allantoik sıvı) gibi pozitif (herhangi NDV virüs allantoik sıvı) kontrol örnekleri her zaman doğrulamak için herhangi bir HA deneyde dahil edilmelidir. Bir HA deneyi gerçekleştirmek için:

  1. Pipet, bir V-tabanlı 96 oyuklu bir plaka içerisinde oyuk başına PBS 1x 50 ul.
  2. Pipet plakanın birinci sütun üzerindeki kuyu içine alantoik sıvı örneklerinin 50 ul. Plakanın geri kalanı ile 2 kat seri dilüsyonları gerçekleştirmek ve son sütunda kuyulardan son, ilave 50 ul atın.
  3. Kuyu başına PBS 1x 0.5% türkiye RBC 50 ul dağıtın. Hafifçe dokunarak plaka sallayın.
  4. 4 ° C (ya da buz) f de inkübeya da 30-45 dakika ya da açık bir topak kadar negatif kontrol kuyuları oluşturulur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

NDV'nin Kurtarma rutin virüsün tam cDNA erişebilir laboratuarlarda yapılan köklü bir işlemdir. Bununla birlikte, yöntemin içsel stokastik doğası zor% 100 verim elde etmek için kurtarma kılar. Işlemin ilk aşamaları, MVA-T7 ile özel olarak transfeksiyon verimi ve enfeksiyon izlenmesi, olası sorunları. Şekil 5A, standart transfeksiyon ve başarılı bir NDV kurtarma için yeterli transfeksiyon / enfeksiyon verimlilik gösterir belirleme yardımcı olur. Avyan memeli ko-kültür ve embriyolu yumurtalarda amplifikasy...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Çeşitli faktörler NDV tahlisiye sırasında iyi sonuçlar elde etmek için kabul edilmelidir. İlk olarak, kullanılacak olan tam uzunluktaki bir cDNA konstruktu NDV genomuna yeni transgenler / modifikasyonlarının işlevsel dahil edilmesini sağlamak için tasarlanmış olması gerekmektedir. (Ii) herhangi bir varsayımsal GE GS sekansları, dış içine vardır, yukarıda belirtildiği gibi, bu (i) Uygun bir gen ucu (GE), intergenik (IG) ve gen start (GS) dizileri gerekirse ilave edilmesi olduğu, anlamına gelir, geni, ve (iii) tam rekombi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Adolfo García-Sastre Mount Sinai Tıp Okulu Icahn aittir rekombinant Newcastle hastalığı virüsleri üzerinde patent bir mucit.

Teşekkürler

Yazarlar Dr laboratuvarlarında geçmiş ve bugünkü üyelerine teşekkür etmek istiyorum. Peter Palese ve NDVnin gelişimi için Adolfo García-Sastre genetik teknikleri ve teknik yardım için ters. NiaD R01AI088770 hibe ve Mükemmeliyet İç Güvenlik Bilim ve Teknoloji Merkezi Bölümü tarafından tarafından AG-S laboratuvarda Newcastle hastalığı virüsü Araştırma kısmen finanse Gelişen ve Zoonotik Hayvan Hastalıkları (CEEZAD, ödül sayısı 2010-ST-061-AG001). LM-S Araştırma laboratuvarında NIH hibe RO1'e AI077719, R21NS075611-01, R03AI099681-01A1, Grip Araştırma ve Gözetleme (HHSN266200700008C) Mükemmeliyet NIAID Merkezleri ve biyosavunma Bağışıklık Modelleme için Rochester Merkezi Üniversitesi (HHSN272201000055C) tarafından finanse edilmektedir .

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
DMEMCORNING Cellgro10-013-CVHerhangi bir tedarikçi
OptiMEMGIBCO31985-070
Lipofektamin 2000 (LPF2000)Invitrogen11668-019
%35 Sığır Albümini (BA)Sigma232-936-2Herhangi bir tedarikçi
Tripsin-EDTACORNING Cellgro25-052-CIHerhangi bir tedarikçi
Penisilin / Streptomisin (PS) 100xCORNING Cellgro30-002-CIHerhangi bir tedarikçi
Fetal Sığır Serumu (FBS)HycloneSH30070.03bir tedarikçi

Hücre hatları
A549 hücreleri (katalog numarası CRL-185), HEp-2 hücreleri (katalog numarası CRL-185), tavuk embriyosu fibroblastları (katalog numarası CRL-12203) ve ördek embriyosu fibroblastları (katalog numarası CCL-141) American Type Culture Collection'dan (ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA. 20110-2209 ABD) temin edilebilir. Tüm hücre hatları 37 & derece; DMEM'de %5 CO2 içeren C inkübatörü %10 FBS, %1 PS.
Embriyonlu tavuk yumurtası
Embriyonlu tavuk yumurtaları Charles River Laboratuvarları, Specific Pathogen Fee Avian Supply (SPAFAS) Avian Products and Services'ten (Franklin Commons, 106 Route 32, Kuzey Franklin, CT 06254, ABD) ve 37 ° C'de tutulur. Embriyoların canlılığı bir yumurta mumcusu ile değerlendirilir. Yumurtalar 8-10 günlük olduklarında enfekte olurlar. Allantoik sıvının hem enfeksiyonu hem de toplanması steril koşullar altında gerçekleşir. Tüm yumurtalar standart laboratuvar biyogüvenlik protokollerine göre otoklavlanır ve atılır.
Türkiye kırmızı kan hücreleri (RBC)
Türkiye RBC, Truslow Farms'tan (201 Valley Road, Chestertown, Md 21620, ABD) satın alınabilir ve 4 ° C'de saklanabilir. RBC'yi HA testi için hazırlamak için, 5 ml'lik ticari stoğu 50 ml'lik bir konik tüpte 45 ml PBS 1x ile yıkayın. 1.000 rpm'de 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı dikkatlice atın. Son %0.5-1.0 konsantrasyon için peletlenmiş RBC 1: 1.000'i PBS 1x içinde seyreltin. Yıkanmış RBC 4 ° C'de saklanabilir; Birkaç gün boyunca C.
Plazmitler
Plazmid preparatları, üretici''u takiben piyasada bulunan herhangi bir maxiprep kiti ile elde edilir; ddH < sub > 2 < / sub>0 içinde 1 & mu'luk bir nihai konsantrasyona seyreltilmiş s talimatları; g/μ DNA konsantrasyonu ve saflığı, 260 ve 280 nm'de spektrofotometri ile değerlendirilir. 260/280 oranı 1.8'den yüksek olan müstahzarlar, kurtarma için kabul edilebilir kalitede kabul edilir. Plazmid DNA kalitesi ayrıca agaroz jel kromatografisi ile rutin olarak iki kez kontrol edilir.
Virus
Lentojenik NDV suşu Hitchner B1'in kurtarılması için açıklanan protokol, biyogüvenlik seviyesi (BSL) 2 koşulları altında gerçekleştirilebilir. T7 RNA polimerazı (MVA-T7) eksprese eden Modifiye Vaccinia Ankara34 olarak tanımlandı ve Dr. Bernard Moss'tan elde edildi. Bu virüs, tavuk embriyosu fibroblastlarının birleşik tek tabakalarında büyür ve memeli (A549 veya HEp-2) hücrelerinde titre edilir. NDV stokları embriyonlu tavuk yumurtalarında büyütülür ve saflaştırılmış viryonlara karşı yükseltilmiş poliklonal serum kullanılarak IFA ile titre edilir. Tüm kontamine materyaller standart biyogüvenlik prosedürlerine göre güvenli bir şekilde sterilize edilmeli ve atılmalıdır.
Doku kültürü ortamı ve solüsyonları:
DMEM %10 FBS %1 PS: Dulbecco' s modifiye Kartal' % 10 fetal sığır serumu (FBS) ve Penisilin / Streptomisin (P / S) ile desteklenmiş Orta (DMEM): 445 ml DMEM, 50 ml ısıyla inaktive edilmiş FBS, 5 ml 100x ticari P / S çözeltisi. 4 derece < br / > < güçlü > 10x Fosfat tamponlu salin (PBS) de saklayın: < / güçlü> 80 g NaCl, 2 g KCl, 11.5 g Na2< / sub>HPO<>sub4< / sub>.7H2< / sub>O, 2 g KH2PO4. 1 L'ye kadar ddH2O ekleyin. PH'ı 7.3'e ayarlayın. Otoklav ile sterilize edin. Oda sıcaklığında saklayın.
1x PBS: < / güçlü> 10x PBS 1:10'u ddH2O ile seyreltin. Otoklav ile sterilize edin ve oda sıcaklığında saklayın.
100x Ca/Mg: 1.327 g CaCl2.2H2O, 2.133 g MgCl2.6H2O ve 100 ml'ye kadar ddH2O ekleyin. Otoklavlayın ve oda sıcaklığında saklayın.
1x PBS/BA/PS: 50 ml 10x Fosfat tamponlu salin (PBS) 437 ml ddH2O. Otoklav ve oda sıcaklığına soğutulduğunda 5 ml 100x Penisilin / Streptomisin 3 ml %35 Sığır ve 5 ml 100x Ca/Mg ekleyin. 4 derece C.

Herhangi

Kaynaklar

  1. Lamb, R. A., Parks, G. D. Fields Virology. Howley, P. H., Knipe, D. M. , Lippincott Williams & Wilkins. 1647-1689 (2007).
  2. Schnell, M. J., Mebatsion, T., Conzelmann, K. K. Infectious rabies viruses from cloned cDNA. EMBO J. 13, 4195-4203 (1994).
  3. Peeters, B. P., de Leeuw, O. S., Koch, G., Gielkens, A. L. Rescue of Newcastle disease virus from cloned cDNA: evidence that cleavability of the fusion protein is a major determinant for virulence. J. Virol. 73, 5001-5009 (1999).
  4. Romer-Oberdorfer, A., Mundt, E., Mebatsion, T., Buchholz, U. J. Generation of recombinant lentogenic Newcastle disease virus from cDNA. J. Gen. Virol. 80 (Pt 11), 2987-2995 (1999).
  5. Nakaya, T., et al. Recombinant Newcastle disease virus as a vaccine vector. J. Virol. 75, 11868-11873 (2001).
  6. Zamarin, D., Palese, P. Oncolytic Newcastle disease virus for cancer therapy: old challenges and new directions. Future Microbiol. 7, 347-367 (2012).
  7. Park, M. S., Garcia-Sastre, A., Cros, J. F., Basler, C. F. Newcastle disease virus V protein is a determinant of host range restriction. J. Virol. 77, 9522-9532 (2003).
  8. Park, M. S., et al. Newcastle disease virus (NDV)-based assay demonstrates interferon-antagonist activity for the NDV V protein and the Nipah virus V, W, and C proteins. J. Virol. 77, 1501-1511 (2003).
  9. Zamarin, D., et al. Enhancement of oncolytic properties of recombinant newcastle disease virus through antagonism of cellular innate immune responses. Mol. Ther. 17, 697-706 (2009).
  10. Vigil, A., et al. Use of reverse genetics to enhance the oncolytic properties of Newcastle disease virus. Cancer Res. 67, 8285-8292 (2007).
  11. Swayne, D. E., et al. Recombinant paramyxovirus type 1-avian influenza-H7 virus as a vaccine for protection of chickens against influenza and Newcastle disease. Avian Dis. 47, 1047-1050 (2003).
  12. Park, M. S., Steel, J., Garcia-Sastre, A., Swayne, D., Palese, P. Engineered viral vaccine constructs with dual specificity: avian influenza and Newcastle disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 8203-8208 (2006).
  13. Carnero, E., et al. Optimization of human immunodeficiency virus gag expression by newcastle disease virus vectors for the induction of potent immune responses. J. Virol. 83, 584-597 (2009).
  14. Kim, D., et al. Induction of type I interferon secretion through recombinant Newcastle disease virus expressing measles virus hemagglutinin stimulates antibody secretion in the presence of maternal antibodies. J. Virol. 85, 200-207 (2011).
  15. DiNapoli, J. M., et al. Newcastle disease virus, a host range-restricted virus, as a vaccine vector for intranasal immunization against emerging pathogens. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 9788-9793 (2007).
  16. Martinez-Sobrido, L., et al. Protection against respiratory syncytial virus by a recombinant Newcastle disease virus vector. J. Virol. 80, 1130-1139 (2006).
  17. Bukreyev, A., Collins, P. L. Newcastle disease virus as a vaccine vector for humans. Curr. Opin. Mol. Ther. 10, 46-55 (2008).
  18. Martinez-Sobrido, L., Zuniga, E. I., Rosario, D., Garcia-Sastre, A., de la Torre, J. C. Inhibition of the type I interferon response by the nucleoprotein of the prototypic arenavirus lymphocytic choriomeningitis virus. J. Virol. 80, 9192-9199 (2006).
  19. Jennings, S., Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A., Weber, F., Kochs, G. Thogoto virus ML protein suppresses IRF3 function. Virology. 331, 63-72 (2005).
  20. Kochs, G., Garcia-Sastre, A., Martinez-Sobrido, L. Multiple anti-interferon actions of the influenza A virus NS1 protein. J. Virol. 81, 7011-7021 (2007).
  21. Munoz-Jordan, J. L., et al. Inhibition of alpha/beta interferon signaling by the NS4B protein of flaviviruses. J. Virol. 79, 8004-8013 (2005).
  22. Cardenas, W. B., et al. Ebola virus VP35 protein binds double-stranded RNA and inhibits alpha/beta interferon production induced by RIG-I signaling. J. Virol. 80, 5168-5178 (2006).
  23. Mibayashi, M., et al. Inhibition of retinoic acid-inducible gene I-mediated induction of beta interferon by the NS1 protein of influenza A virus. J. Virol. 81, 514-524 (2007).
  24. Kopecky-Bromberg, S. A., Martinez-Sobrido, L., Frieman, M., Baric, R. A., Palese, P. Severe acute respiratory syndrome coronavirus open reading frame (ORF) 3b, ORF 6, and nucleocapsid proteins function as interferon antagonists. J. Virol. 81, 548-557 (2007).
  25. Rose, K. M., Elliott, R., Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A., Weiss, S. R. Murine coronavirus delays expression of a subset of interferon-stimulated genes. J. Virol. 84, 5656-5669 (2010).
  26. Roth-Cross, J. K., Martinez-Sobrido, L., Scott, E. P., Garcia-Sastre, A., Weiss, S. R. Inhibition of the alpha/beta interferon response by mouse hepatitis virus at multiple levels. J. Virol. 81, 7189-7199 (2007).
  27. Andersson, I., et al. Crimean-Congo hemorrhagic fever virus delays activation of the innate immune response. J. Med. Virol. 80, 1397-1404 (2008).
  28. Lawson, N. D., Stillman, E. A., Whitt, M. A., Rose, J. K. Recombinant vesicular stomatitis viruses from DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 4477-4481 (1995).
  29. Kato, A., et al. Initiation of Sendai virus multiplication from transfected cDNA or RNA with negative or positive sense. Genes Cells. 1, 569-579 (1996).
  30. Durbin, A. P., et al. Recovery of infectious human parainfluenza virus type 3 from cDNA. Virology. 235, 323-332 (1997).
  31. Zhao, H., Peeters, B. P. Recombinant Newcastle disease virus as a viral vector: effect of genomic location of foreign gene on gene expression and virus replication. J. Gen. Virol. 84, 781-788 (2003).
  32. Kozak, M. At least six nucleotides preceding the AUG initiator codon enhance translation in mammalian cells. J. Mol. Biol. 196, 947-950 (1987).
  33. Calain, P., Roux, L. The rule of six, a basic feature for efficient replication of Sendai virus defective interfering RNA. J. Virol. 67, 4822-4830 (1993).
  34. Wyatt, L. S., Moss, B., Rozenblatt, S. Replication-deficient vaccinia virus encoding bacteriophage T7 RNA polymerase for transient gene expression in mammalian cells. Virology. 210, 202-205 (1995).
  35. Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
  36. Moss, B., Elroy-Stein, O., Mizukami, T., Alexander, W. A. Product review. New mammalian expression vectors. Nature. 348, 91-92 (1990).
  37. Conzelmann, K. K. Reverse genetics of mononegavirales. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 283, 1-41 (2004).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Rekombinant Virüs KurtarmaTers GenetikMemeli Hücre TransfeksiyonuKanatlı Hücre Ko-kültürüEmbriyone Edilmiş Tavuk YumurtalarıHemaglütinin AnaliziT7 Polimeraz SistemiPlazmid DNA TransfeksiyonuVirüs Amplifikasyonu
CDNA'dan rekombinant Newcastle Hastalığı Virüsü Rescue
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.