Tek hücreli Yara Şifa sırasında Sitoplazmik Akışı görselleştirme Stentor coeruleus

Özet

Dev siliyer Stentor coeruleus, tek hücrelerde rejenerasyon ve yara iyileşmesini incelemek için klasik bir sistemdir. Stentor hücrelerini aynı anda düşük ve yüksek büyütmede görüntüleyerek, yaralama öncesinde, sırasında ve sonrasında sitoplazmik akışları ölçmek mümkündür.

Özet

Yara iyileşmesi genellikle tüm dokular düzeyinde ele alınsa da, çoğu durumda tek tek hücreler kendi içlerindeki yaraları iyileştirebilir ve hücresel içerik dışarı sızmadan önce kırık hücre zarını onarabilir. Hücrelerin bir milimetreden daha büyük olabildiği dev tek hücreli organizma Stentor coeruleus, tek hücrelerde yara iyileşmesini incelemek için klasik bir model organizma olmuştur. Stentor hücreleri, canlılık kaybı olmadan ikiye bölünebilir ve hatta birlikte kesilip aşılanabilir. Ancak kesmeye karşı bu yüksek tolerans, sitoplazmanın neden sadece kesimin boyutundan dışarı akmadığı sorusunu gündeme getiriyor. Burada, Stentor hücrelerini kesmek için bir yöntem sunarken, aynı anda kesimin yakınındaki sitoplazmanın hareketini yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlükte görüntülüyoruz. Yöntemimizin anahtarı, ameliyatın, yüksek NA lensli ters çevrilmiş bir mikroskop kullanılarak aynı anda yüksek çözünürlükte aşağıdan görüntülenen bir odaya odaklanan bir diseksiyon mikroskobu altında gerçekleştirildiği bir "çift katlı" mikroskop konfigürasyonu kullanmaktır. Bu kurulum, sitoplazmanın yüksek çözünürlüklü izlenmesine izin verirken, cerrahi prosedür üzerinde yüksek düzeyde kontrol sağlar.

Giriş

Rejenerasyon ve yara iyileşmesi, mekanizmaları aktif araştırma alanları olarak kalan önemli biyolojik süreçlerdir. Nitekim yaraları iyileştirme ve hasarlı parçaları yeniden oluşturma yeteneği, canlıları cansız nesnelerden ayıran özelliklerden biridir. Normalde, rejenerasyona, kök hücrelerin hasar görmüş veya kopmuş bir hayvan parçasını yeniden inşa etmek için gereken çeşitli hücre tiplerine farklılaşmasının aracılık ettiği düşünülürken, yara iyileşmesi, sağlam bir epiteli yeniden inşa etmek için bir yarayı istila eden yeni hücreler açısından görülür. Bu nedenle, her iki sürece de tek tek hücrelerin kolektifleri aracılık ediyor gibi görünmektedir ve bu nedenle özünde çok hücreli süreçler gibi görünmektedir. Bu nedenle, tek tek hücrelerin bazı durumlarda yaraları onarabilmesi ve kaybedilen bileşenleri yeniden oluşturabilmesi potansiyel olarak şaşırtıcıdır¹. Tek hücreler içindeki yara iyileşmesi, aktin-miyozin, çanta ipi, yara etrafında kasılma ve ekzositotik veziküllerin^1-3'ün hızlı füzyonu ile zar yaması dahil olmak üzere birden fazla yolu içerebilir. Her ne kadar birçok hücre tipi bir dereceye kadar yara iyileşmesi^4-6 yeteneğine sahip olsa da, belki de en dramatik örnek, Şekil 1'de gösterilen dev siliyer Stentor coeruelus^7'dir. Bireysel Stentor hücreleri 1 mm uzunluğundadır ve kirpik sıraları ile kaplıdır. Stentör hücreler koni şeklinde, bir ucunda binlerce kirpikten oluşan ağız içi bir aparat, diğer ucunda ise dar tutunma hızlı bir yapıdadır. Stentor, rejenerasyonu incelemek için klasik bir model organizmaydı çünkü hücrenin herhangi bir kısmı kesilirse, yeniden üretebilirdi⁷. Örneğin, klasik bir deney dizisinde, Thomas Hunt Morgan⁸, bir Stentor hücresinin ikiye bölünebileceğini ve her bir yarının normal orantılı bir hücreyi^{birkaç saat içinde} 8 oluşturacağını gösterdi. Stentor'da rejenerasyondan sorumlu moleküler yollar tamamen bilinmemektedir.

Stentor hücrelerinin bir rejenerasyon modeli sistemi olarak hizmet etme yeteneği, bu hücrelerin kesildikten sonra kendilerini iyileştirme konusundaki inanılmaz yeteneklerine dayanır. Bir Stentor hücresinin sitoplazması, hücre kesildiğinde neden dışarı sızmaz? Yara iyileşmesi, hücre korteksinin hemen kasılmasına bağlı değildir, çünkü iki Stentor hücresi almak, onları kesmek ve daha sonra iki kesilmiş hücreyi çeşitli konfigürasyonlarda bir araya getirmek mümkündür⁷. Bu tür aşılama deneyleri sırasında, iki hücrenin sitoplazması, hücreler birbirine itildiğinde kaynaştığı için açıkta kalmalıdır. Her nasılsa, sitoplazma aşılamaya izin verecek kadar çevredeki ortama maruz kalır, ancak yine de hücreden dışarı akmaz. Stentor'un sitoplazması, plazma zarında büyük bir delik açılsa bile dışarı akamayacak kadar elastik mi? Hücreler, sitoplazmanın dışarı akmasını önlemek için bir yaranın etrafındaki lokal olarak sitoplazmanın viskozitesini arttırır mı? Sitoplazma, oldukça karmaşık bir aktif materyal^9-11'dir ve Stentor yara iyileşme yanıtı, tek hücreli yara iyileşmesi sırasında sitoplazmik akışları ve mekaniği incelemek için eşsiz bir fırsatı temsil eder. Bununla birlikte, Stentor'da yarayı indüklemek için cerrahi yöntemlerin kullanılması teknik bir zorluk teşkil etmektedir. Konvansiyonel cerrahi paradigma olan cam iğneler kullanılarak 1 mm uzunluğundaki bir hücreyi kesmek için düşük büyütme ile uzun çalışma mesafesi ile ameliyat etmek gerekir. Bu görüntüleme koşulları altında, sitoplazmanın akışını izlemek mümkün değildir ve belirlenebilecek tek şey sitoplazmanın hücre içinde kalıp kalmadığıdır. Sormak istediğimiz asıl soru, kesme ve iyileşme sırasında sitoplazmanın hareketinin ve viskozitesinin nasıl değişebileceğidir. Bu, yüksek çözünürlüklü görüntüleme gerektirir. Burada, Tartar'ın Stentor⁷'yi kesme protokolünün bir uyarlamasını sunuyoruz, bu da kesimin tüm hücreyi görmek için daha düşük büyütmeli optikler altında yapılmasına izin verirken aynı zamanda yüksek çözünürlükte sitoplazma akışını gözlemliyor ve bu sistemin tek hücreli yara iyileşmesi mekanizmalarını keşfetmek için bir platform olarak kullanılmasına izin veriyor

.

Protokol

1. Hücre Kültürü ve Toplama

1. Stentor coeruleus hücrelerini ya Tartar⁷ tarafından tarif edildiği gibi doğal havuzlardan ya da ticari bir tedarikçiden alın (bkz Reaktifler).
2. 0.75 mM Na₂CO₃, 0.15 mM KHCO₃, 0.15 mM NaNO₃, 0.15 mM KH₂PO₄, 0.15 mM MgSO₄, 0.5 mM CaCl₂ içeren Tartar⁷ ve De Terra¹² tarafından tarif edilen tariflerden uyarlanan Modifiye Stentor Ortamında (MSM) karanlıkta 20 ºC'de büyüyerek kültürleri koruyun, ve 1.47 mM NaCl.
3. Ortama canlı av ekleyerek MSM ortamını bir karbon kaynağı ile destekleyin. Standart kültür yöntemlerini kullanarak Chlamydomonas reinhardtii TAP besiyeri kültürlerini büyütün¹³. Beslenmeden önce, MSM'de Chlamydomonas hücrelerini yıkayın. Haftada 2-3 kez 300 ml Stentor kültürleri ~ 3 x 10⁷ Chlamydomonas hücresi besleyin.
4. Bir pipet kullanarak ameliyat için Stentor hücrelerini toplayın. Stentor genellikle kültür kabının dibine ve yanlarına tutunur ve bu nedenle hücreleri toplamak için, hücreler ayrılmaya ve serbestçe yüzmeye başlayana kadar bir pipet ucundan hava köpürterek kültürü çalkalar.
5. Hücrelerin kesilmesini önlemek için geniş delikli bir uçla donatılmış bir pipet kullanarak yüzme hücrelerini yakalayın.
6. Toplanan hücreleri taze MSM'de yıkayın.

2. Mikrocerrahi için Aletlerin Hazırlanması

1. Uçları erimeye başlayana kadar iki cam karıştırma çubuğunu bir Bunsen brülörü veya başka bir alev üzerinde tutun.
2. Erimiş camın kaynaşması için iki çubuğun uçlarını birbirine dokundurun.
3. İki çubuk arasında küçük bir erimiş cam damlası oluşturduktan sonra, bunları alevden çıkarın, 1-2 saniye soğumaya bırakın ve ardından temiz bir mola vermek için ayırın. İdeal olarak, cam soğudukça cam ince teller halinde dışarı çekilecek ve düzgün bir şekilde kırılacak ve bu da ucunda ince uçlu yaklaşık 1-2 cm uzunluğunda bir iğne ile sonuçlanacaktır (Şekil 2).
4. Ortaya çıkan iğne yetersiz kalırsa, uçlar cam atıklarına ayrılabilir ve çubuklar yeniden kullanılabilir.

3. Mikrocerrahi ve gözlem için hücre montajı (Normal cerrahi)

1. Vazelin ile kaplanmış ve bir cam lamel üzerine bastırılmış kare bir lastik damga kullanarak kare bir Vazelin duvarlı oda hazırlayın.
2. Vazelin karesine %2 Metil Selüloz içeren MSM ekleyin.
3. Lameli plastik bir adaptöre yerleştirin, bu da lamellerin standart bir slayt tutuculu bir mikroskop üzerine yerleştirilmesini sağlar (Şekil 3).
4. Stentor hücrelerinin hareketliliğini engellemek için adım 1.6'dan yıkanmış hücreleri MSM artı metil selüloza ekleyin, böylece ameliyat sırasında yerinde kalırlar.
5. Metil selülozdaki hücreleri, eşit aralıklarla yerleştirilecek ve görüntüleme sırasında odakta olacak şekilde lamel yüzeyine yeterince yakın itilecek şekilde düzenleyin.

4. Canlı Stentor Olarak Yara İyileşmesinin Yüksek Çözünürlüklü Görüntülenmesi

Bir Stentor hücresini düşük büyütme altında cerrahi olarak keserken aynı anda yüksek çözünürlükte görüntülemek için, ters çevrilmiş dürbünün mercek kafasına bağlı bir diseksiyon dürbünü ile bir "çift katlı" mikroskop oluşturun, böylece ters çevrilmiş dürbün slaydın altından odaklanırken slaydın üst kısmına odaklanır.

1. Ters çevrilmiş dürbün üzerine bir slayt koyun (Zeiss Axiovert 200M veya Olympus IX80 kullanın).
2. Diseksiyon mikroskobu gövdesini standından çıkarın ve slaydın düşük büyütmede görüntülenmesini sağlamak için diseksiyon dürbünü yerleştirmek için ters çevrilmiş mikroskop merceğinin üzerindeki yaklaşık konumu belirleyin.
3. Bir karton kutuyu, ters çevrilmiş dürbün mercek kafası ile diseksiyon dürbünü arasındaki istenen boşlukla aynı kalınlığa sahip olacak şekilde değiştirin, ardından deney tamamlandığında kolayca çıkarılabilen laboratuvar bandı kullanarak ters çevrilmiş dürbün içine bantlayın. Kutunun kalınlığını, ters çevrilmiş mikroskobun mercek kafasının tam konfigürasyonuna ve diseksiyon mikroskobunun boyutuna göre ayarlayın, böylece numune, takıldıktan sonra diseksiyon kapsamını hareket ettirmeye gerek kalmadan görüş alanında olacaktır.
4. Diseksiyon dürbününü kutuya karşı tutarak, slayt odaklanana kadar hareket ettirin, ardından laboratuvar bandı kullanarak kutuya tekrar bantlayın. Son konfigürasyon Şekil 4'te gösterilmiştir.
5. DIC optiği ve 20X hava objektif lensi kullanarak ters çevrilmiş dürbün aracılığıyla hücreleri görüntüleyin. Mikrocerrahiyi yukarıdan gerçekleştirmek için yeterli alan sağlamak için uzun çalışma mesafeli bir DIC kondansatörü kullanın.
6. 512 x 512 CCD kamera kullanarak saniyede 2 görüntü hızında görüntü elde edin.
7. İlk sitoplazmik akış modelini yakalamak ve yara ve yara iyileşme sürecinin tüm aşamalarını gözlemlemek için hücreleri kesmeye başlamadan önce edinime başlayın.
8. Rejenerasyon süreci boyunca sitoplazmik hareketleri görselleştirmek ve ölçmek için hücre normal görünümüne ve/veya aktif motiliteye geri döndüğünde edinimi sonlandırın.

5. Yara İyileşmesi Sırasında Sitoplazmik Akışın Analiz Edilmesi

Parçacık görüntü hızı (PIV) kullanarak sitoplazmik akışı ölçün. Bu teknik, akışkanlar dinamiği çalışmasında rutindir ve akışkanda ayrı ayrı izlenebilir parçacıkların yokluğunda akış alanları oluşturabilir. PIV, iletilen ışık mikroskobu¹⁴ ile hücre altı veziküllerin ve sitoplazmada görülebilen diğer özelliklerin görüntülenmesine dayalı olarak sitoplazma akışlarını ölçmek için kullanılmıştır.

1. PIV için bir MATLAB paketi olan PIVLab'ı http://pivlab.blogspot.com/ web sitesinden indirin.
2. Her video dizisi için tiff görüntü yığınını MATLAB içindeki PIV programına yükleyin.
3. Ham verilerin Stantor gövdesi dışındaki bölgelerini maskelemek için her görüntü yığını için manuel olarak bir maske oluşturun.
4. PIVLab'ı hızlı Fourier dönüşümü ayarını ve her karedeki pikselleri daha büyük kare piksellere bölecek olan 64 x 64 piksellik bir bölme boyutunu kullanacak şekilde ayarlayın.
5. Her karedeki pikseller ile bir sonraki karedeki yakındaki pikseller arasındaki çapraz korelasyonları hesaplamak için PIVLab'ı çalıştırın ve ham verilerimizle aynı zaman çözünürlüğüne sahip olan her bir gruplanmış pikselde merkezlenmiş zamana bağlı bir akış vektörü elde edin.
6. Kesmeden önce ve yara iyileşmesi sırasında Stentor ile alınan veriler arasında karşılaştırma yapmak için akış çizgileri oluşturmak için elde edilen vektör alanı çıktısının zaman ortalamalarını hesaplayın ve akış hızlarının histogramlarını hesaplayın (akış gücünü incelemek için) ve belirli bir pikselde zaman içindeki hız değişimini hesaplayın (akış dalgalanmalarını incelemek için).
7. Stentor ikiye bölünmüş ve sitoplazma çevredeki tampona gözle görülür şekilde sızmış görüntü dizileri için, ortalama akış hızını hücre dışı sitoplazma kabarcığının tabanının kesit alanı ile çarparak hücre gövdesine toplam sitoplazma akışını hesaplayın.

Sonuçlar

Yukarıda açıklanan protokoller kullanılarak, Stentor'un sitoplazmasının hem kesimden önce hem de sonra oldukça dinamik olduğu bulundu. Video 1, kesilmemiş hücrelerde bulunan geniş sitoplazma akışını göstermektedir. Stentor'un kesmeden sağ çıkma yeteneğinin sitoplazmanın sertleşmesini veya jelleşmesini içereceğine dair orijinal beklentimize rağmen, aslında Stentor hücreleri sitoplazmayı hücreden dışarı çekmek için yeterli şiddetle kesildiğinde, sitoplazma oldukça dinamik kalır ve yüksek düzeyde yönlendirilmiş bir şekilde hücreye geri akmayı başarır (Video 2).

Yara iyileşmesi sırasında daha önce şüphelenilmeyen bir sitoplazmik hareket derecesini göstermenin yanı sıra, tahlildeki görüntülemenin yüksek çözünürlüğü, parçacık görüntü hızı kullanılarak akış hızlarını ölçmek için kullanılabilir. Bu tür ölçümlerin yapılabilmesi, kimyasal inhibitörlerin etkisinin titizlikle test edilmesini sağlayacaktır.

Şekil 1. Canlı bir Stentor hücresinin morfolojisi. Prosedür 1.3'te tarif edildiği gibi Chlamydomonas ile beslenen canlı bir Stentor hücresinin, gıda vakuollerinin içinde yeşil malzeme olarak görülebilen karanlık alan görüntüsü. Hücrenin yemek yediği oral aparat, görüntünün üst kısmında bir kirpik kenarı olarak görülebilir. Resmi daha büyük görmek için buraya tıklayın.

Şekil 2. Ameliyat için cam iğne hazırlanması. (A) İğne, sağlam bir cam çubuğun ucundan çekilir. (B) Ameliyat için gerekli uzunluk ve keskinliği gösteren iğne ucunun yüksek büyütme görünümü. Resmi daha büyük görmek için buraya tıklayın.

Şekil 3. Mikrocerrahi için özel lamel tutucu. Optimal görüntüleme koşullarına izin verirken ameliyat için açık erişime izin vermek için, hücreler kalın bir sınıf slaytı yerine bir lamel üzerine monte edilir. Lamelin mikroskop tablasına sığmasını sağlamak için, bir 3D yazıcı kullanılarak plastik bir tutucu üretilebilir. Tutucu, standart bir mikroskop lamı ile aynı boyutlara sahipken, ortadaki çöküntü lamel boyutlarıyla eşleşir. Bir köşedeki bir delik, lamellerin tutucudan dışarı fırlamasına izin verir. Resmi daha büyük görmek için buraya tıklayın.

Şekil 4. Çift katlı mikroskop konfigürasyonu. Ters çevrilmiş bir mikroskobun mercek kafasının üzerine bir diseksiyon mikroskobu kafası monte edilmiştir. Laboratuvar bandı, deney tamamlandığında cihazın hızlı bir şekilde monte edilmesini ve sökülmesini sağlar. Resmi daha büyük görmek için buraya tıklayın.

Video 1. Canlı Stentor hücresinde gözlenen sitoplazmik akış örneği. Karanlık alan optiği ile 2 kare/sn hızında 10X objektif ile hücre görüntüsü.

Video 2. Bir Stentor hücresini cam iğne ile kesilip parçalanırken büyüyorum. Kesildikten sonra önemli miktarda sitoplazma ana hücre gövdesinden çekilir, ancak hızla hücreye geri akar.

Tartışma

Bu yöntemin en önemli uygulaması, Stentor'da yara iyileşmesi sırasında sitoplazmik akışı düzenleyen moleküler yolakların belirlenmesinde kullanılması olacaktır. Motor proteinlerinin yanı sıra hücre iskeletinin bileşenlerini de hedef alan çok çeşitli kimyasal inhibitörler mevcuttur. Kalsiyum sinyali inhibitörleri de muhtemel adaylar olacaktır. Stres altında hücreden salınımı tetiklenen mavi pigment Stentorin'i içeren pigment granüllerini (ekstrozomlar) çıkarmak veya azaltmak ve Stentorin'in ekzositotik salınımının yakındaki sitoplazmanın akışını nasıl etkileyebileceğini sormak da ilgi çekici olacaktır. Pigment, kesmeden hemen önce yapılabilecek basit bir ağartma işlemi¹⁵ kullanılarak tükenebilir. Hücrelerin birer birer kesilmesi ve görüntülenmesi gerektiğinden, yara iyileşme testini paralel bir şekilde gerçekleştirmenin basit bir yolu yok gibi görünmektedir. Böylece, tek bir mikroskop kullanarak, hücreler üzerinde kabaca 0,5 saatte 1 oranında işlem yapmak ve ölçmek mümkün olacaktır, böylece tek bir çalışma günü boyunca, süreç üzerinde istatistiksel olarak anlamlı bir etkiye sahip olup olmadığını belirlemek için tek bir bileşik için yeterli veri noktası elde etmek mümkün olacaktır. Yöntem bu nedenle hiçbir şekilde yüksek verim olmasa da, dikkatlice seçilmiş birkaç hedef yola özgü seçilmiş bir dizi aday bileşiği taramak kesinlikle mümkün olacaktır.

Mevcut yaklaşımın önemli bir sınırlaması, çift katlı mikroskobun montajı için nispeten kaba bir yöntemdir. Görüntüleme için kullanılan ters çevrilmiş mikroskobun, diğer çalışanların başka amaçlar için kullanması gereken genel kullanımlı bir araç olduğunu varsayarsak, önemli bir husus, aparatın sökülüp yeniden monte edilebilme kolaylığıdır. Laboratuvar bandı kullanan mevcut yöntem gerçekten hızlı ve kolay bir şekilde sökülebilse de, her seferinde montaj sırasında kullanıcı tarafından dikkatli bir şekilde hizalanmasını gerektirir. Bu nedenle önemli bir değişiklik, ters çevrilmiş dürbünün göz merceği kafası ve diseksiyon dürbününün gövdesi için yuvalara sahip özelleştirilmiş bir çıkarılabilir tutucu oluşturmak olacaktır. Bunun modern 3D yazıcı teknolojisi kullanılarak üretilmesi kolay olmalıdır.

Yaklaşımın ikinci bir sınırlaması, akış belirteçleri olarak hücre içi organellerin DIC görüntülemesine güvenilmesidir. Mikroskopta gözlenen bu organellerin kimliği şu anda bilinmediğinden, boyutlarını veya diğer hücresel bileşenlerle potansiyel etkileşimlerini bilmek mümkün değildir. Bu nedenle, floresan boncuklar gibi dışsal izleyicileri enjekte etmek ve bunları akışı izlemek için kullanmak avantajlı olabilir. Ancak bu, deney yapılmadan önce fazladan bir adım - mikroenjeksiyon - gerektirecek ve böylece tahlili daha da yavaşlatacaktır.

Son önemli sınırlama, veri toplama için tek bir görüntü düzlemine güvenmektir. Bu testin birincil önemi, sadece bir yaranın iyileşip iyileşmediğini sormanın ötesine geçmesi ve akış modelinin ayrıntılı analizinin elde edilmesine izin vermesidir. Bu bakımdan görüntülemenin üç boyutlu görüntülemeye genişletilmesi son derece önemli olacaktır. Mevcut yöntem tek bir odak düzlemini görüntüler ve bu nedenle PIV analizi yapıldığında sonuç, tam üç boyutlu akış alanı boyunca bir dilimdir. Bu bilgilendirici ama eksik. Her zaman adımında 3 boyutlu görüntüler elde ederek, tamamen üç boyutlu bir akış alanı elde etmek mümkün olmalıdır. Bu, sitoplazmanın yara bölgesinin hemen yakınında tam olarak nasıl hareket ettiğini gözlemlemek için özellikle kritik olacaktır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Stentor coeruleus canlı kültür	Carolina Biyolojik	131598
Metil Selüloz, 1.500 cP	Sigma	M0387
EKİPMAN :
Malzeme Adı	Firma	Katalog Numarası
Yumuşak cam karıştırma çubuğu 5 inç uzunluğunda	Fisher Scientific	11-380A
Kültür Kabı 4.5 in 250 ml  cam	Carolina Biological	741004
IX81 ters mikroskop	Olympus
Axiovert 200M ters mikroskop	Zeiss
Stemi 2000 Stereo Mikroskop	Zeiss
Evolve 512 x 512 EMCCD kamera	Fotometri
Planı Apo 20X objektif	Olympus	UPLSAPO