Method Article

Sistematik Analizi In Vitro Hücre Rolling

DOI:

10.3791/50866

⸱

October 16th, 2013

 ,  ,  ,  , 
1Division of Biomedical Engineering, Department of Medicine, Brigham and Women's Hospital, 2Center for Regenerative Therapeutics, Brigham and Women's Hospital, 3Harvard Medical School, Harvard University, 4Harvard Stem Cell Institute, Harvard University, 5Harvard-MIT Division of Health Sciences and Technology, 6Department of Mechanical Engineering, Massachusetts Institute of Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, önemli fizyolojik olarak ilgili kesme akımı altında, hücre haddeleme çalışmalar artırıp, çok oyuklu bir plaka mikroakışkan sistemi kullanılır. Silsilesini ve hastalarda hücre ekzojen popülasyonlarının sistemik olarak uygulanmasını takiben hücre hedeflemesi önemini homing çok adımlı, hücre haddeleme önemi göz önüne alındığında, bu sistem, hücre bazlı tedaviyi geliştirmek için bir tarama platform olarak potansiyel sunmaktadır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre bazlı tedavisi için önemli bir sorun, sistemik damar içine veya intra-arteryel infüzyonla, aşağıdaki ilgi dokularına yüksek verim ile yaşayabilir hücrelerin büyük bir miktarda hedef yetersizliğidir. Sonuç olarak, hücre homing artan anda hücre tedavisini geliştirmek için bir strateji olarak incelenmiştir. Vasküler endotel yuvarlanan hücre hücre hedeflemesi sürecinde önemli bir adımdır ve bir paralel plaka akış odası (PPFC) kullanılarak in-vitro olarak tanınacak. Ancak bu zayıf kontrol edilen akış koşulları, son derece can sıkıcı, düşük akış tahlilidir. Bunun yerine, tam olarak kontrol edilen, fizyolojik olarak ilgili kesme akışı altında 1,2 daha yüksek bir verim içinde hücresel yuvarlanma özellikleri çalışma sağlayan bir çok oyuklu bir plaka mikroakışkan sistemi kullanılır. Bu yazıda, P-ve E-selectin kaplı yüzeylerde hem de hücre tek-kaplı yüzeylerde HL-60 (insan promiyelositik lösemi) hücrelerinin yuvarlanma özelliklerini readil olabilir göstermeky incelenmiştir. Daha iltihaplı koşulların simüle edilmesi için, mikroakışkan kanal yüzeyi daha sonra önemli ölçüde dinamik koşullar altında HL-60 hücreleri ile etkileşimleri, artan tümör nekroz faktörü-α (TNF-α) ile aktive edilmiş endotel hücreleri (EC) ile kaplandı. Geliştirilmiş verimlilik ve bu hızları haddeleme ve yolunu haddeleme gibi parametrelerin hızlı analizi izin verir entegre çoklu parametre yazılımı analizi platformu, in-vitro hücre haddeleme özelliklerini değerlendirmek için önemli bir avantaj oluşturmaktadır. Hücre haddeleme ve homing darbe için tasarlanmış mühendislik yaklaşımları, hızlı ve doğru analiz sağlayan, bu platform önceden eksojen hücre tabanlı tedavi yardımcı olabilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre tabanlı tedavinin başarılı klinik çeviride önemli zorluklardan biri verimsiz dağıtım veya arzu sitelere 3,4 sistemik aşılanmış hücrelerin hedef olduğunu. Sonuç olarak, hücre homing geliştirmek için yaklaşımlar için bir arayışlar sürmektedir, ve özellikle de, hücre terapisi geliştirmek için bir strateji olarak, haddeleme hücre. Kan damarları üzerinde yuvarlanan Cep klasik hastalık sitelerine 5 alınsın lökositler için tanımlanan hücre homing kaskad, önemli bir adımdır. Bu adım, endotel selektinler arasındaki spesifik etkileşimlere tarafından yönetilir örneğin, P-selektin ve E-(P-ve E-sel) ve lökositlerin 5,6 yüzeyinde kontra ligandları. Daha iyi anlaşılması ve hücre hedeflemesi geliştirilmiş verimlilik ve özellikle haddeleme adım, hücre tabanlı tedavi geliştirmek için yeni platformlar için arayış içinde büyük önem taşımaktadır. Bugüne kadar bu iki düz plat oluşan, paralel plaka akış odaları (PPFCs) kullanılarak elde edilmiştirBir hücre süspansiyonu bir şırınga 7,8, 9, pompa kullanılarak perfüze, üzerinden, üst plaka üzerinde yer alan bir giriş ve çıkış bağlantı noktası ile aralarında bir conta ile es. Taban levhasının yüzeyi bir ilgili hücre tek tabaka / alt-tabakalar kaplanabilir ve kesme akımı altında perfüze hücreleri ve yüzey arasındaki etkileşimi, daha sonra 7 araştırılmıştır. Ancak, PPFC kabarcık oluşumu, sızıntı ve büyük sakıncalar sergilemesi kötü kontrollü akışı ile düşük verim, reaktif tüketim, ve oldukça sıkıcı bir yöntemdir.

Geleneksel PPFC için alternatif bir teknik, düşük reaktif tüketimi 1,10 ile, doğru, bilgisayar kontrollü kesme akımı altında hücresel tahlillerde daha yüksek verim performansı (PPFCs en fazla 10 kat daha yüksek) izin, bir çok-yuvalı plaka mikroakışkan sistemidir. Hücre deneyleri haddeleme USI hücre mono tabakaları veya oluşturulmuş bir alt-tabakalar ile kaplanır ve görüntülü edilebilir, mikroakışkan kanal içinde yapılmaktadırng haddeleme özelliklere sahip bir mikroskop, hali hazırda, uygun bir yazılım kullanılarak analiz edildi. Bu çalışmada, insan promiyelositik lösemi farklı yüzeylerde (HL-60) hücreleri yuvarlanma özelliklerini inceleyerek bu çok-çukurlu plaka mikroakışkan sisteminin yeteneklerini gösterir. HL-60 P-ve E-sel, hem de farklı haddeleme reseptörleri ifade eden hücre tekli katmanları üzerinde, analiz edilmiştir gibi alt-tabakalar üzerinde yuvarlanan. Buna ek olarak, antikor (Ab), bu yüzeyler üzerinde HL-60 yuvarlanma hareketine aracılık özel selektinler doğrudan katılımını göstermek için kullanılmıştır engelleme. Yuvarlanan deneyleri, hız haddeleme, haddeleme hücre sayısı ve haddeleme yolu özellikleri gibi kilit dönme parametrelerini etkin analizi sağlayan, minimal reaktif / hücre tüketimi, kararlı kesme akışı altında, yüksek verim ile yapılmıştır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1.. Hücre Kültürü

  1. Insan promiyelositik lösemi (HL-60) hücreleri
    1. 75 cm kültür HL-60 hücreleri,% 20 (v / v) cenin sığır serumu (FBS),% 1 (v / v), L-glutamin ve 1 ile takviye edilmiş Iscove Modifiye Dulbecco ortamı (IMDM), 15 ml 2 şişe % (v / v) penisilin-streptomisin.
    2. Hücre süspansiyonu hacminin yarısı aspirasyon ve tam IMDM ortamı ile değiştirilmesiyle her 3 günde bir ortam kullanın.
    3. Carboxyfluorescein diasetat için, süksinimidil ester (CFSE) boyama, santrifüj HL-60 hücre süspansiyonu (400 x g, 5 dakika), 1 uM CFSE çözelti içinde tekrar süspansiyon (önceden ısıtılmış PBS içinde hazırlandı) ve 37 ° C'de 15 dakika boyunca inkübe Daha sonra, 30 dakika için önceden ısıtılmış taze ortam içinde hücreler, santrifüj, aspirat supernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri. PBS içinde hücreleri yıkayın ve daha sonra (P-sel kaplı yüzey üzerine CFSE boyanmış HL-60 hücreleri için temsili görüntüsü Şekil 1B'ye bakınız) haddeleme deneyler için kullanın.

Not: CFSE boyama isteğe bağlıdır, ve mikroakışkan kanalda haddeleme fenomen göstermek için burada sunulmuştur. Bu yazıda sunulan haddeleme parametrelerinin analizi standart aydınlık görüntüleme kullanarak boyanmamış hücreler üzerinde yapıldı.

  1. Akciğer mikrovasküler endotelyal hücreler (LMVECs)
    1. Coat 100 mm Petri% 0.1 jelatin çözeltisi (PBS içerisinde v / v) ile yemekleri ve en az 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
    2. Tam endotelyal büyüme ortamı içinde jelatin kaplı 100 mm petri çanakları üzerine kültür LMVECs (endotelyal bazal ortamı-2 (EBM-2)), spesifik bir büyüme takviyesi kiti ile takviye edilmiş) REAJANLAR bkz. Medya% 80-90 ulaşan üzerine her gün ve alt-kültür hücreleri değiştirmek.
    3. Alt-kültürü için, hücreler, PBS ile yıkayın ve daha sonra ayırma hücreleri 1 x tripsin-EDTA 4 ml ile 3 dakika boyunca 37 ° C'de ve tam EBM-2 ortamının bir eşit hacmi içinde nötralize eder. Bir 15 ml tüp ve centrifug hücre süspansiyonu aktarıne (400 xg, 5 dk). Santrifüj sonrasında, tam endotelyal ortam 1 ml pelet tekrar süspansiyon ve bir hemasitometre ile hücre sayımı. Bu tüm deneyler için geçiş 7 altında yalnızca hücre morfoloji ve fonksiyon kullanımını etkilediği gibi, değil over-geçit hücreleri.
  1. Çin Hamsteri Yumurtalık-P-selektin (CHO-P) Hücreler
    1. Şekilde insan P-sel ifade transfekte CHO hücreleri olan CHO-P hücreleri, işbirlikçiler (Beth Israel Deaconess Tıp Merkezi, Harvard Tıp Okulu) 11,12 tarafından sağlandı.
    2. F-12 ortamı içinde 25 ml T175 cm kültür CHO-P hücreleri 2 şişe hazırlanmıştır.
    3. Geçirilmesi için, 4-5 saniye boyunca, 10 ml PBS ile yıkayın ve daha sonra hücreler, tam ortam içinde nötralize ardından 37 ° C'de 3 dakika boyunca 1 x tripsin-EDTA, 10 ml trypsinize.
    4. Santrifüj hücre süspansiyonu (400 x g, 5 dakika), dikkatli bir şekilde, süpernatan aspire tam ortam içinde 1 ml hücre pelletini ile hücre sayımıBir hemositometre.

2. Entegre Multi-iyi Plate mikroakışkan Sisteminin İşletilmesi

  1. Tüm ekipman düzgün bağlandığından emin olun ve farklı modülleri açmak: bilgisayar, kontrolör, ters mikroskop ve CCD kamera.
  2. Görüntüleme yazılımı açın, çoklu-plaka modülü ve görüntüleme modülü düzgün ekranda sunulmaktadır emin olun.
  3. (Denetleyiciye bağlı) buhar tuzak tüpleri bağlamak ve aynı zamanda onları Basınç Arayüzüne bağlanamıyorum.
  4. Plaka ısıtıcı / adaptörü, çok oyuklu plaka koyun. Oyuklara (aşağıda tarif edilmiştir) reaktiflerin ilave edin ve plaka üstüne arayüzü ekleyin. Otomatik sahnede görüntüleme için plaka koyun.
  5. Arayüz plakanın üstüne eklenir ve çok-yuvalı plaka kullanılarak kolaylıkla kontrol tarafından belirlenen akış hızında mikroakışkan kanallardan sıvı, sürücü, kuyu üstüne denetleyicisinden bir pnömatik basınç uygularManuel modu altında modül ekranı.
  6. Çukurlara arasında yer alan bir gözlem alanı genelinde kanal akışında Reaktifler. Mikroakışkan kanal boyutları 70 mikron boyunda 350 mm genişliğinde x vardır. Doğrusal kanalın uzunluğu 1 mm ve kanalların alt aydınlık faz, floresans ve konfokal mikroskopi ile uyumlu olan bir 180 mikron cam lamel içerir.
  7. Bir CCD kamera (stream edinimi, 11 kare / sn) kullanarak video Edinme ve uyumlu yazılım aracılığıyla analiz.

3. Bir protein alt-tabakasına ya da bir tekli hücre katmanı ile mikroakışkan Kanallarının Kaplama

  1. Fibronektin ya da P-/E-selectin ile mikroakışkan kanal kaplama
    1. PBS içinde 20 ug / ml fibronektin çözeltisi 1 ml hazırlayın. Kaplanacak kanal sayısı (kanal başına fibronektinin 25-50 ul kullanım) göre ses değiştirin.
    2. De her bir girişine fibronektin çözeltisi 25-50 ul ekleyin. 2 dyn / cm 2 kesme kuvveti uygulayın5 dakika kanalı serpmek için. Sıvı iyi çıkışında görünen boncuk unutmayınız. Oda sıcaklığında 30-45 dakika inkübe
    3. Kuyulardan çözümü (kanalı besleyen orta daire doğrudan aspire etmeyin) 1,13 aspire. Çıkış kuyuya 200-500 ul PBS ilave edin ve 5 dakika boyunca 2 din / cm 2 makaslama akışı uygulayarak PBS ile kanal yıkayın. Kanal artık düzgün fibronektin ve kullanıma hazır ile kaplanmıştır.
    4. Yüzey kaplama izin vermek için 37 ° C'de 1 saat inkübasyona bırakıldı ile, yukarıda tarif edildiği gibi P-veya E-sel, PBS içinde arzu edilen insan rekombinant protein, 5 mg / ml çözelti hazırlamak ve kat kat kanalları için.
  2. Mikroakışkan kanal içinde CHO-P ya da LMVEC tek tabaka oluşturulması
    1. Yavaşça tam ortam ve santrifüj 2 kat bir hacmi (400 x g, 5 dakika) ile söndürülmesi, 3 dakika boyunca kültür kaplarından Hücreleri tripsinize edin. Tam medya ve santrifüj 10 ml (400 x g'de 5 dakika) ile süspanse edin hücreleri Again.
    2. Süspansiyon içinde hücre konsantrasyonunu saptamak için hücre sayımı. , Kanal içinde bir konfluent tek tabaka LMVEC oluşumunu sağlamak 15-20000000 hücre / ml hücre konsantrasyonunu getirmek için. Konfluent CHO-P hücre tek tabaka için, 50-60000000 hücre / ml kullanmak. Her bir kanal için hücre süspansiyonu 25-50 ul kullanma - göre deney için kullanılan ilk hücre sayısı belirler.
    3. De girişine uygun bir konsantrasyonda hücre süspansiyonu 25-50 ul ekleyin. Mikroskop sahnede plakayı ve hücreler tüm dolum kanallar ekranda görülür ve daha sonra akışını durdurmak kadar kanalı (2 dyn / cm 2) içine hücreleri tanıtmak.
    4. Tam LMVEC veya CHO ortamı ya da 200 ul ile çıkış ve giriş hem de doldurun. Hücreler yerleşmek olsun ve kuluçka makinesi içinde 3 saat için bağlı (37 ° C,% 5 CO2).
    5. 3 saat inkübasyondan sonra, bağlı olmayan kaldırmak için tam ortam (2 dyn / cm 2, 10-15 dakika) ile kanal yıkayınhücreleri. Hücreler artık tamamen birleşen görünmelidir ve kanal artık kullanıma hazırdır. Başlangıç ​​hücre yoğunluğuna bağlı olarak, bir zaman yerleşen ek 2-3 saat hücreler ile yüzeyin tam kapsama sağlamak için gerekli olabilir.

4. LMVEC Pro-inflamatuar Aktivasyon ve P-/E-selectin antikor tarafından bloke edilmesi

  1. LMVEC bazal ortam maddesi içinde bir TNF-α çözeltisi (10 ng / ml) hazırlayın.
  2. , Kanallarda LMVEC inflamatuar aktivasyonuna sebep de girişine TNF-α çözeltisi 100 ul ilave edin ve 5 dakika boyunca 2 din / cm 2 makaslama akışı uygulayarak kanalın içine çözelti tanıtmak. Kontrol kanalları için (etkisizleştirilmiş EC), girişine LMVEC bazal ortam, 100 ul de ekleyin ve kanalı (5 dakika boyunca 2 dyn / cm 2) haline getirmektedir. Kanal artık bir yuvarlanma deneyi için hazır.
  3. P-sel ve LMVECs ve CHO-P hücrelerinde E-sel engellemek için, P-sel (klon AK4, ba 5 ug / ml nötralize tanıtmaksal ortamı) ya da E-sel (klon P2H3, bazal ortam maddesi içinde 5 ug / ml) antikor kanal içine ve 37 ° C'de 1 saat boyunca inkübe Daha sonra, (5 dakika boyunca 2 dyn / cm 2) bazal ortam ile kanal yıkayın. Kanallar artık yuvarlanan bir tahlil için hazırız.

5. Yüzey / Cep tabakalı-Kaplamalı mikroakışkan Kanallar HL-60 Rolling Deneyi

  1. Dikkatle kanal uygun bir şekilde (hücreler ile kaplama durumunda, tam olarak tek katlı bir birleşik hücre dikkate alınmalıdır) kaplanmıştır onaylamak için mikroskop altında kanal inceleyin.
  2. Haddeleme deneyler, santrifüj HL-60 hücre süspansiyonu (400 x g, 5 dakika) için HL-60 hücre süspansiyonu hazırlamak ve bazal ortamı ile bir kere yıkayın. 5.000.000 hücre / ml bir HL-60 hücre süspansiyonu elde etmek üzere (Ca 2 + ve Mg2 + ihtiva eden bazal ortam,) IMDM'de tekrar süspansiyon hücreleri ve sayılır. Haddeleme tahlili gerçekleştirmek için, her bir kanal için hücre süspansiyonu 25-50 ul kullanın.
  3. Hücre suspe 25-50 ul eklension mikroskop sahnede sıcaklık kontrollü plaka tutucu (37 ° C) ve yer içinde, iyi bir yerde plaka çıkış için. Daha sonra, (hücre girişine çıkışından akan 10-15 saniye içinde dikkat edilmelidir) 2 din / cm 2 makaslama kuvveti uygulanarak kanala hücreleri tanıtmak.
  4. Makaslama gerilmesinin bir fonksiyonu olarak yuvarlanma tepkisini incelemek için, (5 dyn kadar 0.25 yavaş yavaş kesme artırmak dyn / cm 2 0.25 kesme azaltmak ve istenen her makaslamada ("stream satın alma" fonksiyonunu kullanarak) 20-30 sn video edinmeniz / 2 cm. It) daha yüksek bir makas kullanımı da mümkündür.
  5. Bir CCD kamera (stream edinimi, 11 kare / sn) kullanarak video Edinme ve uyumlu yazılımı ile yollarını haddeleme ve haddeleme hızları analiz.

6. Yüzey moleküllerinin ekspresyonunu tespit etmek için akış sitometrisi

  1. Tripsinizasyon sonra, arzu edilen hücre tipi (HL-60, CHO-(1-2 x 10 5 hücre / örnek kullanarak) bir hücre süspansiyonunun hazırlanmasıPBS içinde ya da P LMVECs) (- / -),% 2 FBS ile takviye edilmiştir. Iki kez hücreleri yıkayın ve 50 ul (aynı tampon kullanarak) örnek hacmi getirmek.
  2. 20 dakika boyunca 4 ° C 'de arzu edilen fluorofor ile konjüge Ab (daha ayrıntılı bilgi için ekli tabloya bakınız) (alüminyum folyo ile kapak) ile her bir örnek inkübe edin.
  3. Iki kez (aynı tamponu) hücreleri yıkanır ve 200 ul hücre süspansiyonu, lekeli son hacim getirir. Yüzey moleküllerinin ekspresyonunu tespit etmek için bir akış sitometrisi kullanılarak örnekleri analiz edin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HL-60 hücreleri, fibronektin üzerinde P-ve E-selektin rulo yüzeyler üzerinde değil,

Bu haddeleme ligandlann P-glikoprotein sel ligand-1 (PSGL-1) ve Sialil-Lewis X (Slex) gibi güdümlü ligand, bir dizi 5,14 (Şekil 1A salgılarlar HL-60 hücreleri, altın standart "olarak silindirler" olarak kabul edilir .) Ile spesifik etkileşimi aracılık tetra-sakarit Slex için bir iskele olarak yüzey protein PSGL-1 eylemler, P-ve E-sel, iltihaplanma 5,6,15 sırasında endotel ü...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eksojen hücre tabanlı tedavi başarılı çevirisinde önemli zorluklardan biri verimli, yüksek verimlilik engraftmınt 3 ile yaralanma ve inflamasyon sitelere hücreleri sunmak için yetersizliğidir. Hücre haddeleme sonunda dokuya 5 içine endotel yoluyla sağlam yapışması ve göçü yol açan, kan damarlarının duvarlarında hücrelerin yavaşlama kolaylaştıran, hücre homing sürecinde kritik bir adım teşkil etmektedir. Aday hücre tipleri için haddeleme işlemi daha iyi anlaşılması hücre homing geliştirmek ve hücre ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan ederim.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CHO-P hücreleri Dr Barbara Furie (Beth Israel Deaconess Tıp Merkezi, Harvard Tıp Okulu) bir tür hediye edildi. Bu çalışma JMK Bu çalışma aynı zamanda JMK bir Movember-Prostat Kanseri Vakfı Yarışması Ödülü tarafından kısmen desteklenen Sağlık hibe HL095722 Ulusal Enstitüsü tarafından desteklenen

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
İnsan Akciğer Mikrovasküler Endotel HücreleriLonzaCC-2527
P-selektin eksprese eden Çin Hamster Yumurtalık Hücreleri (CHO-P)Dr. Barbara Furie'den nazik hediye 11,12< / sup>
HL-60 HücreleriATCCCCL-240
Hücre Kültürü Reaktifleri
Endotelyal Bazal OrtaLonzaCC-3156
EBM-2 MedyaLonzaCC-3156
Endotelyal Bazal Orta TakviyelerLonzaCC-4147
EGM-2 MV SingleQuotsLonzaCC-4147
IMDM - Iscove'un Modifiye Dulbecco'nun Orta 1xGibco12440
F-12 (1x) Besin Karışımı (Jambon)Gibco11765-054
Penisilin Streptomisin (P/S)Gibco15140
L-Glutamin (L/G) 200 mMGibco25030
Fetal Sığır Serumu (FBS)Atlanta BiologicalsSa550
Petri KaplarıBD FalconBD-353003
100 mm Hücre Kültürü Kabı, Doku Kültürü Uygulanmış Polistiren
Santrifüj Tüpleri (15 ml polipropilen konik tüpler)MedSupply PartnersTC1500
T75 ŞişeleriBD Falcon353136
Jelatin Çözeltisi (%2)SigmaG1393
dPBS (kalsiyum klorür ve magnezyum klorür olmadan)SigmaD8537
Tripsin-EDTA Çözeltisi (10x)SigmaT4174
Antikorlar< / güçlü >
Anti-hE-Selectin / CD62ER & D SistemleriBBA21
FITC Konjuge Fare IgG1R& D SistemleriBBA21
Anti-hP-SelectinR& D SistemleriBBA34
FITC Konjuge Fare IgG1R& D SistemleriBBA34
FITC Fare IgG & shy; 1 κ İzotip KontrolüBD Bioscience555748
Anti-SLeX / CD15s Ab, Klon: 5F18Santa CruzSC70545
FITC KonjugeSanta CruzSC70545
Normal Fare IgM-FITC İzotip KontrolüSanta CruzSC2859
PE Fare Anti-İnsan CD162, Klon: KPL-1BD Pharmingen556055
PE Fare IgG1 k İzotip KontrolüBD Pharmingen550617
Anti-P-Selectin Ab (AK4)Santa CruzSC19996
Anti-E-Selectin Ab, Klon P2H3MilliporeMAB2150
Fare IgG1 İzotip KontrolüSanta CruzSC3877
Diğer Reaktifler
Rekombinant İnsan TNF-alfaPeproTech300-01A
Hücre İzi CFSE Hücre Proliferasyon Kiti - Akış SitometrisiInvitrogenC34554
İnsan P-selektin-FC rekombinant proteinR& D Systems137-PS-050
İnsan E-selektin-FC rekombinant proteinR& D Systems724-ES-100
Fibronektin İnsan, Plazmaİnvitrojen33016-015
Equipment
Bioflux 1000Fluxion BiosciencesBioflux Montage, deneyleri çalıştırmak ve verileri
BioFlux 48 kuyulu plakalarFluxion Biosciences
BD Accuri C6 Akışı SitometreBD BioscienceCFlow Plus, deneyleri yürütmek ve verileri analiz etmek için kullanılan yazılımdı
analiz etmek için kullanılan yazılımdı: Nikon Eclipse Ti-S, Nikon CoolSnap HQ2, CCD kamera, Fotometri

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Conant, C. G., et al. Well plate microfluidic system for investigation of dynamic platelet behavior under variable shear loads. Biotechnol. Bioeng. 108, 2978-2987 (2011).
  2. Conant, C. G., Schwartz, M. A., Ionescu-Zanetti, C. Well plate-coupled microfluidic devices designed for facile image-based cell adhesion and transmigration assays. J. Biomol. Screen. 15, 102-106 (2010).
  3. Ankrum, J., Karp, J. M. Mesenchymal stem cell therapy: Two steps forward, one step back. Trends Mol. Med. 16, 203-209 (2010).
  4. Karp, J. M., Leng Teo, G. S. Mesenchymal stem cell homing: the devil is in the details. Cell Stem Cell. 4, 206-216 (2009).
  5. Luster, A. D., Alon, R., von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nat. Immunol. 6, 1182-1190 (2005).
  6. Ley, K. The role of selectins in inflammation and disease. Trends Mol. Med. 9, 263-268 (2003).
  7. Sperandio, M., Pickard, J., Unnikrishnan, S., Acton, S. T., Ley, K. Analysis of leukocyte rolling in vivo and in vitro. Methods Enzymol. 416 (06), 346-371 (2006).
  8. Brown, D. C., Larson, R. S. Improvements to parallel plate flow chambers to reduce reagent and cellular requirements. BMC Immunol. 2, 9(2001).
  9. Lawrence, M. B., McIntire, L. V., Eskin, S. G. Effect of flow on polymorphonuclear leukocyte/endothelial cell adhesion. Blood. 70, 1284-1290 (1987).
  10. Conant, C. G., Schwartz, M. A., Nevill, T., Ionescu-Zanetti, C. Platelet adhesion and aggregation under flow using microfluidic flow cells. J. Vis. Exp. (10), e1644(2009).
  11. Furie, B., Furie, B. C. Role of platelet P-selectin and microparticle PSGL-1 in thrombus formation. Trends Mol. Med. 10, 171-178 (2004).
  12. Tchernychev, B., Furie, B., Furie, B. C. Peritoneal macrophages express both P-selectin and PSGL-1. J. Cell Biol. 163, 1145-1155 (2003).
  13. Conant, C. G., et al. Using well-plate microfluidic devices to conduct shear-based thrombosis assays. J Lab Autom. 16, 148-152 (2011).
  14. Larsen, G. R., et al. P-selectin and E-selectin. Distinct but overlapping leukocyte ligand specificities. J. Biol. Chem. 267, 11104-11110 (1992).
  15. Varki, A. Selectin ligands: will the real ones please stand up. J. Clin. Invest. 100, S31-S35 (1997).
  16. Bohnsack, J. F., Chang, J. Activation of beta 1 integrin fibronectin receptors on HL60 cells after granulocytic differentiation. Blood. 83, 543-552 (1994).
  17. Lawrence, M. B., Kansas, G. S., Kunkel, E. J., Ley, K. Threshold levels of fluid shear promote leukocyte adhesion through selectins (CD62L,P,E). J. Cell Biol. 136, 717-727 (1997).
  18. Moore, K. L., et al. P-selectin glycoprotein ligand-1 mediates rolling of human neutrophils on P-selectin. J. Cell Biol. 128, 661-671 (1995).
  19. Lawrence, M. B., Springer, T. A. Neutrophils roll on E-selectin. J Immunol. 151, 6338-6346 (1993).
  20. Yao, L., et al. Divergent inducible expression of P-selectin and E-selectin in mice and primates. Blood. 94, 3820-3828 (1999).
  21. Sackstein, R. Glycoengineering of HCELL, the human bone marrow homing receptor: sweetly programming cell migration. Ann. Biomed. Eng. 40, 766-776 (2012).
  22. Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. Analysis of physiologic E-selectin-mediated leukocyte rolling on microvascular endothelium. J. Vis. Exp. , e1009(2009).
  23. Muller, W. A., Luscinskas, F. W. Assays of transendothelial migration in vitro. Methods Enzymol. 443, 155-176 (2008).
  24. Bakker, D. P., vander Plaats, A., Verkerke, G. J., Busscher, H. J., vander Mei, H. C. Comparison of velocity profiles for different flow chamber designs used in studies of microbial adhesion to surfaces. Appl. Environ. Microbiol. 69, 6280-6287 (2003).
  25. Benoit, M. R., Conant, C. G., Ionescu-Zanetti, C., Schwartz, M., Matin, A. New device for high-throughput viability screening of flow biofilms. Appl. Environ. Microbiol. 76, 4136-4142 (2010).
  26. Varki, A. Selectin ligands. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 7390-7397 (1994).
  27. Ramos, C. L., et al. Direct demonstration of P-selectin- and VCAM-1-dependent mononuclear cell rolling in early atherosclerotic lesions of apolipoprotein E-deficient mice. Circ. Res. 84, 1237-1244 (1999).
  28. Yago, T., et al. Core 1-derived O-glycans are essential E-selectin ligands on neutrophils. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, (2010).
  29. Yago, T., et al. E-selectin engages PSGL-1 and CD44 through a common signaling pathway to induce integrin alphaLbeta2-mediated slow leukocyte rolling. Blood. 116, 485-494 (2010).
  30. Simone, G., et al. Cell rolling and adhesion on surfaces in shear flow. A model for an antibody-based microfluidic screening system. Microelectronic Eng. 98, 668-671 (2012).
  31. Perozziello, G., et al. Microfluidic devices modulate tumor cell line susceptibility to NK cell recognition. Small. 8, 2886-2894 (2012).
  32. Perozziello, G., et al. Microfluidic biofunctionalisation protocols to form multivalent interactions for cell rolling and phenotype modification investigations. Electrophoresis. , (2013).
  33. Simone, G., et al. A facile in situ microfluidic method for creating multivalent surfaces: toward functional glycomics. Lab Chip. 12, 1500-1507 (2012).
  34. Sarkar, D., et al. Engineered cell homing. Blood. 118, e184-e191 (2011).
  35. Cheng, Z., et al. Targeted Migration of Mesenchymal Stem Cells Modified With CXCR4 Gene to Infarcted Myocardium Improves Cardiac Performance. Mol. Ther. 16, 571-579 (2008).
  36. Enoki, C., et al. Enhanced mesenchymal cell engraftment by IGF-1 improves left ventricular function in rats undergoing myocardial infarction. Int. J. Cardiol. 138, 9-18 (2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cell RollingMicrofluidic SystemHL 60 CellsP SelectinE SelectinTNF AlphaEndothelial CellsShear FlowRolling VelocityParallel Plate Flow Chamber

Related Articles