Ekstraksiyon ve İnsan ve Maymun Saç gelen Kortizol Analizi

Özet

Kortizol (CORT) insanlarda ve primatlarda artan saç gövdesine birikir. Biz yüksek hassasiyet ve duyarlılığı ile saç Cort çıkarma ve analiz yöntemleri açıklanmaktadır. Saç CORT ölçülmesi özellikle aya haftalık dönemler boyunca kronik stres değerlendirmek için çok uygundur.

Özet

Stres hormonu kortizol (CORT) yavaş yavaş insanlarda, insan olmayan primatlar ve diğer memeliler artan saç gövdesine dahil edilir. Biz, geliştirilmiş ve geçerli al yanaklı maymun saçtan CORT ekstraksiyonu ve analizi için bir yöntem ve daha sonra insan derisi saç ile kullanılmak için bu yöntemi uyarlanmıştır. Plazma veya tükürük elde CORT "nokta örneklerinin" aksine, saç CORT hormon esas döneminde, bir hipotalamus-hipofiz-adrenal (HPA) sistem etkinliğinin entegre ölçü ve böylece fizyolojik stres sağlar. Insan saç derisi 1 cm / ay ortalama bir hızda büyür, çünkü, saç kesimleri elde CORT seviyeleri uzunluğu birkaç cm potansiyel ay bir dizi üzerinde yaşanan stres bir biyolojik belirteç olarak hizmet verebilir.

Bizim bir yöntemde, her bir saç örnek ilk ter veya terden de tevdi edilmiştir saç gövdesinin dışından herhangi bir Cort çıkarmak için izopropanol içinde iki kere yıkanmıştır. Kurutma işleminden sonra,örnek kıl protein matrisi parçalamak ve çıkarılması için yüzey alanını arttırmak için ince bir toz halinde öğütülür. Saç gövdesinin iç kısmından CORT metanol içine ekstrakte edildi, metanol buharlaştırıldı, ve ekstre deney tamponu içinde yeniden edilir. Çıkarılan CORT, standartlar ve kalite kontrol ile birlikte, o zaman duyarlı ve spesifik bir ticari olarak temin edilebilen bir enzim immunoassay (EIA) kiti vasıtasıyla analiz edilir. EIA okuma mg toz saç ağırlığı başına pg CORT dönüştürülür. Bu yöntem, insanlarda saç Cort analiz laboratuvarımızda kullanılmakta olan, makak maymunları, marmosets, köpekler, ve kutup ayıları birkaç tür. Laboratuvardan ve diğer araştırma grupları hem de birçok çalışma doğal kronik stres maruziyeti değerlendirmek yanı sıra laboratuar ayarları için saç CORT geniş uygulanabilirliğini göstermiştir.

Giriş

Plazma, tükürük, idrar ya da zaman zaman ya da dışkılar in CORT ölçümü stres ¹ HPA ekseninin rolünün Selye keşfi tarihi, fizyolojik stres göstergesi olarak kullanılmıştır. Çok sayıda kağıtları akut stresli durumlarla HPA aktivitesini ilgili yayınlanmış olmasına rağmen, alan kronik fizyolojik stres basit ve güvenilir bir indeks eksikliği engel olmuştur. Bu sorun ortaya çıkar sirkadiyen varyasyon tabidir ve çevresel bozukluklar tarafından eleştirilmiştir olabilir HPA aktivitesinin plazma ve tükürük verim hem de "nokta" tahminleri çünkü. İdrar ve dışkı örnekleri bazı durumlarda tam bir gün kadar sonrası bir dizi yayılma CORT ve / veya metabolit boşaltım ölçümleri elde edildi. Ancak bu yaklaşımların hiçbiri HPA aktivite gerçekten, uzun vadeli bir dizin ve bu sy yanıt sağlar, bu matrisler her zaman CORT seviyeleri kaba bir bileşik dizini sağlayabilir kullanarak birden fazla örneklerinin toplanmasıKronik stres kaynaklanıyor.

Saç Cort Ölçme stres literatürde bu önemli ihtiyacı doldurmak başladı. Birkaç laboratuvarlar tarafından yapılan ilk çalışmalar, insan saç CORT varlığını gösterdi ama saç CORT seviyeleri stres ² bir fonksiyonu olarak değiştirilmiş olup olmadığını araştırmak değildi. Bizim laboratuvar çeşitli sosyal ve davranışsal faktörler ³ ile al yanaklı maymun HPA ekseninin düzenlenmesinde yıllardır ilgi olmuştur, biz al yanaklı maymun saç ⁴ çıkarılması ve analizi için yöntemler kurmak ve doğrulamak için yola çıktı. Kan kaynaklı CORT yavaş yavaş ve sürekli olarak artan saç içine dahil edilen öncül göre, bu yeni yöntemin amacı aya haftalık dönemler boyunca HPA aktivitesinin bir göstergesi olarak entegre bir saç türetilmiş CORT seviyelerini kullanmaktı.

Çeşitli metodolojik zorluklar mevcut protokolünü gelişmekte rastlanmıştır. İlk olarak, önceki çalışmalarda bu küçük miktarlar o göstermiştif ter ve sebum atılır Cort dolaşan ve bu nedenle kat saç milinin ² dışında olabilir. Bu potansiyel şaşırtmak ortadan kaldırmak için, biz büyüyen saç şaft içinde mevcut CORT üzerinde minimal bir etkiye sahip ise dış Cort kaldırmak için görünen hafif bir yıkama prosedürü geliştirmiştir. Bu durumda, bu prosedürün (izopropanol yani iki adet 3-dakikalık yıkama) tâbi maymun saç toplam saç CORT içeriğinin yaklaşık olarak% 7-8 kayıp, ve üçüncü bir yıkama örnek ⁴ en az% 1 daha fazla steroid kaldırıldı. Aynı prosedür (yayınlanmamış K. Rosenberg ve J. Meyer) örneklerinde% 27, toplam CORT içeriğinin ortalama kaldırıldı yana, insan saçı daha fazla dış CORT var gibi görünüyor. Maymun saç gibi, ancak ek bir yıkama ilk iki yıkamadan çok daha az Cort (yaklaşık% 7) ihtiva etmiştir. Bu nedenle, Maymun ve insan saç hem de sonuçları büyük bir frac muhafaza ederken en (hepsi değilse), dış CORT kaldırılabilir iddiasını destekleyenDahili saç matris içinde CORT of tion. İkinci olarak, pilot çalışmalar da göstermiştir ki, muhtemelen saç gövdesinin kompleks matris proteinli açık kırma hem de çözücü olarak nüfuz etmesi için mevcut olan yüzey alanını arttırarak, numuneden önemli ölçüde artmıştır CORT kurtarma ekstraksiyon için saç önceden öğütme. İki farklı öğütme yöntemleri, avantajları ve dezavantajları ile her geliştirilmiştir. Bir top değirmen kullanarak Yöntem 1, en iyi toz üretme avantajına sahiptir. Ancak, bilyalı değirmen nispeten pahalı bir ekipman öğedir ve standart taşlama kavanoz ve topları ile kullanıldığında, bir defada sadece iki numune öğütme kapasitesine sahiptir. Küçük numuneler aynı zamanda standart öğütme kavanoz bir bilyalı değirmen kullanılarak işlenmesi zordur. Bir beadbeater kullanır Yöntem 2, kendi öğütme yeteneği daha az etkilidir. Sonuç olarak, ortalama iyileşme CORT bilyalı değirmen (yayınlanmamış veriler) ile karşılaştırıldığında, bu metodun kullanımı ile yaklaşık% 10 daha düşüktür. Öte yandan, bir beadbeaterönemli ölçüde daha az pahalı bir bilyalı değirmen daha 16-24 örnekleri bir kez modele bağlı olarak öğütülebilir ve yöntem, küçük örnekler için uygundur. Çünkü yukarıda bahsedilen ayırıcı toparlanma, belirli bir çalışma içinde, bütün numuneler için aynı öğütme yöntemi kullanmak tavsiye edilir.

Saç örneklerinde işlendikten sonra, bu başlangıçta tükürük Cort ölçmek için tasarlanmış bir hassas ve özel ticari EIA kiti vasıtasıyla analiz edilir ekstrelerinde metanol ve CORT ile ekstre edilmiştir. Ekstraksiyon ve tahlil prosedürleri maymun saç örneklerinden özleri seri seyreltileri yakın özgün CORT standartları elde edilen okuma paralel EIA okumaları elde gösteren kısmen doğrulanmıştır. Daha sonra (plazma ve tükürük CORT ek olarak) saç CORT yeni konut çeyrek ^4,5 üzere maymunların bir idari zorunlu yer değiştirme büyük yaşam stres duyarlı olduğunu gösterdi. Present kağıt, insan ve maymun saç örnekleri işleyen ve bu numunelerden Cort ayıklamak ve analiz etmek bizim laboratuvarda rutin kullanılan yöntemlerin ayrıntılı bir hesap sağlar.

Protokol

1.. Örnek Toplama ve Saklama

1. İnsan saçı
   1. Bir lastik bant ya da klips ile (çapı bir kalem-genişliği kadar) örneklenecek olan saçın tüm uzunluğu elde edin. Mümkün olduğunca kafa derisine yakın kesilmiş saç temiz bir makasla (değil nick cilt özen). Not: Standart örnekleme alanı kafatası arka tepe noktasıdır.
   2. Bazı araştırmacılar da bakınız Manenschijn et al. ⁸ (su ve şampuan ⁷ tekrar tekrar maruz boşaltılmasında nedeniyle olabilir kafa derisi ^6, uzaklaştıkça insan saç CORT seviyelerinde bir düşüş olduğunu bildirdi ve aksine sonuçlar için Thomson et al. ^9'daki adres bölümlere göre düşüş bu potansiyel "arınma etkisi" etkisini en aza indirmek için) gözlenmiştir ki, biz 1 cm / ay ¹⁰ ortalama artış hızı varsayımıyla 3 cm (daha büyük bir uzunluk ile kafa derisine yakın saç kesimleri toplama öneririz bir 3 cm segmenti C içerirYaklaşık son 3 ay içinde tevdi edilmiştir ORT). Bunu başarmak için, ilk kesim 3 cm boyutlarında ve 3 cm numune elde etmek için tekrar kesmek için bir cetvel kullanın. Not: saç uzunlukta kesilmiş sonra, bu çalışma öncesi numune için bir zaman periyodu boyunca CORT birikmesinin retrospektif takvim kurmak için ayrı bir 1 cm uzunluğunda bölümler halinde örnek kesmek içerir sürece hizada şeritleri tutmak için artık gerekli değildir ^6.
   3. Alüminyum folyo, temiz bir kağıt zarf, ya da örnek yıkama için kullanılan tipte bir 15 mL vida kapaklı santrifüj tüpü polipropilen yapılmış bir kese içinde saç numunesi yerleştirin. CORT saç ² son derece stabil olduğu, gerekirse, numuneler, oda sıcaklığında bir gece boyunca sevk, -20 ° C'de saklanır ve süresiz edilebilir.
   4. Saç toplama prosedürü gönüllüler üzerinde uygulanmalıdır ve uygulama örnekleri tam çalışmaya başlamadan önce tartılır olmalıdır. Not: SMA gibi saç örnekleriBu düşük CORT altında standart EIA okumaları elde etme olasılığını en aza indirmek için numune> 10 mg toplamak için tercih edilir, ancak ll 5-10 mg gibi, burada tarif edilen yöntemler kullanılarak analiz edilebilir.
2. Maymun saç
   1. Standart bir hayvan kesme makinesi kullanılarak ense saç (100-250 mg) tıraş. , Mümkün olduğunca cilde yakın tıraş cilt değil nick için dikkatli olmak ve kan CORT düzeyleri saç bulunanlara kıyasla son derece yüksek, çünkü kanama neden olur. Not: genellikle saç için iyi bir kaynaktır ve kolayca öncesinde yeniden örnekleme için saç çıkma görülebilir, çünkü boyun bölgesi rutin numune için seçildi.
   2. Alüminyum folyo ya da bir 15 mL vida kapaklı santrifüj tüpü polipropilen yapılmış bir kese içinde saç numunesi yerleştirin. Maymun saç örneklerinde depolanır ve insan saç örnekleri için yukarıda tarif edildiği gibi aynı şekilde sevk edilmelidir.
   3. Maymun saç, insan saçlarınızdan aksine, st sonra belli bir uzunluğa kadar büyür ve çünkü¹¹ büyüyen ops, bu CORT tevdi edilmesi için bir takvim olarak deriden mesafeyi kullanmak için bu durumda genel olarak mümkün değildir. Bir hayvan daha (periyodik rutin sağlık muayeneleri sırasında, örneğin) bir kez daha örnek olabilir, ancak bu bir başlangıç ​​zaman noktası ayarlayın ve daha sonra istenilen süre geçtikten sonra aynı alanı reshave bir ilk tıraş yapmak için arzu edilir. Ikinci numunede CORT bu aralıkta ⁵ üzerinden HPA etkinliğe numune CORT içeriğinin kesin bir atıfta izin tıraş-reshave aralık sırasında biriktirilmiştir.

2. Numune Yıkama ve Kurutma

1. Yıkama
   1. Bir 15 ml vida kapaklı polipropilen santrifüj tüpü içine her bir saç numunesi yerleştirin.
   2. Bir rotator ile 3 dakika boyunca tekrar ters ardından her tüpe, yüksek performanslı sıvı kromatografisiyle (HPLC) dereceli izopropanol içinde 5 ml.
   3. C alarak, bir atık kabı içine izopropanolü Durusunumunenin herhangi kaybetmek değildir.
   4. Tekrar 2.1.2 ve 2.1.3 bir kez daha adım.
2. Kurutma
   1. Tam izopropanol buharlaşmayı sağlamak için en az 2-3 gün boyunca saçınızı kurutun.

3. Numune Taşlama ve CORT Ekstraksiyon - Geniş Örnek için Yöntem 1

1. Örnek taşlama
   1. Paslanmaz çelik tek bir 12 mm paslanmaz çelik öğütme top ile birlikte bir öğütme kabı 10 ml kuru saç 250 mg'a kadar yerleştirin.
   2. Bir bilyalı değirmen kullanılarak 25 Hz 'lık bir hızda 6 dakika için örnek öğütün.
   3. Bir analitik terazi üzerinde toz halinde saç 50 mg kadar tartılır ve daha sonra, sonraki CORT ekstre için temiz bir 2.0 ml polipropilen mikrosantrifüj tüpüne transfer.
2. CORT çıkarma
   1. Toz örneği içeren mikrosantrifüj tüpüne HPLC-grade metanol 1.0 ml ilave edilir.
   2. Tüp kap ve işbirliği ile, oda sıcaklığında 18-24 saat boyunca inkübe örnekBir Picture kullanarak nstant inversiyon.
   3. Toz halindeki saç pellet haline getirmek için oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 14,000 rpm'de santrifüje tüpler.
   4. Toz saç pelet bozmamaya özen, temiz bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne süpernatan 0.6 ml aktarın.

4. Numune Taşlama ve CORT Ekstraksiyon - Küçük Örneklerden için Yöntem 2

1. Örnek taşlama
   1. Boncuk dayak için güçlendirilmiş bir önceden tartılmış 2 ml mikrosantrifüj tüpü içine saç 60 mg kadar yerleştirin.
   2. Numune ağırlığı elde etmek için şişeyi yeniden tartın.
   3. Her bir şişeye, 3.2 mm üç krom çelik boncuk ekleyin ve daha sonra bir boncuk mikser içinde en az 2 dakika için örnek öğütülür. Görsel muayene numune yetersiz pulverize olduğunu ortaya koyarsa, o zaman 0.5 veya 1 dakika ilave taşlama gerçekleştirin. Not: CORT ekstre öğütme ile aynı şişe içinde gerçekleştirilir çünkü zemin saç Resim aktarımı bu durumda gereklidir.
2. CORT çıkarma
   1. Toz örneği içeren mikrosantrifüj tüpüne HPLC-grade metanol 1,5 ml ilave edilir.
   2. Tüp kapak ve bir rotator kullanılarak sabit ters çevirme ile oda sıcaklığında 18-24 saat için örnek inkübe edin.
   3. Toz halindeki saç pellet haline getirmek için oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 10,000 rpm'de santrifüje tüpler. Not: krom çelik boncuklar yöntem 1 ile karşılaştırıldığında, daha düşük hızda santrifüj hesapları olan, ekstraksiyon ve santrifüj aşamaları esnasında saç ile tüp içinde kalır.
   4. Toz saç pelet bozmamaya özen, temiz bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne süpernatan 1.0 ml aktarın.

5. Çözücü Buharlaştırma ve Örnek Sulandırma

1. Bir vakumlu buharlaştırıcı mevcut değilse, bir vakumlu bir buhar ya da azot gazı akışı kullanılarak metanol aşağı kurutun. Bir vakum evaporatör kullanılırsa, metanol buharı ile yakalanan edilebilirSoğuk tuzak veya bir aktifleştirilmiş odun kömürü kartuşu ile donatılmış bir kimyasal tuzağı.
2. Metanolun çıkarılmasından sonra, EIA deney tamponu (analiz seyreltici) uygun bir hacimde CORT özü sulandırın. Nispeten yüksek CORT değerleri beklenen ise, 0.4 ml veya daha büyük bir tampon hacmi kullanın. Nispeten düşük değerleri beklenen ise, o zaman birim duyarlılığı artırmak için 0.2 ml veya daha az azaltılabilir. Not: 0.2 ml örnek bir tekrar işleme gerekli olduğu durumda, en az iki kez, numune suret çözeltilerinin çalıştırmak için yeterli bir birimdir.
3. Hemen yeniden numune tahlil veya sonraki analiz için -20 ° C'de dondur ya. Not: yeniden örnek dondurulmuşsa, bu numune hacminde bir değişiklik yana donma süresi boyunca süblimasyon önlemek için önemli olan son hesaplamalar yapılır yanlış CORT değere yol açacaktır.

6. CORT Deneyi ve Veri Dönüştürme

1. Için saç özleri tahlilCORT yüksek hassasiyetli bir enzim immunoassay (EIA) kiti kullanılarak. Not: Test numuneleri yinelenen her yeniden saç ekstresinin alikoları yerine tükürük örnekleri olacak dışında kit prospektüsünde belirtilen CORT ÇED kit ticari tükürük kullanıyorsanız, üreticinin tavsiyelerini uygulayın.
2. Her deneyde kullanılmak üzere bir kalite kontrol (QC) saç özü hazırlayın.
   1. Ekstra saç örnekleri bir dizi toplamak ve ya adımlar 4.1 ve 4.2 veya 3.1 ve 3.2 adımları olarak büyük numune işleme için onları havuzu olarak tek tek onları süreci.
   2. Çözücüyü buharlaştınn ve adımları 5.1 ve 5.2 'de olduğu gibi özleri tekrar oluşturmak, sonra da birkaç ayrı veya toplanmış numuneleri arasındaki yeniden özler havuz.
   3. Bireysel mikrosantrifüj tüpleri içine toplanmış yeniden özü (örneğin 0.10 ml), uygun bir eş-payı ve hacmi daha sonra kullanmak için dondurma.
   4. Çözülme ve refe sağlamak için her immünotahlil mikrolevhadaki nüsha bir QC alikosunu çalıştırınher çalışma kalitesini kontrol etmek için CORT değer RENCE.
   5. Varyasyon (CV, örnek değerler bir dizi ortalaması ile bölünen standart sapma olarak tanımlanır) bir intra-tahlil katsayısı arası bir deney CV hesaplanabilir oysa, aynı vadede 10-12 QC kuyu analiz hesaplanabilir çalışan bir grup genelinde QC değerleri kullanarak. Kişinin mikroplate okuyucu yazılım her saç özü temsil yinelenen kuyuları için bir CV hesaplar, sonra intra-tahlil CV belirlenmesi için alternatif bir yöntem bütün plaka üzerinde bu bireysel CV değerlerin ortalamasını hesaplamak için.
   6. Herhangi bir örnek özü EIA en yüksek CORT standarda göre daha büyük bir okuma elde edilir, daha sonra özütü bir alikotu analiz tamponu içinde uygun bir miktarı ile seyreltilir ve daha sonra EIA okuma seyreltme faktörü için düzeltilir. Yinelenen kuyuları için CV>% 10 ise numuneler de rutin olarak tekrar analiz edilir.
   7. CORT ÇED kitleri CORT va ölçmek için tasarlanmıştır çünkülues tükürük veya plazma gibi sıvı örnekleri, mikroplaka okuyucu yazılım çıkış toz saç, birim ağırlık başına CORT miktarına dönüştürülmelidir. Aşağıdaki formül mg saç başına pg CORT ug / dl tahlil çıktı dönüştürür:
      (A / B) * (C / D) * E * 10000 = F
      burada tahlil çıkışından A = ug / dl, ekstraksiyon işlemine tabi saç B = ağırlık (mg olarak) C = vol. Metanol (ml) toz halindeki saç eklenmiştir; D = vol. Ekstreden geri kazanılmış ve daha sonra aşağı kurutuldu metanol (ml) E = vol. Kurutulmuş özü tekrar oluşturmak için kullanılan deney tamponu (ml) ve pg / mg saç CORT konsantrasyonunun F = son değer.

Sonuçlar

Şekil 1 yöntemi 2 öğütme ve çıkarma kullanarak işlenen insan saç örnekleri (yetişkin erkek ve dişi insan denekler) bir temsilci kümesinden çıkışını gösterir. Bilgisayar yazılımı, veri çıkışı üretmek için ve CORT standartlara 4 parametreli sigmoidal bir eğri (Şekil 2) uygun olarak kullanıldı. Bu plakadan arası kuyunun özgeçmişleri 0.01-5.73 'den% 1.34 ortalama% intra-tahlil CV ile değişiyordu. Deney-içi CV% 4.41 son dokuz insan saçı tahlillerinden QC değerleri ile tespit edilmiştir. ...

Tartışma

Yukarıda tarif edilmiş olan saç CORT prosedürü gerçekleştirmek için basit, nispeten ucuz olan, kolaylıkla temin kimyasallar, reaktifler ve malzemeleri kullanır ve bir istisna ile, tipik bir analitik laboratuar içinde mevcut olması muhtemel olduğundan, ekipman gerektirir. Özel bir bilyeli değirmen ya da mini beadbeater olarak bir öğütme aletidir. Bazı araştırma grupları küçük parçalara uzunluğunda ¹² kabaca 1 mm içine saç örneklerini sakınmadan unutmayın, ama biz taşlama performans yerine mümkünse kıyma tavsiy...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
HPLC sınıfı izopropanol	Fisher	A451
HPLC dereceli metanol	Fisher	A452
Tükürük kortizol tahlil kitleri	Salimetrics	1-3002	Test hassasiyeti ve özgüllüğü hakkında bilgi için üreticinin kit ekine bakın
15 ml Polipropilen vidalı kapaklı santrifüj tüpleri	Max Scientific	10-9151
1,5 ml Safe-Lock mikrosantrifüj tüpleri	Fisher	05-402-25
2.0 ml Safe-Lock mikrosantrifüj tüpleri	Fisher	05-402-7
2.0 ml XXTuff takviyeli mikroşişeler	BioSpec	330TX	Mini boncuk çırpıcı
3.2 mm krom-çelik boncuklarla	BioSpec	11079132c	Mini boncuk çırpıcı
10 ml paslanmaz çelik öğütme kavanozları	ile kullanın Retsch	02.462.0061	Mikser değirmeni
12 mm paslanmaz çelik öğütme bilyaları	Retsch	05.368.0037	Mikser değirmeni ile kullanım
Savant aktif karbon kartuşu	Fisher	DTK120R	15
ml santrifüj tüpleri için	Fisher	S02135
Mikrosantrifüj tüpleri için döndürücü	Fisher	NC9854190
Mikrosantrifüj tüpleri için tezgah üstü santrifüj	Fisher	13-100-675
MM 200 mikser değirmeni	Retsch	20.746.0001
Mini Boncuk Çırpıcı 16	BioSpec	607
Savant DNA Speedvac	Fisher	DNA120-115
Savant soğutmalı buhar kapanı	Fisher	RVT400-115
Savant kimyasal tuzağı	Fisher	SCT120	Soğutmalı buhar kapanına alternatif
Mikroplaka okuyucu
Mikroplaka yıkayıcı
Mikroplaka karıştırıcı
Çok kanallı pipetleyici
Analitik terazi

kullanım ile kullanım Savant kimyasal tuzak Döndürücü ile kullanım