Ekstraksiyon ve İnsan ve Maymun Saç gelen Kortizol Analizi

Özet

Kortizol (CORT) insanlarda ve primatlarda artan saç gövdesine birikir. Biz yüksek hassasiyet ve duyarlılığı ile saç Cort çıkarma ve analiz yöntemleri açıklanmaktadır. Saç CORT ölçülmesi özellikle aya haftalık dönemler boyunca kronik stres değerlendirmek için çok uygundur.

Özet

Stres hormonu kortizol (CORT) yavaş yavaş insanlarda, insan olmayan primatlar ve diğer memeliler artan saç gövdesine dahil edilir. Biz, geliştirilmiş ve geçerli al yanaklı maymun saçtan CORT ekstraksiyonu ve analizi için bir yöntem ve daha sonra insan derisi saç ile kullanılmak için bu yöntemi uyarlanmıştır. Plazma veya tükürük elde CORT "nokta örneklerinin" aksine, saç CORT hormon esas döneminde, bir hipotalamus-hipofiz-adrenal (HPA) sistem etkinliğinin entegre ölçü ve böylece fizyolojik stres sağlar. Insan saç derisi 1 cm / ay ortalama bir hızda büyür, çünkü, saç kesimleri elde CORT seviyeleri uzunluğu birkaç cm potansiyel ay bir dizi üzerinde yaşanan stres bir biyolojik belirteç olarak hizmet verebilir.

Bizim bir yöntemde, her bir saç örnek ilk ter veya terden de tevdi edilmiştir saç gövdesinin dışından herhangi bir Cort çıkarmak için izopropanol içinde iki kere yıkanmıştır. Kurutma işleminden sonra,örnek kıl protein matrisi parçalamak ve çıkarılması için yüzey alanını arttırmak için ince bir toz halinde öğütülür. Saç gövdesinin iç kısmından CORT metanol içine ekstrakte edildi, metanol buharlaştırıldı, ve ekstre deney tamponu içinde yeniden edilir. Çıkarılan CORT, standartlar ve kalite kontrol ile birlikte, o zaman duyarlı ve spesifik bir ticari olarak temin edilebilen bir enzim immunoassay (EIA) kiti vasıtasıyla analiz edilir. EIA okuma mg toz saç ağırlığı başına pg CORT dönüştürülür. Bu yöntem, insanlarda saç Cort analiz laboratuvarımızda kullanılmakta olan, makak maymunları, marmosets, köpekler, ve kutup ayıları birkaç tür. Laboratuvardan ve diğer araştırma grupları hem de birçok çalışma doğal kronik stres maruziyeti değerlendirmek yanı sıra laboratuar ayarları için saç CORT geniş uygulanabilirliğini göstermiştir.

Giriş

Plazma, tükürük, idrar ya da zaman zaman ya da dışkılar in CORT ölçümü stres ¹ HPA ekseninin rolünün Selye keşfi tarihi, fizyolojik stres göstergesi olarak kullanılmıştır. Çok sayıda kağıtları akut stresli durumlarla HPA aktivitesini ilgili yayınlanmış olmasına rağmen, alan kronik fizyolojik stres basit ve güvenilir bir indeks eksikliği engel olmuştur. Bu sorun ortaya çıkar sirkadiyen varyasyon tabidir ve çevresel bozukluklar tarafından eleştirilmiştir olabilir HPA aktivitesinin plazma ve tükürük verim hem de "nokta" tahminleri çünkü. İdrar ve dışkı örnekleri bazı durumlarda tam bir gün kadar sonrası bir dizi yayılma CORT ve / veya metabolit boşaltım ölçüm....

Protokol

1.. Örnek Toplama ve Saklama

1. İnsan saçı
   1. Bir lastik bant ya da klips ile (çapı bir kalem-genişliği kadar) örneklenecek olan saçın tüm uzunluğu elde edin. Mümkün olduğunca kafa derisine yakın kesilmiş saç temiz bir makasla (değil nick cilt özen). Not: Standart örnekleme alanı kafatası arka tepe noktasıdır.
   2. Bazı araştırmacılar da bakınız Manenschijn et al. ⁸ (su ve şampuan ⁷ tekrar tekrar maruz boşaltılmasında nedeniyle olabilir kafa derisi ^6, uzaklaştıkça insan saç CORT seviyelerinde bir düşüş olduğunu bildirdi ve aksine sonuçlar için Thomson et al. ^9'daki adres bölümlere gö....

Sonuçlar

Şekil 1 yöntemi 2 öğütme ve çıkarma kullanarak işlenen insan saç örnekleri (yetişkin erkek ve dişi insan denekler) bir temsilci kümesinden çıkışını gösterir. Bilgisayar yazılımı, veri çıkışı üretmek için ve CORT standartlara 4 parametreli sigmoidal bir eğri (Şekil 2) uygun olarak kullanıldı. Bu plakadan arası kuyunun özgeçmişleri 0.01-5.73 'den% 1.34 ortalama% intra-tahlil CV ile değişiyordu. Deney-içi CV% 4.41 son dokuz insan saçı tahlillerinden QC değerleri ile tespit edilmiştir. .......

Tartışma

Yukarıda tarif edilmiş olan saç CORT prosedürü gerçekleştirmek için basit, nispeten ucuz olan, kolaylıkla temin kimyasallar, reaktifler ve malzemeleri kullanır ve bir istisna ile, tipik bir analitik laboratuar içinde mevcut olması muhtemel olduğundan, ekipman gerektirir. Özel bir bilyeli değirmen ya da mini beadbeater olarak bir öğütme aletidir. Bazı araştırma grupları küçük parçalara uzunluğunda ¹² kabaca 1 mm içine saç örneklerini sakınmadan unutmayın, ama biz taşlama performans yerine mümkünse kıyma tavsiy.......

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
HPLC sınıfı izopropanol	Fisher	A451
HPLC dereceli metanol	Fisher	A452
Tükürük kortizol tahlil kitleri	Salimetrics	1-3002	Test hassasiyeti ve özgüllüğü hakkında bilgi için üreticinin kit ekine bakın
15 ml Polipropilen vidalı kapaklı santrifüj tüpleri	Max Scientific	10-9151
1,5 ml Safe-Lock mikrosantrifüj tüpleri	Fisher	05-402-25
2.0 ml Safe-Lock mikrosantrifüj tüpleri	Fisher	05-402-7
2.0 ml XXTuff takviyeli mikroşişeler	BioSpec	330TX	Mini boncuk çırpıcı
3.2 mm krom-çelik boncuklarla	BioSpec	11079132c	Mini boncuk çırpıcı
10 ml paslanmaz çelik öğütme kavanozları	ile kullanın Retsch	02.462.0061	Mikser değirmeni
12 mm paslanmaz çelik öğütme bilyaları	Retsch	05.368.0037	Mikser değirmeni ile kullanım
Savant aktif karbon kartuşu	Fisher	DTK120R	15
ml santrifüj tüpleri için	Fisher	S02135
Mikrosantrifüj tüpleri için döndürücü	Fisher	NC9854190
Mikrosantrifüj tüpleri için tezgah üstü santrifüj	Fisher	13-100-675
MM 200 mikser değirmeni	Retsch	20.746.0001
Mini Boncuk Çırpıcı 16	BioSpec	607
Savant DNA Speedvac	Fisher	DNA120-115
Savant soğutmalı buhar kapanı	Fisher	RVT400-115
Savant kimyasal tuzağı	Fisher	SCT120	Soğutmalı buhar kapanına alternatif
Mikroplaka okuyucu
Mikroplaka yıkayıcı
Mikroplaka karıştırıcı
Çok kanallı pipetleyici
Analitik terazi

kullanım ile kullanım Savant kimyasal tuzak Döndürücü ile kullanım