Zemin plakası, omurilik gelişmekte atalarıdır yayılabilir sinyalleri veren ve ayırt nöronların önemli bir yapıdır. Biz, zemin plakası klimalı ortam üretmek için taze omurilik dokusu uygulamak için, ve biyokimya ile ilgi proteinler üzerinde sonuçlarını değerlendirmek için bir yöntem açıklanmaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Zemin Plaka yayımlanan Sinyalleri fonksiyonel özelliklerini değerlendirmek için klimalı ortamda İzole Zemin Plaka Doku ve Üretim Kültürü
Bu makalede
Özet
Özet
Gelişimi sırasında, atalarıdır ve post-mitotik nöronlar kendi kaderini düzenleyen komşu topraklardan sinyallerini alırsınız. Taban-plakası ventral pozisyonda ependimal kanal astar glial hücre grubudur. Zemin plakalı omurilik hücre soylarının dokusuna katkıda anahtar morphogens ifade eder. Sonraki gelişim aşamalarında, zemin plakası commissural akson 1 ipsilateral akson ve kontrol orta hat geçişi geçişi önlemek için bir bariyer olarak hareket, omurilikteki akson navigasyon düzenler. Bu işlevler, çeşitli rehberlik ipuçlarının salgılanması ile elde edilir. Diğerleri yerel rehberlik ipuçlarının 2,3 için akson duyarlılığını modüle rehberlik reseptörleri ve mansap sinyallerini regüle ise bu ipuçlarının bazıları büyüyen aksonlar için cezbedici ve kovucular gibi hareket ederler. Burada deve çeşitli taban plakalı türetilmiş sinyallerin özelliklerini araştıran izin veren bir yöntemi tarifZemin-Plaka klimalı ortamda (FP cm) 4-6 üretime dayalı lopmental bağlamları. Daha sonra akson rehberlik bağlamında bu FP cm kullanımını örnekler. İlk olarak, omurilik E12.5 fare embriyo izole edilir ve zemin plakası disseke ve plazma trombin matriks (Şekil 1) yetiştirilmektedir. İkinci olarak, iki gün sonra, doku commissural, E12.5 embriyolardan ayrılarak toz haline getirildi ve FP cm maruz kalmaktadır. Üçüncü olarak, doku commissural belirteçlerin Western blot analizi için işlenir.
Giriş
Zemin plakası atalarıdır ve postmitotic hücre soylarının şartnamede kilit rol oynayan ve akson navigasyon 7,8 kontrol, gelişen omurilik tanınmış desenleme merkezidir. FP cm üretmek için burada açıklanan deney prosedürü araştırmacılar hücre desenlendirme ve hayatta kalma hücre ve akson göç, gelişimsel süreçleri çeşitli bağlamlarda zemin plaka kaynaklı sinyallerin fonksiyonel özelliklerini değerlendirmek için izin verir.
Bu tür FP cm kullanımını göstermek için, commissural nöron içeren dorsal omurilik dokuları kesilmiş dilacerated ve FP cm ile uyarılır. Dokular daha sonra Western blot analizi için işlenebilir. Bu zemin plakası yayımlanan sinyalleri tarafından akson rehberlik makine düzenlemeleri araştıran sağlar. Dilacerated taze doku tedavisi için bir yöntem th içinde hücrelerin mikro korunması büyük bir avantaj sahiptire doku. Böylece FP cm tedavisi veya tedavinin herhangi bir türde sonuçları hücre ve doku kültürü koşullarında daha fizyolojik bir şekilde değerlendirilir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. GÜN
1.. E12.5 fare embriyoları Omurilik Kat Plate (FP) diseksiyonu
Not: Tüm prosedür steril koşullar kullanımını gerektirir. Bu kirlenmeyi önlemek için bir diseksiyon kaputun altında diseksiyon tercih edilir. Kaput yüzeyi etanol ile temizlenmelidir. Tüm diseksiyon aletleri steril bir Petri kabındaki sterilize ve tutulmalıdır. Sıvılar (orta, diseksiyon orta) kapalı tutulur ve bir buz banyosu koymak gerekir. Her embriyo bireysel taze damla alınmalıdır. Bu doku korunması için önemlidir. Diseksiyon Dumont # 5 forseps ile yapılır. Yemekler, kavrama arka beyin herhangi bir zarar vermeden göbek kordonu veya başı arasında embriyolar transfer için. Bu başarıyla diseksiyonu tamamlamak için omurilik zarar kritik değildir. Hazırlama soğuk Fosfat Tamponlu Salin (PBS), soğuk Hank Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) -% 6.5 glikoz ve oda sıcaklığı neurobasal ortamı.
1.1 Omurilik diseksiyonu
Hayvanlar Avrupa direktiflerine aşağıdaki Centre National de la Recherche Scientifique bir hayvan bakım kurallarına göre tedavi edilir. Ötenazi yöntem servikal dislokasyon, bu boyun basınç uygulayarak ve beyin omurga dislocating oluşur. Bu yöntem, fare hayvan modelleri için tavsiye edilir, ve bir hızlı ve verimli bir şekilde gerçekleştirilebilir.
- Gebelik (E0.5 = ilk gün aşağıdaki paspas) ve E12.5 hamile bir fareyi Euthanize. Fare ventral yüzü yukarı yerleştirin.
- % 70 etanol ile karın ıslatın. Adson forseps ile karın cildi sıkın ve cerrahi makas ile deri ve periton katmanları kesti. Bir kesi yapmak ve karın boşluğuna maruz fare her iki tarafında kesmek için kullanabilirsiniz.
- Embriyoların bir dizi, fare her bir tarafında bulunur. Ute bir boynuz kavramakiki embriyo ve dış kısmından başlayarak onu teşrih arasındaki dokuda rus. Buz gibi soğuk PBS ile bir 100 mm Petri tabağına sağlam rahim aktarın.
- Ekstra-embriyonik dokulardan embriyolar ayıklayın. Forseps iki çift ile plasenta dokusu (koyu kırmızı) kavrayın ve doku gözyaşı ve rahim kesesi embriyo çıkarmak için yavaşça çekin.
Not: Daha iyi bir koruma için, onların rahim kese tek tek gelen embriyolar toplamak.
- Sonraki adımlar binoküler büyüteç ve diseksiyon başlık altında yapılır. Soğuk HBSS-% 6.5 glikoz bir damla tek embriyo yerleştirin.
- Forseps kullanarak, embriyo başını kesmek.
Not: Alt çene ve arka beyin arasında kesin, arka beyin ve arka kısmı bir sonraki adım için önemlidir.
- Deneyci bakan ön kısmı ile embriyo ventral yüzü aşağı bakacak şekilde yerleştirin.
- Cilt çimdikforseps bir çift ve başka çift embriyo deri çekmeye.
Not: Bu adım, cilt tamamen embriyo ön kısmı çıkarılır kadar tekrar edilmesi gerekir.
- Sola embriyo ön yan çevirin. Bir forseps ile ön kısmında embriyo "aşağı pin". Diğer forseps cildi kapmak ve embriyonun rostral tarafına doğru çekin ile. Omurilik sonra erişilebilir.
- Hala omurilik sarın meninks kesmek için forseps bir tarafını kullanın. Omurilik artık açıktır.
- Sağa doğru embriyo ön yan çevirin.
- Embriyonun servikal tarafındaki başlangıç omurilikten doku çıkarın. Omurilik (forseps omurilik hasarları önlemek için kapalı tutulmalıdır) altında forseps kaydırın. Forseps omurilik altında görünür olmak zorunda. Omurilik altında küçük rotasyon hareketleri ayırmak için yeterli olandoku ve dorsal kök ganglionlar (DRG) çevreleyen.
Not: Ayrılma bağlı çevreleyen doku, böylece bir sonraki adım sırasında kırılma olasılığını arttırarak, omurilik ağırlık ekleyin.
- Soğuk HBSS-% 6.5 glikoz taze bir damla izole spinal kord yerleştirin.
- Düz bir pozisyonda, deplasmanda deneyci gelen üst ve ön tarafta meninkslerde omurilik yerleştirin.
- Bir forseps ile kalan arka beyin kullanarak omurilik "aşağı pin" ve ikinci forseps meninks kapmak ile. Omurilik rostral yakasından başlayarak meninks sıyırın.
Not: hareket omurilik herhangi kırılmasını engellemek için yavaş ve sabit olmalıdır. Titreşimli hareketleri menenjlerin kopmasını kolaylaştırabilir.
1.2 FP diseksiyonu
- Bir forseps ile arka beyin çimdik.
- FP merkezi tradoku nsparent parçasıdır. Bir neşter kullanılarak tabanını kesip.
Not: aynı kalitede iki tarafı kesmek için, rostral taraftan başlar ve sırayla sağ tarafı ve zemin plakasının sol tarafını kesti.
- Oda sıcaklığında, Neuro temelli ortam içinde parçalara FP koruyun.
2. FP Kültür
Not: Tüm adımlar, doku kültürü başlığı içinde steril koşullar altında gerçekleştirilmelidir. Taze orta ve taze çözülmüş takviyeleri ve reaktifleri kullanın. Steril cam lamelleri, sıcak Neurobasal + B27, plazma ve HBSS-trombin hazırlayın.
2.1 FP kültür
- Bir 100 mm Petri çanağı ve her bir lamel merkezinde pipet 20 ul plazma içindeki steril lamelleri yerleştirin.
- Her plazma içinde damla 2-4 FP aktarın ve plazma damla yanında 20 ul HBSS-trombin ekleyin ve iyice karıştırın. Lamelleri tutmakOda sıcaklığında on dakika minimum plazma pıhtılaşmasını sağlamak için.
Not: Kısmi diseksiyon durumunda tam diseksiyon ve daha halinde Transferi iki FP. Bir pipet ile yavaş yavaş karıştırın ve FP eksplantlarından ile temasından kaçının.
Plazma pıhtı koagülasyon bir işareti olarak birkaç mikron çeker. Koagülasyon plazma pıhtısı ayrılmasını önlemek için, zamanından önce durdurulması gerekir.
- 24 oyuklu bir plaka içerisinde her bir lamel aktarın ve Neurobasal + B27 500 ul ekle. 37 ° C'de 48 saat inkübe
3. GÜN
3. FP koşullandırılmış ortam (FP cm) Hasat
Not: Hasat bir doku kültürü başlığı içinde steril koşullar altında gerçekleştirilmelidir. Yüzer kültür peri sırasında kirlenmiş veya zemin plakaları (yani yüzen eğer onlar ölmüş olabilir varsaod), daha sonra bu kuyudan FP cm hasat yok.
3.1 FP cm hasat
- Her kuyudan dikkatli bir şekilde ortam hasat.
Not: polimerize plazma trombin karışımı veya herhangi bir FP parçaları pipetle etmeyin.
- -80 ° C'de 100 ul alikotları Mağaza
4. GÜN
4. E12.5 fare embriyoları Omurilik Commissural Nöronlar Diseksiyon
Not: Bu preparat, steril koşullar altında gerçekleştirilebilir gerek yoktur. Embriyoların toplanması için yukarıda tarif edilen prosedür takip edin. Hazırlayın soğuk PBS, soğuk HBSS-% 6.5 glikoz ve soğuk neurobasal.
4.1 Omurilik diseksiyonu
- Forseps kullanarak, embriyo başını kesmek.
Not: Alt çene ve arka beyin arasında kesin, arka beyin ve posterior bölümü için önemlidirsonraki adımlar.
- Deneyci bakan ön kısmı ile taze bir düşüş embriyo ventral yüzü aşağı bakacak şekilde yerleştirin.
- Bir forseps ile embriyo cilt sıkın ve diğeri ile cilt uzak çekin.
Not: Bu adım, cilt tamamen embriyo ön kısmı çıkarılır kadar tekrar edilmesi gerekir.
- Sola embriyo ön yan çevirin. Bir forseps ile ön kısmında embriyo "aşağı pin". Diğer forseps ile cilt kavramak ve omurilik ortaya çıkarmak için, embriyonun rostral tarafına doğru çekin.
- Hala omurilik sarın meninks kesmek için forseps bir tarafını kullanın. Omurilik şimdi maruz ve açık olduğunu.
- Sağa doğru embriyo ön tarafı yerleştirin.
- Embriyonun servikal tarafındaki başlangıç omurilikten doku çıkarın. Omurilik (kapalı forseps tutmak) altında forseps kaydırın. Içinceps omurilik altında görülebilir olmalıdır. Omurilik altında küçük döner hareketler, komşu doku ve dorsal kök gangliyon (DRG) ayırmak için yeterlidir.
- Soğuk HBSS-% 6.5 glikoz, yeni bir damla olarak izole edilmiş omurilik aktarın.
- Düz bir pozisyonda, deplasmanda deneyci gelen üst ve ön tarafta meninkslerde omurilik yerleştirin.
- Ikinci forseps meninks kapmak ile, bir forseps ile kalan arka beyin kullanarak omurilik "aşağı pin". Omurilik rostral yakasından başlayarak meninks sıyırın.
4.2 Commissural Nöron diseksiyonu
- Bir forseps ile arka beyin çimdik.
- Commissural nöronlar omurilik (dorsal tarafı) en yan kısmında yer almaktadır. Ince bir neşter ile bu yanal bölümünü kesmek.
Not: omurilik dorsal kısmı hücre d farkla ventral kısmından ayırt edilebilirdensite, ventral kısmı daha opak olmak.
Not: aynı kalitede iki tarafı kesmek için, rostral taraftan başlar ve sırayla sağ tarafında ve sol tarafında küçük bir uzunluğa kesti.
- Acil kullanım için buz üzerinde Neurobasal ortam içinde parçalara doku koruyun.
5. FP cm Commissural Tissue tedavisi
Not: Bu prosedür steril koşullar gerektirmez. Bu doku, bireysel 1.5 ml tüpler içinde toplanmalıdır. Dondurulmuş FP cm sadece bir kez kullanılmalıdır. Birden soğutulmasından kaçının. Sıcak FP cm hazırlayın (37 ° C).
Commissural nöronların 5,1 Tedavisi
- Küçük bir makas ile commissural doku Dilacerate.
Not: olabildiğince küçük doku kesmek, hücrelerin erişilebilirlik kuvvetlendirmektir.
- Oldukça farklı deneysel koşullar kontrol tedavi ve FP cm tedavi arasındaki doku dağıtın.
- 4 ° C'de 1 dakika boyunca 800 x g doku parçaları santrifüj
- Borular arasındaki bölümlerini yeniden kontrol edin.
Not: fragmanları kadar tekrar gerekli redistribute ve santrifüj eşit olarak dağıtılır iseniz.
- Süpernatant kaldırmak.
- Dokulara sıcak FP cm ve kontrol tedavileri ekleyin.
Not: hacmi topağın miktarına göre ayarlanması gerekir ve en az iki katı pelet hacmi olması gerekir.
- 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
Not: Yavaşça her 10-15 dk sallamak
- 1 dakika boyunca 800 x g'de santrifüj ve tedavi çıkarın.
- Liziz tamponu ekleme
Not: hacim a göre ayarlanması gerekirpelet montaj ve en az iki katı pelet hacmi olması gerekir.
- Pipet ve aşağı yukarı pelet tekrar süspansiyon.
Not: A girdap da kullanılabilir.
- Buz üzerinde 15 dakika inkübe edin.
- 4 ° C'de 15 dakika boyunca 14,000 x g'de santrifüje
- Süpernatantı tutun ve Bradford tahlili 9 protein miktarını ölçer.
- 6x Laemmli Buffer ekleyin.
- Protein içeriği denatüre etmek için 5 dakika boyunca 95 ° C'de inkübe edilir.
Not: Örnekler hemen kullanılabilir ya da -80 ° C'de saklanabilir
- Western blot 10 ile tedavisinin etkilerini değerlendirmek.
Not: toplam proteinlerin en az 50 mg her kulvar için yüklü olmalıdır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Commissural dokular FP cm ile tedavi edildi ve numuneler Western blot reseptör seviyeleri analizi için işlenmiştir. FP cm uygulanması (Şekil 2) geçtikten sonra orta hat itici Semaphorin3B için commissural akson duyarlılığını aracılık eden bir yönlendirme reseptörü, PlexinA1, düzeylerini artırmak için gösterilmiştir. Bu FP tarafından yayınlanan sinyaller PlexinA1 seviyeleri 4,6 düzenleyen olduğunu ortaya koydu.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Taban-plakası şartlandırılmış ortamın üretimi zemin plakası yayınlanan sinyallerin biyolojik özellikleri değerlendirmek için verimli ve kolay bir yol sağlar.
Plazma trombin matris doku yaşam için mükemmel bir koşul sağlar. Bununla birlikte, bu zenginleştirilmiş bir ortam deneylerinin bazı türleri için bir sınırlama olabilir. Bu durumda, zemin levhası doku da agaroz matrisi içinde yetiştirilebilir. Taban plakası şartlandırılmış ortamın kalitesi, GDNF (Şekil 2), Shh ve Netrin ...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok
Teşekkürler
Biz onların yardım için Karine Kindbeiter, Muriel bozon ve Florie Reynaud teşekkür ederim. Iş CNRS, ANR Yoda program ve Labex DevWeCan tarafından desteklenmektedir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
Tablo 2. Araçlar ve malzemeler.
Araçlar ve Malzemelertd colspan="4"><td colspan="4"><> < tr> < td>60%
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Reaktifler Gerekli | |||
| PBS | Invitrogen | 14190-094 | |
| HBSS, Ca2+/Mg2+- ücretsiz | Invitrogen | 14170-088 | |
| Glikoz | Sigma | G-7021 | |
| Nörobazal | İnvitrojen | 21103-049 | |
| Plazma | Sigma | P-3266 | 1 mg / ml (H2< / sub>O ve filtratta sulandırın) |
| Trombin | Sigma | T-4648 | 10 mg / ml (H2< / sub>O ve filtratta sulandırın) |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | 50x |
| HEPES (260 g / mol) | Sigma | H-7006 | |
| EDTA | Sigma | E-5513 | 0.5 M, pH 8 |
| MgCl2 | Euromedex | 2189 | 1M |
| Gliserol | VWR | 24388.295 | |
| IGEPAL | Sigma | I-3021 | |
| Komple Proteaz İnhibitörü Kokteyl Tabletleri | Roche | 04 693 116 001 | |
| Sodyum Ortovanadat (Na3< / sub>VO 4< / sub>) | Sigma | S-6508 | |
| Damıtılmış H 2O | |||
| Tablo 1. Reaktifler gerekli. | |||
| Cerrahi makas | Güzel Bilim Araçları | 14002-12 | |
| Adson forseps | Güzel Bilim Araçları | 11027-12 | |
| Dumont #5 İnce İpuçları forseps | Güzel Bilim Araçları | 11254-20 | |
| Microknives | Güzel Bilim Araçları | 10136-14< | |
| Diseksiyon ve FP culture | |
|---|---|
| Ethanol 70% | |
| diseksiyon başlığı | |
| diseksiyon mikroskobu | |
| Petri kapları | |
| cam lameller | 18 mm x 18 mm |
| Bunsen gaz brülörü | |
| 24 kuyulu plaka | |
| doku kültürü inkübatörü (37 &derece; C, %5 CO2, nem kontrollü) | |
| Santrifüj | |
| Recipes | |
| FP kültür ortamı | |
| Neurobazal | |
| B27 | 1/50e stoktan seyreltme |
| HBSS-trombin | |
| HBSS | 1 ml |
| Trombin 10 mg/ml | 30 μ l |
| Lizis Tamponu pH 7,4 | |
| HEPES (260 g/mol) | 25 mM |
| EDTA (pH 8) | 5 mM |
| MgCl2 | 1 mM |
| Gliserol | 10% |
| IGEPAL (NP40) | 0.10% |
| Proteaz İnhibitörü Kokteyl | 1x |
| Sodyum Ortovanadat | 0.2 M |
| H2O | |
| Laemmli Buffer | |
| Tris 0,5 M, pH 6,8 | 375 mM |
| SDS | 6% |
| Gliserol | |
| DTT | 0.6 M |
| Bromofenol mavisi | |
| H2O |
Kaynaklar
- Nawabi, H., Castellani, V. Axonal commissures in the central nervous system: how to cross the midline. Cell. Mol. Life Sci. 68, 2539-2553 (2011).
- Placzek, M., Briscoe, J. The floor plate: multiple cells, multiple signals. Nat. Rev. Neurosci. 6, 230-240 (2005).
- Chedotal, A. Further tales of the midline. Curr. Opin. Neurobiol. 21, 68-75 (1016).
- Nawabi, H., et al. A midline switch of receptor processing regulates commissural axon guidance in vertebrates. Genes Dev. 24, 396-410 (2010).
- Ruiz de Almodovar, C., et al. VEGF mediates commissural axon chemoattraction through its receptor Flk1. Neuron. 70, 966-978 (2011).
- Charoy, C., et al. gdnf activates midline repulsion by Semaphorin3B via NCAM during commissural axon guidance. Neuron. 75, 1051-1066 (2012).
- Kiecker, C., Lumsden, A. The role of organizers in patterning the nervous system. Annu. Rev. Neurosci. 35, 347-367 (2012).
- Le Dreau, G., Marti, E. Dorsal-ventral patterning of the neural tube: a tale of three signals. Dev. Neurobiol. 72, 1471-1481 (2012).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. J. Vis. Exp. , (2010).
- Salinas, P. C. The morphogen sonic hedgehog collaborates with netrin-1 to guide axons in the spinal cord. Trends Neurosci. 26, 641-643 (2003).
- Bechara, A., et al. FAK-MAPK-dependent adhesion disassembly downstream of L1 contributes to semaphorin3A-induced collapse. EMBO J. 27, 1549-1562 (2008).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
