Mikrodalga destekli Poli işlevselleştirilmesi (etilen glikol) ve zincir polimerizasyonu ve Hidrojel formasyonunda kullanılan On-reçine Peptides

Özet

Bu video zincir polimerizasyonların gizlenmemesi ve hidrojel sentezini sağlayan, poli (etilen glikol), metakrilat, hızlı, verimli bir yöntem gösterecektir. Bu benzer, fonksiyonlandırmalar verimliliğini değerlendirmek giderme ve gelişmiş değişiklikler için öneriler sunmak ve tipik hidrojel karakterizasyon teknikleri göstermek için peptidler, detay ortak analitik yöntemler içine metakrilamit işlevlerini tanıtmak için nasıl gösterecektir.

Özet

Poli (etilen glikol) (PEG) hidrojel oluşumunda makromerler kullanarak önemli avantajlarından biri, sentetik yönlü olduğunu. PEG molekül ağırlıkları ve yapılandırmaları büyük bir çeşitlilik çizmek için yeteneği (kol sayısı, uzunluğu, kol ve dallanma desen) hidrojel yapıları ve Young modülü ve mesh boyutu da dahil olmak üzere özellikleri, sonuçta üzerinde araştırmacılar sıkı kontrol tanıyor. Bu video poli (etilen glikol) dimetakrilat (PEGDM) içine PEG öncüleri metakrilat hızlı, verimli, solvent içermeyen, mikrodalga destekli yöntem gösterecektir. Bu sentez yöntemi, ilaç dağıtım ve rejeneratif tıpta uygulamalar için çok ihtiyaç duyulan başlangıç ​​malzemelerini içerir. Bu reaktif ve çözücülerin küçük miktarlarda kullanılarak, önemli ölçüde daha hızlı ve daha basit, hem de daha ekonomik ve çevre dostu olarak gösterdiği yöntem, geleneksel methacrylation yöntemlere üstündür. Biz de on-reçine methacr için bu tekniğin bir adaptasyon gösterecekpeptitlerin ylamide işlevselleştirme. Bu on-reçine yöntem peptidlerin N-terminali önceki korumanın kaldırılması ve reçineden ayrılması için metakrilamid grupları ile fonksiyonalize sağlar. Tepkimeye giren yan gruplarının (lisin örneğin, primer amin, serin, primer alkolün, treonin sekonder alkoller ve tirozin fenol) ile amino asitler işlevselleştirilmesini önlenmesi, korunmuş olur ise bu peptidlerin N-termini metakrilamid grupların seçici olarak eklenmesine olanak tanır birden fazla yerden. Bu makale olacak ayrıntılı yaygın analitik ^yöntemler; functionalizations etkinliğini değerlendirmek için (proton nükleer manyetik rezonans spektroskopisi Bulunan: (lH-NMR) ve Matris uçuş kütle spektrometrisinin Laser Desorption Ionization Saat (MALDI-TOF) Destekli). Ortak tuzaklar ve sorun giderme yöntemleri önerilen başka ayar makromer işlevselliği için kullanılabilir teknik ve elde edilen hidrojel içinde olacak modifikasyonları olarak ele alınacak, fiziksel ve kimyasalözellikleri. Özel dikkat hidrojel sertlik ve ilaç salınmasını kontrol etmek, gözenek büyüklüğü etkilediği hidrojel bileşiminin modifiye edilmesi ile ödeme ile ilaç verilmesi ve hücre malzeme etkileşim çalışmaları için hidrojellerin oluşumu için sentez ürünlerinin kullanımı, gösterilecektir.

Giriş

Poli (etilen glikol) (PEG) hidrojelleri rejeneratif tıp ve ilaç verme uygulamalarında ^1-3 kullanılan yaygın Biyo materyaller vardır. Bu hidrojeller diğer biyomateryallerden göre önemli avantajlar sunuyor. PEG hidrojeller gibi onların doğal biyomalzeme muadillerine ¹ ile karşılaştırıldığında elastikiyet ve bozulma oranının modülü gibi mühendislik özellikleri üzerinde kontrol yüksek derecede sunan, sentetik. Bunlar sentetik olarak türetilmiş olduğu için, doğal olarak PEG-türevi malzemelerin ⁴ karşı önemli ölçüde daha az partiden partiye değişkenlik vardır. PEG kimyasal terkibine bağlı olarak, bu hidrojeller son derece hidrofilik protein adsorpsiyonu dayanıklı ve ³ biyo-uyumludurlar. Protein adsorpsiyonu Bu direnç PEG hidrojeller belirli biyolojik veya kimyasal faktörler (ilaçlar, biyomoleküllerin, hücre yapışması peptidler, vb) ve belirli rolleri bu fiili sorgulamak ve çalışma sağlayan araştırmacıların, bir 'boş barut' gibi davranmasını sağlarrs hücre ve / veya doku davranışlarını kontrol oynamak.

Daha büyük resmi görmek için buraya tıklayın .

Şekil 1:.... Poli (etilen glikol) (PEG) mimarileri bir iç kısım ile bir hekza-D) 8 kollu PEG ile pentaeritritol çekirdek C) 8-kollu PEG ile A) doğrusal PEG B) 4-kollu PEG örnekleri çekirdek tripentaeritritol. n PEG sayısı her kolunda tekrarlanıyor. Her bir tekrar bu nedenle, 44 g / mol bir molekül ağırlığına sahiptir n genel olarak molekül ağırlığı ve yapısı / kol # hesaplanabilir.

PEG öncüleri mimarileri ve moleküler ağırlıkları çeşitli mevcuttur (Şekil 1 .) Mimarisi (kol #) ve değişen PEG etilen glikol tekrar (n) bu makromerler oluşturulan hidrojel ağların özelliklerini kontrol etmek için kullanılabilir. Değiştirilmemiş PEG polimerizasyonlar önce, hidrojel ağların oluşmasına PEG hidrojeller için en yaygın olarak kullanılan çapraz bağlama stratejisi yoluyla kovalent çapraz bağlanmasını kolaylaştırmak için başka bir işlevsellik ile değiştirilmesi gerekir terminal hidroksil gruplarını içerir. Polimerizasyonu ve ağ çapraz bağlanma (akrilat, metakrilat, vinil eter, norbornen, vb) kolaylaştırmak için PEG Makromerlerin içine dahil edilebilir kimyasal grupların bir çeşitlilik vardır. Adım ve zincir-büyüme (ya da iki, karışık-mod karışımı): çapraz bağlanmasını kolaylaştırmak için kullanılabilir terminal işlevleri çeşitliliğine rağmen, polimerizasyon oluşabilir hangi sadece iki mekanizma vardır.

g2.jpg "width =" 600px "/>
Daha büyük resmi görmek için buraya tıklayın .

Şekil 2:.. Bölgeleri ve bu döngüler, reaksiyona girmemiş öncüleri ve kalıcı karışıklıklardan olarak artan ağ İdeallikten sapmalar çapraz bağlama yoğun poli (metakrilat) içeren heterojen ağlarda Teorik hidrojel ağ şematik A) Geleneksel zincir-büyüme polimerizasyonu sonuçları B) Step-büyüme polimerizasyonu Sonuçları önemli ölçüde daha homojen ağ yapıları (ölçekli değildir).

Zincir büyüme polimerizasyonu yoluyla çapraz bağlanması işlevler ilave bir çapraz bağlayıcı varlığını gerektirmez. Ancak, zincir-polimerize hidrojeller yoğun çapraz bağ bölgeleri (Şekil 2A) ¹ ihtiva eden heterojen ağ yapıları üretmek. Kontrast, basamaklı polimerizasyon requiPEG Makromerlerin terminal işlevsel gruplar ile reaktif olan bir çapraz bağlayıcı ya da ko-monomerin kullanılması res. PEG terminal işlevsel gruplar, sadece çapraz bağlayıcı ile reaksiyona girebilen ve çapraz bağlayıcı, sadece PEG terminal işlevsel gruplar ile reaksiyona girebilen gibi, bu daha büyük bir ağ yapısı homojenliği (Şekil 2B) ile sonuçlanır ^1. Adım büyüme polimerizasyonlar da tipik olarak çözünür, adi Makromerlerin ¹ nedeniyle immün / enflamatuvar yanıtlar için potansiyel öncüleri ve reaksiyona girmemiş miktarını azaltarak, işlevsel grupların daha fazla dönüşüme yol açar. Karma mod polimerizasyon yöntemleri, aynı zamanda (zincir büyümesini) kendi kendine reaksiyona giren ve bir çapraz bağlayıcı (aşama büyüme) ile reaksiyona girebilen iki Makromerlerin kullanımı yoluyla hem adım ve zincir büyümesi polimerizasyonunun kombine geliştirilmiştir. Bu, her bir polimerizasyon mekanizması özelliklere sahip hidrojeller üreten ve daha karmaşık, çeşitli ağ yapılar üretmek için kullanılabilir ya da dahaadım veya tek başına ¹ zincir-büyüme ağlar.

PEG işlevselleştirilmesi ve hidrojel oluşumunu kolaylaştırmak için kullanılabilen fonksiyonel gruplar bir bolluk vardır birlikte, metakrilatlar ve norbornenler sırasıyla en yaygın zincir ve basamaklı polimerizasyon yarılarının bazıları vardır. Bu işlevleri iki ağ polimerizasyonu üzerinde mükemmel zamanmekansal kontrol sunuyor ve hücreleri saklanması için kullanıldığı zaman, bu ağlar yüksek genel hücre beka ^5-7 destekler. Zincir polimerizasyonu yoluyla fonksiyonalize PEG (PEGDM) çapraz bağ dimetakrilat ve akrilat-,-metakrilat ya da benzer fonksiyonu kazandırılmış biyomoleküllerle ^5,6 ile ko-polimerizasyon vasıtasıyla biyomoleküllerin veya diğer faktörler dahil edilmesine imkan verir. PEGDM hidrojelleri akrilat Fonksiyonlu PEG (Pegda) gibi alternatif zincir-büyüme polimerizasyonu sistemlerine göre önemli avantajlara sahip. Geleneksel yöntemler kullanılarak, Pegda PEGDM daha hızlı sentez edilebilir; however, mikrodalga destekli sentezi kullanılarak, PEGDM sentezin çok daha etkilidir. Pegda genellikle gece boyunca ⁸ veya 24 saat ⁹ reaksiyonlarında sentezlenen değil, aynı zamanda yüksek sıcaklıklarda ¹⁰ dört saat içinde sentezlenebilir. PEGDM Ayrıca geleneksel bir yöntem, 4 gün için ¹² uzanan bir reaksiyon süresi ile, bir gece boyunca ¹¹ ile reaksiyona sokulması ya da 24 saat boyunca ⁵ sentezlenir. Burada gösterilen mikrodalga destekli yöntemi kullanarak, PEGDM 5 dakika reaksiyonda üretilebilir. PEGDM PEGDA ¹³ daha yavaş reaksiyon kinetiği sahip olsa da, PEGDM için çapraz bağlama reaksiyonu birkaç dakika içinde meydana gelen, yine de hızlı olduğu, ve böylece olasılığını artırarak, metakrilat grubu çözelti içinde fonksiyonel grup toplanmasını artar artan hidrofobik olarak PEGDA daha büyük dönüşümünü elde makromer radikal transferi ve metakrilat dönüşüm ^14. PEGDM hidrojeller da artan hücre yaşayabilirliği ve büyümesi ile ilişkili olaraknedeniyle radikal konsantrasyon ve ¹⁴ mevcut girmemiş makromerleri azaltır, herhangi bir zamanda, reaksiyon oranında düşüşler muhtemel Pegda hidrojeller ile karşılaştırıldığında. Bu adım büyüme polimerizasyonu ile norbornen-işlevselleştirilmiş PEG (PEGN) form hidrojeller kullananlar ve PEGN kullanımını ve daha fazla iki işlevsel grupların ortalama içeren bir çapraz bağlayıcı gerektiren Tiol-ene polimerizasyonlar. Tiyil kökleri sistein amino asit fonksiyonlarını ⁷ ile peptidlerin kolay dahil edilmesi için izin norbornen karbon-karbon çift bağı, çok-tiol içeren çapraz bağlayıcı maddeler genel olarak PEGN hidrojeller çapraz bağlanması için kullanılan, ile reaksiyona beri. Adım büyüme polimerizasyonu yoluyla tepki sayıda diğer kimyaları olsa da (örneğin tiyol-akrilat ¹⁵ ve tiyol-vinil sülfonun ¹⁶ olarak Michael katılma reaksiyonları, örneğin alkin-asid ¹⁷ vb tepkilere "Click"), tiyol-norbomen hidrojeller vardır Çok yaygın, tür olarak ikincinorbornen halka önemli reaksiyon hızını artırır ve norbornen çift bağ geçiren zincir polimerizasyonu ⁷ olasılığını azaltır.

Hidrojel oluşumunu kolaylaştırmak için metakrilat, norbornon veya alternatif fonksiyonlandırmalar arasında karar büyük ölçüde yaklaşıma dayanmaktadır. Örneğin, zincir büyümesi polimerize PEGDM ağları hem de gösterilen bir doku mühendisliği periost ^18,19 gelişiminde hücre lokalizasyonu kontrol etmek için uygun olmuştur. Adım büyüme polimerize PEG ağlar nedeniyle tiol (sistein) peptidleri ihtiva eden alt-tabaka kullanılarak enzim dizilerinin dahil kolaylığı için, enzimatik olarak-duyarlı hidrojel bozulmasını kolaylaştırmak için peptid dizilerin dahil edilmesi için daha uygun olan ve işlevselleştirilmiş makromerleri ²⁰ norbornendir. Araştırma sorusu iyi adım-büyüme hidrojellerin kullanımı ile ele alınacaktır ise, Fairbanks ve diğ. Norbor ayrıntılı bir açıklamasını sağlarPEG ⁷ nene işlevselleştirme stratejisi. Bu kağıt yazılıdır kadar PEG ve peptid dizileri, (PEG için bir metakrilat ve peptidler için bir metakrilamid) fonksiyonelleştirilmiş zincir polimerizasyon reaksiyonları için de kullanılabilir.

Geleneksel olarak, PEGDM diklorometan içinde metakriloil klorür ve trietilamin ile PEG reaksiyona sokulması ile elde edilir. Reaksiyon filtrasyon, dietil eter içinde çökeltme ve toplama 4 gün için ¹² uzanan bir reaksiyon süresi yöntemlerle, oda sıcaklığında gece boyunca ¹¹ ya da 24 saat boyunca ⁵ ilerlemeye bırakılır. Bu yaklaşımın birçok varyasyonu mevcut olmakla birlikte, her zaman alıcı olan kimyasal sentez ekipmanı büyük bir dizi gerektirir ve bu yüksek saflıktaki reaktifler ve çözücü madde, nispeten büyük miktarlarda kullanılmasını içerir olarak, çevre dostu değildir. Bu sınırlamaları aşmak için, Lin-Gibson ve ark. Te PEG fonksiyonelleştirilmesi bir mikrodalga destekli, solvent içermeyen bir yöntem geliştirdi rminal metakrilat grupları (Şekil 3A) ^12. Bu reaksiyonda, PEG terminal karboksil grupları, bir alkol oluşturmak üzere metakrilik anhidrit karbonil atomlarından biri ile reaksiyona girmektedirler. Bu, bir yan ürün olarak metakrilik asit ile, PEGDM ürün üretir. Bu sentez, düşük tepkime süresi ve solvent içermeyen sentez yöntemleri de dahil olmak üzere ²¹ mikrodalga sentez karakteristik avantajları, pek çoğuna sahiptir. Mikrodalga sentezi önemli ölçüde daha hızlı olduğu için, daha önce açıklanan yöntemlere tercih edilir, daha geniş bir sentez ekipmanı (örneğin, cam, tepkime plakaları) gerektirir, ve çözücüler arasında, sadece ürün saflaştırma / toplama olup için gerekli olarak nispeten daha az bir reaktif ve çözücü madde miktarları kullanmaktadır sentez, daha ekonomik ve çevre dostu yapmak.

0px "/>
Daha büyük resmi görmek için buraya tıklayın .

Şekil 3:.. Işlevselleştirilmesi şema A) Poli (etilen glikol) oluşturan poli (etilen glikol) metakrilat B) Bu aynı yöntem kullanılır peptit sekanslarının N-terminini işlevselleştirilmesi için kullanılabilir üretilmesi için 10x mol fazlası metakrilik anhidrit ile reaksiyona sokulan bir fonksiyonlandırılmış peptid metakrilamit. Önce reçineden peptidin bölünmesi için bu prosedürü gerçekleştirerek, N-terminalinde selektif işlevselleştirme amino asit yan grupları korunmuş olarak kalır gerçekleştirilebilir. n: PEG sayısı (2 için, sırası ile, = 45.5, 227 ve 455 N 10, ve 20 kDa lineer PEG kullanılan) makromerin yinelenir. R1 RN: amino asit yan zincirleridir. PGN PG1 için: koruyucu grupları yan zincir. TFA: trifloroasetik asit. İPUÇLARI: triisopropilsilan. Dodt: 3,6-dioksa-1 ,8-octanedithiol. H ₂ O: Su.

Mikrodalga destekli methacrylation yöntem son polimer ve polimerik ağlar çeşitli içine dahil edilmesini kolaylaştırmak için peptid metakrilamid grup (Şekil 3B) ile peptidlerin N-terminini işlevselleştirilmesi grubumuzca adapte edilmiştir. Bu reaksiyonda, peptidin N-terminal birincil aminin, bir amit oluşturmak üzere metakrilik anhidrür üzerinde karbonil atom ile reaksiyona girmektedir. Bu, bir yan ürün olarak üretilen metakrilik asit ile işlevselleştirilmiş metakrilamit peptidi üretir. Peptid dizilerinin N-terminini işlevselleştirilmesi, bu prosedür kullanılarak, bu reaktif yan zincirler (birincil aminler (lizin), alkoller (serin, treonin) ve fenoller (tirozin)) ihtiva eden amino asitler işlevsellik sırasında korunmasını önemlidir ve koruma grupları sadece metakrilamid dahil edilmeden sonra ayrılmaktadır.

Bu makalede, bu microw hem gösterecekPEGDM sentez ve on-reçine peptid dizileri işlevselleştirmek, ortak tuzaklar vurgulama ve sorun giderme yöntemleri düşündüren yöntemleri ave-destekli. Bu makalede, yaygın ürün işlevselleştirilmesini değerlendirmek için kullanılan analitik kimya tekniklerini gerçekleştirmek için yöntemler ayrıntılı olacaktır, ve daha gelişmiş modifikasyonları gerçekleştirmek için öneri ve kaynakları verilecektir. Tipik sonuçlar, hidrojel ağları meydana getirmek üzere sentezlenmiş PEGDM kullanan bir model ilacın bırakılmasını kontrol etmek üzere oluşturulan hidrojeller istismar ve hücre-hidrojel etkileşimi kolaylaştırmak için fonksiyonalize edilmiş peptitler kullanılarak dahil olan, olması gerekmektedir. Özellikle dikkat hidrojel örgü boyutunu karakterize ve hidrojel bileşimi sırayla böyle sertlik ve ilaç salım profili olarak dökme malzeme özelliklerini kontrol eden bu temel fiziksel özellik, etkileyecek ayarlı nasıl tartışmaya ödenecektir.

Protokol

1.. PEGDM Mikrodalga-destekli Sentez

1. Su ile kirlenmesini önlemek için, ön-kurutma, tüm cam, 1 saat boyunca bir fırında (> 60 ° C) kullanılmaktadır.
   Not: İstenilen cam içerir: iki adet 100 ml'lik beher, 250 ml beher, 3 spatula, bir 250-ml şişe Büchner, 7 cm'lik bir Büchner hunisi, 10 cm'lik bir saat camı.
2. Daha sonra, bir kap içine dökülerek bir izleme camı ile beher kapsayan ve buz dolu bir yeniden kristalleştirme kabına beher yerleştirerek adım 1.6 gerçekleştirilen çökeltme için önceden soğuk 100-150 ml susuz dietil eter (74.12 g / mol). Kimyasal bir davlumbaz içine mikrodalga ve vortexer taşıyın.
   Not: Dietil eter da kimyasal bir dondurucuya yerleştirilerek önceden soğutulmuş kabı olabilir. Bir dondurucu içinde soğutma ile elde edilen daha düşük, dietil eter sıcaklığı, hızı ve yağış verimliliğini artıracaktır.
3. Küçük bir ağırlık teknesi olarak, molekü poli 5 g (etilen glikol) (PEG) tartılmakSeçtiğiniz (1,000-100,000 Da) ve lar ağırlığı.
   1. Eğer mevcut ise, bir parlatma şişesine kapağının plastik parça çıkarın. Şişeyi DARA ve kaput denklemin başına 1 flakon (MA, 154,16 g / mol) içine metakrilik anhidrit 10 molar fazlalığı dağıtmak. Sintilasyon şişesine PEG ekleme.
      (1)
      nerede g PEG kütlesi, g / mol olarak PEG'in molekül ağırlığı, PEG terminal OH gruplarının sayısıdır, ve Molekül olduğunug / mol MA lar ağırlığı.
4. Gevşek sintilasyon flakon üzerine kapağını bükün. Maksimum güç üzerinde 5 dakika için mikrodalga ayarlayın. Isıya dayanıklı eldiven giyen, mikrodalga her 30 sn şişeyi çıkarın.
   1. Tam 30 saniye için kapak ve girdap sıkın. Çözelti tam 5 dakika boyunca mikro dalgada kadar yineleyin. Kapak nedeniyle çatlamaya işlem sırasında değiştirilmesi gerekebilir.
5. Kapak gevşek ile, oda sıcaklığına kadar soğuması PEGDM. , Diklorometan (DCM, 84,93 g / mol), az bir miktar (10-15 mi) içinde PEGDM çözülür.
   Not: Bu PEGDM nedeniyle artık ısı, DCM (şüpheli bir karsinojen) kaynamasını önlemek için, belirgin bir şekilde (~ 5 dakika) önce DCM ilave soğumaya bırakıldı önerilir. PEGDM bir spatula kullanılarak küçük parçalar halinde parçalanır ve çözülmesine yardımcı olmak için karıştırılmıştır edilebilir.
6. 20 dakika boyunca 10x fazla buz gibi soğuk dietil eter içinde PEGDM çöktürün.
   Not: sc için gerekli olabilirdüşük molekül ağırlıklı PEG (2500 Da) çökeltmek için kristal oluşumunu başlatmak için bir spatula ile beher yan mandal, ancak 1,000 Da altında olan bir moleküler ağırlığa sahip PEG çizilmeye rağmen çökelti değildir.
7. Bir Büchner hunisi ve bir balon kullanarak, vakumla süzülerek PEGDM toplar. Bu PEGDM su adsorpsiyonu teşvik edecek şekilde, kuruluk tamamlamak için filtre etmeyin.
   Not: Kullanılan belirli bir vakum sistemi, vakum bir tuzak filtre ayar ve çözücü madde buharları ile hasardan korumak için vakum pompası ile vakum kaynağı arasında yerleştirilebilir Gerekirse.
8. Havalandırma için kapak boyunca delinmiş büyük bir ölçü bir iğne ile 50 ml konik tüp, süzüldü PEGDM aktarın. Kuru bir vakum odası içinde gece boyunca muhafaza ediniz.
9. DCM içinde yeniden çözülür ve reprecipitate olarak PEGDM reaksiyona girmemiş MA kaldırmak için bir son adım olarak (adım 1.5-1.7 gibi). Adım 1.8 'de olduğu gibi yeniden kurutun.

2. PEGDM fonksiyonlandırmalar karakterizasyonu

1. Çözücü olarak döteryumlanmış kloroform (120,38 g / mol) kullanılarak, ^1H-NMR için numuneler hazırlanır. Çözücü (≈ 1.0 mi) içinde küçük bir miktar ile bir sintilasyon şişesine PEGDM (≈ 10 mg) küçük bir numunesi yerleştirin. Hedef konsantrasyonu 10 mg / ml 'dir.
   1. Numune çözülür sonra, temiz bir NMR tüpüne aktarın. Numune NMR tüpünün alt 4-5 cm doldurmalıdır.
2. Proton NMR spektrumları toplayın. Verilerimiz, bir 400 MHz spektrometre kullanarak toplanır. Yeterli veri çözünürlüğü elde etmek üzere en az 64 taramalar için oda sıcaklığında örnekleri çalıştırın.
3. NMR analizi (Şekil 4) PEGDM işlevselleştirme% 90'dan az olduğunu gösteriyorsa, methacrylation prosedür tekrar edilmelidir. MA kütle fonksiyonelleştirilmemiş PEG düşük miktarda hesaba katmak için kullanılır ayarlayın.

Not: PEGDM içine fonksiyonalize PEG yüzde gözlenen hesaplanabilir: Terminal methacr teorik orandiizopropilazadikarboksilat protonlar (a, b ve c) orta PEG proton (d) (Şekil 4). Doğrusal PEG için, merkezi PEG proton teorik sayısı 2 denklem ile hesaplanır:

(2)
nerede Moleküler g / mol olarak PEG ağırlığı olan ve Tek bir PEG tekrar (44 g / mol) ve moleküler ağırlığıdır. Doğrusal olmayan PEG için bu denklem, belirli dallanma yapısı (Şekil 1) yansıtacak şekilde değiştirilmesi gerekir. Yüzde işlevselleştirme daha sonra denklem 3 kullanılarak hesaplanabilir:
(3)
nerede metakrilat proton zirveleri altında gözlenen alanı (a, δ = 1.94 ppm, b ve c, δ = 5.57 ve 6.12 ppm), ve metakrilat proton teorik sayısı (a = 3 * , B = 1 * ve c = 1 * - Doğrusal PEG için sırasıyla 6, 2 ve 2). Yüzde işlevselleştirme hesaplama zirveleri a, b ve c kullanılarak gerçekleştirilmiştir ayrı ayrı ve ortala olmalıdırGenel bir yüzde işlevselleştirilmesini elde ed.

Not: yeterince işlevselleştirilmiş PEGDM sonra (suya karşı, su içinde) diyaliz edilir ve kalıntı metakrilik anhidrit ve metakrilik asit kaldırmak, liyofilizasyon yoluyla toplanabilir. Nihai ürün, örneğin sitrik asit veya vitamin C gibi inhibitörün küçük bir miktarının (ağırlıkça% 0.01) ile karıştırılmış ve -20 ° C'de kullanıma kadar kurutucu ile muhafaza edilmelidir. Nihai ürün PEGDM Khetan Burdick ve ²² ile JoVE yazıda ayrıntılı olarak, hidrojeller üretmek için kullanılabilir.

3. On-reçine Peptidlerinin Mikrodalga-destekli fonksiyonlandırmalar

Not: Bizim peptitler UV izleme ile bir otomatik peptit sentezleyicisi kullanılarak, Fmoc-Gly-Wang reçinesi kullanılarak sentezlenir ve vardır N-metilpirolidon (NMP, 99.1 g / mol) içinde 0.2 M amino asit çözeltileri. % 5 piperazin dimetilformamid (86.1 g / mol), DMF (73.1 g / mol) korumasının kaldırılması için kullanılan, 0.5 M O-Benzotriazol-N, N, N ', N'-tetrametil-uronyum-hexaflDMF floro-fosfat (HBTU, 379.3 g / mol) aktivatör olarak kullanılır ve NMP içinde 2 M diizopropiletilamin (DIEA, 129.3 g / mol), aktivatör baz olarak kullanılır. Peptitler de ticari bir peptid tedarikçiden temin edilebilir. Ticari kaynaklar kullanırken, standart olduğu gibi, peptidler, amino asit yan zinciri yerine tamamen ayrışmış daha sağlam koruma grupları ile reçine temin edilmektedir önemlidir.

Not: Bu, reaktif yan zincirler ile, herhangi bir amino asit olduğu metakrilamid işlevselleştirme sadece sekansının N-terminalinden bir primer amini meydana gelir sağlamak için korunur önemlidir. Amino grupları ile reaktif yan asitler ve tipik koruyucu gruplar için Tablo 1 'e bakınız. Koruma grupları olan amino asitler, korumalı olmayan amino asitler ile aynı şekilde, peptid sentezi sırasında serileri içine eklenir ve aynı amino asit tedarikçilerden genellikle mevcut vardır.

Amino Asit	Reaktif grup	Koruma grubu
Lizin	Birincil amin	tert-butiloksikarbonil (Boc)
Serin	Birincil Alkol	tert-butil (tBu)
Threonine	İkincil Alkol	tBu
Tirozin	Fenol	tBu

Tablo 1: Reaktif amino asitler ve tipik koruyucu grupları.

1. Standart katı faz peptid sentezi kullanılarak sentez peptidleri ve kullanıma hazır olana kadar DMF içinde 4 ° C'de reçine üzerinde saklayın.
2. Filtre kağıdı ve 250 ml'lik bir şişe ile birlikte bir 7 cm'lik bir Buchner hunisi kullanılarak, filtrasyon yoluyla DMF'den peptid reçine toplar.
3. Mevcut sintilasyon flakon kapağından plastik parça kaldırın. Sintilasyon şişesine reçine aktarın. Bir pipet kullanarak, bir parlatma şişesine reçineyi kapsayacak şekilde yeterli MA ekleyin.
4. Gevşek olarak sintilasyon şişesi üzerine kap yerleştirmek. Maksimum güçte 3 dk mikrodalga ayarlayın. Isıya dayanıklı eldiven giyen, mikrodalga her 15-20 sn şişeyi çıkarın.
   1. Tam 15 saniye boyunca kapağı ve vorteks sıkın. Çözüm fu için mikro dalgada kadar tekrarlayın3 dk ll.
5. Kapak gevşek ile oda sıcaklığına peptit çözelti soğumaya bırakın. DMF küçük bir miktar ve filtre kağıdı ve bir şişe ile birlikte bir Büchner hunisi kullanılarak, şişesinden peptid reçine toplar.
6. Yeni bir sintilasyon şişesine peptit reçine aktarın ve peptid ayrılması ve korumadan çıkarınız.
   1. 0.25 mmol reçine başına biz (TIPS, 158,36 g / mol), 0.5 ml triizopropilsilan her biri ile 18.5 ml trifluoroasetik asit (TFA, 114,02 g / mol) bir parçalanma kokteyli, rotasyon ile 2 saat oda sıcaklığında, reaksiyonu kullanmak 3,6-dioksa-1 ,8-octanedithiol (Dodt, 182,30 g / mol) ve iyonu giderilmiş su (18.02 g / mol).
      Not: Bu kokteyl en peptidler için yeterlidir, ancak 2,2,4,6,7-pentametil-dihidrobenzofuran-5-sülfonil (yaygın arginin yan zincirlerinin korunması için kullanılan) (Pbf)-korumalı amino asitler korumasını kaldırmak değildir. Sekansı bir Pbf korunan gruplar varsa, TFA 0.5 ml 0.5 ml tioanisol (124 ile değiştirilmesi gerekir.20 g / mol) ve parçalanma süresi 4 saat 'e yükselmiştir.
      Not: yarılma kokteyli, bir kapalı, kristalin madde şekilleri, peptid muhtemelen çözeltisi ve yarılma kokteyli hacminin dışında çökmesini ise iki katına olmalıdır.
7. Izleme camı ile kaplanmaktadır bir çanak içinde buz üzerinde 400 ml susuz dietil eter soğutun.
8. 10x fazla miktarda dietil eter içinde Peptidi çöktürmek ve dört adet 50 ml konik tüpler arasında eşit olarak çözelti bölün. Peptidi toplamak için 10 dakika boyunca 3200 x g'de santrifüjleyin.
   1. Eter kapalı süzün ve taze dietil eter iki kez 50 m konik borular arasında bölünmüş, 100 ml peptidi tekrar süspansiyon. 4 eter yıkaması olmak üzere toplam iki kez taze 50 ml eter içinde tekrar süspansiyon haline getirerek, santrifüj işlemi tekrar edin.
      Not: Bu yarılma kokteyli, kullanılan kimyasal kaldırır ve katı peptidden koruyucu grupları bölünmektedir.
9. Son santrifüj aşamasından sonra, atık et süzüno ve vakum altında bir gece boyunca kurumaya peptidi.

4. Peptid fonksiyonlandırmalar karakterizasyonu

1. Peptid örneklerin MALDI-TOF analizi için çözücü olarak, asetonitril (41.05 g / mol) +% 0.1 TFA: 50:50, H ₂ O kullanın. Küçük bir örnek koyun - bir 1.5 ml Eppendorf tüpüne peptidin (1 2 mg) ve MALDI çözücü 1 ml örnek çözülür.
2. Matris çözüm hazırlayın. Matris olarak bir yaygın olarak kullanılan matrisin bir α-siyano-4-hidroksisinamik asit (CHCA, 189.2 g / mol). Bir matris stok çözeltisinin oluşturulması, MALDI bir çözücü içinde 10 mg / ml matrisi çözülür.
   Not: Matris stok çözeltisi ek analizler için en fazla bir hafta boyunca oda sıcaklığında saklanabilir.
3. 1:1 oranında peptidi ve matris çözeltisi bir araya getirin. 1 ul / nokta ekleyerek, MALDI numune plaka üzerinde üç ayrı yerde üzerine bu kombine çözüm nokta.
   1. Lekeler, hava ile kurutma ile ya da bir ısı tabancası kullanarak ya kurutun. Respot ve kuru herörnek.
      Not: Respotting daha düzgün bir peptit / matris örneği üretir ve net bir sinyal elde yardımcı olur. Bir standart peptit karışımı da bir 1:1 oranında matris solüsyon ile kombine edilebilir ve MALDI plaka üzerine (bir kez) tespit edilmelidir.
4. MALDI-TOF verileri toplayın. Nedeniyle peptidin N-terminine metakrilamid grubunun eklenmesinden, tek başına peptid molekül ağırlığının yukarıdaki molekül ağırlığı 68 g / mol bir artış gerekir.
   Not: PEGDM sentezi farklı olarak, reaktif yan zincirler ile amino asit üzerindeki koruyucu grup kaldırılır yarılma üzerine gibi peptitler, refunctionalized olamaz, ve N-uçlarının seçici işlevselleştirilmesi artık temin edilebilir.
   1. MALDI analizi (Şekil 5) peptit doğru olarak fonksiyonalize edilmiş gösterir ve tüm koruyucu gruplar uygun bir şekilde ayrılır ise, peptit (suya karşı, su içinde) diyaliz edilir ve remov liyofilizasyon yoluyla toplanabilire artık kirletici (yarılma kokteyli, eter, vb koruma grupları ayrılır). Katı peptid küçük bir Eppendorf tüpüne aktarılır ve -20 ° C'de kullanıma kadar muhafaza edilmelidir.

Sonuçlar

Her spektrumu tepe noktasının altındaki alan sağlayan, numune içinde bu proton nispi seviyelerine orantılı olduğu Proton nükleer manyetik rezonans, bir kimyasal reaksiyonun etkinliğini değerlendirmek için en yaygın analitik tekniklerinden biridir ürün ve reaktanın oranlarının belirlenmesi Numunedeki. Terminal metakrilat proton teorik oranı (a, b ve c), (d) merkezi PEG protonlara: Bu tepkime için, ¹ 'H-NMR analizi (Şekil 4) gözlenen gelen% işlevselleştirilmesini hesaplamak için kullanılabilir. Şekil 4'te gösterilen PEGDM önce işlevsellik 2,000 Da idi ve bu nedenle n = 2,000 Da / (44 Da / PEG tekrarı) = 45.5, = 4 x (n-1) = 178 çok d, proton alma: NMR birim oranı 178 / = 1.74 102.16. Örnekteki suyun varlığı yapay tepe noktasının altındaki alanı artar Bu durumda, bir% işlevselleştirilmesini değerlendirilmesinde kullanılamaz zirve. Zirve b kullanarak,% fonksiyonlandırmalar 1.00 * 1.74 / 2 * 100% =% 87.1 'dir; istimalg tepe c% fonksiyonlandırmalar 1.08 * 1.74 / 2 * 100% = 94.1% olduğunu. Bu nedenle, genel% fonksiyonlandırmalar% 91 olup, bu PEGDM yeterli hidrojel sentezinde kullanılmak üzere işlevlendirilmektedir. Tipik olarak, yaklaşık% 90 işlevselleştirme methacrylation tek turundan sonra elde edilir.

Due peptidlerin ¹ 'H-NMR analizi ortaya proton tepe yığınına kadar, peptid işlevselleştirme daha kolay bir MALDI-TOF kütle spektrometrisi kullanılarak incelenmiştir. Bu peptit sentezlendi ve GKRGDSG işlevselleştirilmesini metakrilamid tabi tutuldu ve Şekil 5'te gösterilmiştir. Peptidin küçük bir kısmı, gözlenen en yüksek molekül ağırlıklı peptit sekansının doğru sentezini gösteren 676 g / mol, peptitin beklenen molekül ağırlığı, meydana gelen gösterdi prefunctionalization molekül ağırlıklı değerlendirme (Şekil 5A) için ayrıldı. Peptidin kalan metakrilamid fonksiyonel uygulandıönce bölünmeye ization. Bu peptit Pbf R korumalı amino asitleri ihtiva gibi, bölme 4 saat tiyoanisol içeren bir karışım içinde gerçekleştirilmiştir. Metakrilamid işlevsellik sonra gözlenen en yüksek molekül ağırlığı 744 g / mol (Şekil 5B) oluşur, metakrilamid işlevselleştirilmiş peptid (68 676 g / mol) ve beklenen ağırlık fonksiyonelleştirilmemiş peptitin beklenen moleküler ağırlıkta, doğru belirtilmediği fonksiyonlandırmalar.

PEG ve metakrilamid fonksiyonalize peptidin her iki özelliğe göstermek için, PEGDM hidrojeller GKRGDSG (Şekil 6) fonksiyonalize metakrilamid ve 0,5 mM olmadan üretilmiştir. Hidrojeller ağırlıkça% 0.05 lityum fenil-2 ,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) foto-başlatıcı olarak ile, PBS içinde ağırlık olarak% 10 lineer 10 kDa PEGDM ile üretildi. Hidrojel ön-madde çözeltisi, iki cam slaytlar, bir cam slayt aralayıcı ile ayrılır ve bağlayıcı klipsler ile bir arada tutulan arasında enjekte edildi. Prekürsör çözeltisi daha sonra 8 mm çapında bir silindir şeklinde köpükler, jeller, zımba kullanılarak toplandı ve daha sonra, çapraz bağlanmasını başlatmak için 10 dakika boyunca 2 mW / cm ² 365 nm UV ışığa maruz bırakılmıştır. Jeller PBS ile durulandı ve şişme denge koşulları ^16,20 elde edilmiştir sağlamak için 2 gün boyunca şişmeye bırakıldı. İnsan MSC (geçit 3)% 80 konfluansa kadar büyütüldü ve 15,000 hücre / cm ² de hidrojeller üzerine serpildi. Hücreler kullanılarak 10X büyütme ile 0.5 ul / ml kalsein AM ve 2 ul / ml etidyum homodimer (Invitrogen'den ölü / canlı Viability kit) içeren taze ortama aktarılmıştır ve faz kontrast ve floresan altında görüntüsü önce 48 saat için yapışmaya bırakılmıştır Nikon Eclipse Ti 2000. MKH fonksiyonelleştirilmemiş PEG hidrojellerin (Şekil 6A) uymak için koyamadık, ama hücre yapışma peptid RGD dahil edilmesi durumunda onlar için uygun ve hidrojel yüzey (Şekil 6B) yaymak başardık. / CANLI DEAD görüntüleriMSC ölümü üzerine jel yüzeyinden ayırmak ve tohumlu hücre canlılığının yapay enflasyonu ile sonuçlanan ortam aktarım işlemi sırasında kaldırılacak yapışma bağımlı hücreleri gibi, tohumlanmış MSC nüfusun canlılığı temsil etmemektedir sundu. Bunun yerine, floresan görüntüler tek faz kontrast altında zor olabilir, hidrojel topoloji, yapışık hücre ve küçük varyasyonlar arasında ayırmak için tasarlanmıştır. İlginç bir şekilde, yayma olmayan hücreleri hücreler görüntüleme sırasında ölen belirten, kalsein AM ve etidyum homodimer hem de pozitif leke PEG-tek jelleri üzerinde tohumlandı.

PEG hidrojelle birçok avantajlarından biri de son derece ayarlanabilir doğasıdır. PEG hidrojelin özel makyaj değiştirme araştırmacılar, elastikiyet modülü gibi özellikleri üzerinde kontrolün yüksek derecede elde edilir. Şekil 7'de gösterildiği gibi, PEG molekül ağırlığı (Şekil 7A) ve ağırlık yüzdesi (her ikisi de (Şekil 8) araştırılarak gösterilmiştir. Tüm hidrojeller foto-başlatıcı olarak% 0.05 'LAP ile, PBS içinde ağırlık olarak% 10 lineer PEGDM ile üretildi. Hidrojel ön-madde çözeltisi 40 ul silindirik geometrisi çapı yaklaşık 5 mm ve 2 mm yüksekliğinde üreten, hidrojeller oluşturmak üzere uçları kesilmiş ve 10 dakika boyunca 2 mW / cm ² 365 nm UV ışığına maruz kalan 1 ml şırınga içinde olduğu . Jeller mekanik test edilmeden önce 2 gün boyunca PBS içinde şişmeye bırakıldı. Hidrojel modülü 0.1 mm / sn 'lik bir oranda başlangıç ​​hidrojel yükseklik 5 ile% 10 sıkıştırırken, 5 N yük hücresi ile bir MTS QT / 5 kullanılarak belirlendi. Mekanik test işlemi tamamlandıktan sonra, örgü boyutu hidrojel mas ölçülerek belirlendipre-(M _s) ve post-(M _D) MATLAB yapılan hesaplamalar ile tartışma bölümünde, ayrıntılı olarak Flory-Rehner denklem yoluyla liyofılizasyondan 24 saat. Hipotez olarak, hidrojel ağ boyutunda bir artış (Şekil 8A) ve hidrojel sertlik azalma (Şekil 8B) neden makromer PEG'in molekül ağırlığı artmaktadır. Hidrojel ağ boyutu ve elde edilen jel sertliği de ağırlık yüzdesi PEG değiştirilmesiyle kontrol edilebilir. Hidrojeller doğrusal 10 kDa PEGDM arasında değişen ağırlıkça% ile üretildi ve daha önce (Şekil 9) için açıklanan hidrojel sertlik ve gözenek boyutu belirlenmiştir. PEG gibi önemli bir ağ boyutunda bir azalma (Şekil 9A) ve hidrojel sertlik (Şekil 9B) içinde bir artışa neden olur ağırlıkça% artırılması, Şekil 7B'de gösterilen edildi.

Kapsüllenmiş sığır serum albümini (BSA) ihtiva eden Hidrojeller değişen Molecula kullanılarak oluşturulmuşturağırlıklı bir PEG (2, 10, ve 20 kDa). Şekil 6 için tarif edildiği gibi bütün hidrojeller, 50 ug / ml BSA içeren PBS içinde ağırlık olarak% 10 PEGDM ile üretildi. Jeller, 37 ° C'de 1 ml PBS içinde inkübe edildi ve her bir zaman noktasında taze PBS aktarılmıştır. Çıkış BSA Thermo Scientific Bradford Assay kullanılarak ölçülmüştür. Hidrojel ağ boyutu, Şekil 8 için tarif edildiği gibi tespit edilmiştir. Şekil 7A'da gösterildiği gibi, serbest BSA hidrojel içinde daha büyük bir gözenek boyutuna (Şekil 10) bir sonucu olarak, daha yüksek molekül ağırlıklı PEGDM kullanılarak meydana hidrojeller daha hızlı bir şekilde gerçekleşir.

Şekil 4. 2 kDa lineer PEGDM içinde Örnek ¹ 'H-NMR mikrodalga destekli yöntemiyle işlevselleştirilmiş. Yüzde işlevselleştirme ca olabilir,dayalı lculated görülmektedir:. Terminal metakrilat protonların teorik oranı (a, b ve c) merkezi PEG proton (d) için büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın .

Şekil 5,. Peptit GKRGDSG (A) önce ve (B) mikrodalga destekli yöntemiyle işlevsellik sonra. Işlevsellik sonra gözlenen en yüksek molekül ağırlığı 744 g / mol olarak ortaya unutmayın, metakrilamid işlevselleştirilmiş peptitin beklenen ağırlık (676 Örnek MALDI-ToF 68 g / mol) ve olmayan un-fonksiyonlu peptid (676 g / mol) beklenen moleküler ağırlıkta. resmi büyütmek için buraya tıklayın .

Şekil 6,. Temsilci faz kontrast (solda) ve (yeşil / kırmızı) DEAD / CANLI yalnız ve B A) PEG jelleri kültüre MKH'lerin floresan görüntüler (sağ)) 0.5 mM içeren PEG jeller işlevlendirilmektedir GKRGDSG metakrilamit. MKH'ler uygun durumda ve yaymak yalnız Pegda jeller, ancak hücre yapışma peptid RGD dahil edilmesi üzerine, uygun ve hidrojel yüzeye yayılır edebiliyoruz. resmi büyütmek için buraya tıklayın .

Şekil 7. A) hidrojel ağlar oluşturmak için kullanılan PEG molekül ağırlığı ve B) ağırlık yüzdesi PEG (_ hidrojel gözenek büyüklüğü etkiler8 ;) ve elde edilen hidrojel sertlik ve kapsüllenmiş ilaç salma oranı. A) sabit bir ağırlık yüzdesi olarak soldan sağa doğru PEG molekül ağırlığı () Artan ağırlık düşmesi) hidrojel sertlik azalması ve ilaç salım oranını. Artan B, hidrojel örgü boyutunu artırır (soldan sağa) PEG yüzdesi benzer hidrojel sertliğin azaltılması ve ilaç salımı (ölçeksiz) oranını artırarak, hidrojel örgü boyutunu artırır hidrojeller oluşturmak için kullanılır. resmi büyütmek için buraya tıklayın .

Şekil 8,. A) Mesh boyutunu artırır ve B) hidrojel sertlik PEG makromer moleküler ağırlığı arttıkça azalmaktadır. N = 10, hata çubukları, = SEM, *** p ve# 60; 0.001 tek yönlü Tukey HSD post-hoc testi ile ANOVA. Tüm istatistiksel analizler Prizma 5 kullanılarak gerçekleştirilmiştir. resmi büyütmek için buraya tıklayın .

Şekil 9,. A) artan ağırlıkça% PEG) ile hidrojel sertlik artar boyutu azalır ve B Mesh. N = 9-10, hata çubukları = SEM, ** p <0.01, *** p <0.001 Tukey HSD ile tek-yönlü ANOVA ile yazılan- hoc testi. resmi büyütmek için buraya tıklayın .

Şekil 10. ENCA Yayın2 kDa, 10 kDa, 20 kDa molekül ağırlıklı bir PEG kullanılarak oluşturulan hidroj ikinci psulated Model ilaç, sığır serum albümini (BSA). BSA serbest hidrojel içinde daha büyük bir göz büyüklüğüne sahip bir sonucu olarak, daha yüksek molekül ağırlıklı PEGDM kullanılarak meydana hidrojeller daha hızlı bir şekilde cereyan . n = 6, hata çubukları = SEM. Serbest% BSA Bonferroni ile iki yönlü ANOVA tekrar-ölçer ile 2 ve 10 kDa jellerinden salma eşdeğerdir t = 1 ve 2.5 saat, hariç her zaman noktasında, her üç grup arasında (p <0.0001) önemli ölçüde farklıdır post-hoc testi. resmi büyütmek için buraya tıklayın .

Tartışma

Daha önce gösterilen yöntemler PEGDM sentezi ve peptitler veya başka amin-ihtiva-eden bileşiklerin fonksiyonelleştirilmesi için çok değerli metakrilamid bulunmaktadır. Bu maddeler daha sonra rejeneratif tıp ve ilaç verme uygulamaları için de kullanılabilir. Dolayı PEG hidrofilik doğasına, PEG polimerlerden oluşan hidrojeller gövde ² içinde bir kısım dokulara benzer bir yüksek su içeriğine sahiptir. Bu kalite PEG protein adsorpsiyonu karşı çok dayanıklıdır ve bu nedenle vücutta ³ etkisiz hale getirir. Ancak, PEG higroskopik doğası işlevselleştirilmesine sırasında zahmetli kanıtlayabilirim. Su methacrylation prosedürü sırasında PEG numune içerisinde mevcut olması halinde, metakrilik anhidrit metakrilik asit üretmek için su ile tercihen reaksiyona girecek, ve PEG zayıf işlevselleştirme neden olur.

Bu nedenle, PEG ya da peptid başarılı methacrylation sağlamak için alınabilecek en önemli adımlardan biri anhid korumak içinrous reaksiyon koşulları. Kullanmadan önce, tüm cam kurutulması tavsiye adım su kontaminasyonu önlemek için tasarlanmıştır. Örnekteki suyun varlığı 1.7 ppm'de geniş bir pik (Şekil 4) olarak, NMR analizi görülebilir. Kötü methacrylation hatta tüm cam kurutmadan sonra gözlenirse, kimyasal maddeler, sodyum sülfat ya da kullanım öncesinde diğer kurutma ajanları (moleküler elekler gibi) üzerinde kurutulabilir. Distilasyon da kullanımdan önce su çıkarmak ve metakrilik anhidrit saflaştırmak için kullanılabilir ve azeotropik distilasyon PEG ²³ kurutmak için kullanılabilir. Aşırı durumlarda, sentezi, ayrıca yeterince susuz koşulları temin etmek üzere bir eldiven kutusu içinde gerçekleştirilebilir. Aynı prosedür izlenerek methacrylation bir ikinci tur, aynı zamanda işlevselleştirilmesini geliştirmek için gerçekleştirilebilir. Fonksiyonlandırmalar ek mermi gerekli olacak bir şans her zaman vardır çünkü, hızlı bakım vakumlu filtrasyon ile PEGDM toplamak için adım 1.7 ve 1.9 olarak alınmalıdır. Daha uzun bir süre için vakum filtrasyon su adsorpsiyonu için fırsat artan havaya PEG kesinlikle gerekli artışları maruz kalmasıdır.

Hidroksil fonksiyonel gruplara metakrilik anhidrit yüzdesi fazla PEG ön üzerindeki PEG işlevselleştirilmesini (örneğin kol #), artan değişmemiş olsa da genel olarak elde yüzde işlevsellik düşüşler (yayınlanmamış sonuçlar, Benoit lab) ile ilişkilidir. Belirli güçlükler yeterince yüksek bir işlevselleştirilmesini elde karşılaşıldığında preemptively işlevselleştirme etkinliğindeki bu azalma gidermek için, veya mikrodalga reaksiyon süresi arttırılabilir, mikrodalga aralığı 30 saniye tutulur şartıyla. 10 mol fazlası tipik olarak yeterlidir birlikte, reaksiyonda kullanılan metakrilik anhidrit miktarı da ¹² elde yüzde işlevselleştirilmesini arttırmak için arttırılabilir.

Önemli olan buEk çökeltme aşaması (1.9) iyi NMR sinyalleri elde etmek için gerçekleştirilebilir. Bu yeniden çökeltme fazla metakrilik anhidrit ve metakrilik asidin uzaklaştırılmasına yardımcı bulunmuştur önce gece boyunca bir numuneyi kurutmak, sentez ile aynı gün ikinci çökelme gerçekleştirmek için cazip iken. Örnek hazırlanması da temiz NMR spektrumları elde edilmesi için önemlidir ve bu nedenle örnekler tarafından önerilen koşullar kullanılarak hazırlanır. 4 doğru bir şekilde işlevselleştirilmiş PEGDM için Örnek ¹ 'H-NMR sonuçları gösteren Şekil olmalıdır. Merkezi PEG proton terminal metakrilat protonların oranını analiz ederek, PEGDM yeterli fonksiyonalize edilmesi belirlenmiştir. MALDI numune hazırlama net bir okuma ulaşmak için benzer şekilde önemlidir. MALDI tuzlan ve yüksek örnek konsantrasyonlarının varlığında özellikle duyarlıdır. (Yüksek bir sinyal ile 50 keyfi birim (au üzerinde bir yoğunluk): gürültü oranı) okuma berrak bir MALDI halinde elde edilemez, numune, solution matris çözeltisi ile bir araya getirilmiş ve tekrar analiz önce MALDI çözücü içinde 1:100 oranında seyreltilmiş edilmelidir. 5 doğru peptid işlevsellik, yarılma ve örnek hazırlandıktan sonra Örnek MALDI-ToF sonuçları gösteren Şekil. Önce işlevsellik (Şekil 5A) ile reçinenin küçük bir numunesinin yarılması Şekil 5B'de gösterildiği peptidin doğru metakrilamid işlevsel-leştirilmesi ile, peptid GKRGDSG doğru sentezini göstermektedir.

On-reçine peptidlerin işlevselleştirme nispeten sağlam bir işlem olsa da, her bir sırası için gerekli olan koşullar bölünme sık sık ayarlama gerektirir. Birçok amino asit yan zincirler (uzun> 30 amino asitleri ya da koruyucu grupları ile> 15 amino asitleri) korudular uzun sekanslar için, bölünme süresi, bir saat artırılmalıdır. Bölünme süresi çok fazla uzar Ancak, peptid bağı ayrılması nedeniyle uzun süreli asidik maruz kalma neden olabilir. MALDI ana parçalama peptid sentezi veya bölünme meydana gelen hatalar ortaya çok yararlı olabilir. Beklenen molekül ağırlıkları altında bir azalma gözlenmiştir, amino asit (ler) doğru bir çift vermedi işaret edebilir, ya da peptid ayırma (molekül ağırlığı yaygın olarak görülen değişiklikler kaynakları için bakınız Tablo 2) oluştu. Gözlenen moleküler ağırlık kullanılan bir koruyucu grubun ağırlık olarak beklenenden daha yüksek ise, bu bölünme ve korunmadan arındırma yetersizdi ve peptit ek süre recleaved gerektiği muhtemeldir.

MW değişim (g / mol)

Amino Asit Silme	MW değişim (g / mol)	Parçalanmamış Koruma Grupları	Yaygın Mevcut İyonlar	MW değişim (g / mol)
Ala	-71	Asetil	+42	Cl -	+35
Arg	-158	Alil	+40	K +	+39
Asn	-114	Alloc	+85	Mg2 +	24
Asp	-115	Boc	+100	+ Na	+23
Cys	-103	Fmoc	223
Gln	-128	OtBU	+56
Glu	-129	Pbf	252
Giy	-57	tBu	+56
Onun	-137	Trt	242
Ile	-113
Leu
Lys	-128
Met	-131
Phe	-147
-97
Ser	-87
Thr	-101
Trp	-186
-147
Val	-99

x; "> DTH: 64px; "> -113 03px; "> Pro 103px; "> Tyr:; genişliği 20px: yükseklik 20" = stil "

Tablo 2. Yaygın olarak peptid molekül ağırlığında bir değişiklik gözlenmedi.

Mikrodalga destekli methacrylation yöntemler kullanılarak üretilen Makromerler yenileyici bir ilaç veya ilaç verme uygulamaları bir dizi kullanılabilir. Burada sentezlenen işlevlendirilmiş peptidler ve PEGDM de Nitroxide Dolayımlı Polimerleşmesi (NMP), Atom transfer radikal polimerizasyonu (ATRP) veya Döner ilavesi ile polimerlerin içine dahil edilebilirma-Parçalanma Transferi (SALI) yöntemleri ^24. Daha önce Khetan Burdick ve ²² ile JoVE yazıda gösterildiği gibi hidrojel ağları, aynı zamanda, hücrelerin varlığında üretilebilir. Tek başına PEG bazı hücre tipleri ²⁵ hayatta kalma ve fonksiyonu için kritik hücre malzeme etkileşimleri sağlamaz gibi bu, genellikle, bu tür RGD veya hücre dışı matris moleküller gibi hücre yapışma peptidlerin dahil edilmesini gerektirir. Peptidler, örneğin, geleneksel katı-faz peptid sentezi kullanılarak sentezlendi ve hidrojel ağlar içine dahil etmek için izin vermek için, burada açıklandığı gibi fonksiyonalize edilebilir. Şekil 6, hidrojeller (0.5 mM) eklenmiş ve sayısı ve yayılma hücrelerini (Şekil 6B, artan, PEG hidrojel yüzeylerine insan mezenkimal kök hücreler (MSC) yapışmasını kolaylaştırır olarak işlevselleştirilmiş metakrilamit-hücre yapışma peptidi GK RGDS G dahil görüldüğü gibi ), PEG ile karşılaştırıldığında (hücre yapışma peptitsiz hidrojeller 26, integrin dolayımlı etkileşimler yoluyla daha peptide adsorbe spesifik olmayan proteinler ile PEG hidrojeller ile etkileşime girebilir. Bu PEG boşluk dahil ve spesifik olmayan etkileşimleri önlemek için, peptidler Hern ve Hubbell ²⁶ tarafından tarif edildiği gibi, N-hidroksisüksinimidil-aktive edilmiş esterler yoluyla PEG monofunctionalized konjuge edilebilir.

Hidrojel ağları uygulamaları malzeme özellikleri üzerinde sıkı kontrol gerektirir. PEG hidrojeller önemli bir avantajı bu özellikleri üzerinde kontrolün bir yüksek derecesidir. Örneğin, molekül ağırlığı, sayı kol ve PEG ağırlıkça% hidrojel ağların oluşturulmasında kullanılan-tun ince değiştirilebilirÖzel uygulamalar için e özellikleri. Bu hidrojel göz boyutu üzerinde sıkı bir kontrol hidrojel şişme oranı (Q) ve sertliği (elastisite modülü, E) kontrol eder (ξ) izin verir. Bu, Şekil 7A'da gösterilen ve Şekil 8, in miktarı olduğu hidrojel ağ boyutunda bir artış (Şekil 8A) ve hidrojel sertlik (Şekil 8B) bir azalma ile PEG makromer molekül ağırlığı sonucu artar.

Bu hidrojel ağlarda toplu davranışlarını kontrol altında yatan fiziksel özelliği, örgü boyutu, Flory-Rehner denklem ¹⁶ kullanılarak hesaplanmaktadır. Bu hesaplamayı yapmak için, hacimsel şişme oranı (Q) birinci 4. denklemden hesaplanır:
(4)

ρ _s suyun yoğunluğu (1 g / ml) olduğu yerde, ρ _p PEG yoğunluğu (bir1.12 g / ml), M _s hidrojel ve M, _D, şişmiş ağırlığı (genellikle) dondurma ve hidrojellerin liyofilizasyondan sonra ölçülen hidrojelinin kuru kütle olmasıdır. Çapraz bağlar (M + _c, g / mol) arasında moleküler ağırlığı, daha sonra denklem 5 hesaplanır:
(5)

M _N (g / mol olarak) PEG sayı-ortalama molekül ağırlığı olduğu, , polimerin özel hacmidir , V ₁ su molar hacmi (18 ml / mol) 'dir, V ₂ hidrojelin denge polimer hacmi fraksiyonudur
( ), Ve X, ₁ 16'dır. Çapraz bağlar (n) arasındaki bağların sayısı daha sonra denklem 6 kullanılarak hesaplanır:
(6)

N _b PEG tekrarında bağların sayısı olduğu (3) ve M _r PEG tekrar (44 g / mol) ²⁷ MW. Bu sayede polimer zincirinin kök ortalama kare uçtan uca mesafe (Nm) denklem 7 hesaplanabilir için:
(7)

l (CC ve CO bağ uzunlukları göre hesaplanır 0.146 nm), ortalama bağ uzunluğu ve C _n polimeri (PEG için 4.0) ²⁸ karakteristik oranıdır. Finally, hidrojelin göz boyutu denklem 8 hesaplanabilir:
(8)

Hidrojel özellikleri benzer hidrojellerin oluşumu kullanılan PEG miktarının ayarlanması ile ayarlanabilir. Daha sonra hidrojel sertliği azaltır hidrojel ağ boyutunda bir artışa PEG makromer sonuç ağırlık yüzdesi, azaltılması. Şekil 7B göstermektedir ve Şekil 9, PEG ağırlık yüzdesi mesh boyutunu kontrol etmek için kullanılabilir hidrojel oluşumunda kullanılan kadar rakamlarla (Şekil 9A) ve elde edilen hidrojel sertlik (Şekil 9B). Alt-tabaka sertliği gibi kök hücre farklılaşması ²⁹ gibi hücre davranışları etkilediği gösterilmiştir gibi, sıkı bir şekilde sertliği kontrol etme yeteneği hidrojel üretiminde önemli bir özelliktir.

Hidrojeller da Contr için kullanılabilirol ilaç dağıtım. Şekil 7A'da gösterilen ve daha sonra kapsüllenmiş Model ilaç, sığır serum albümini (BSA) salınımını arttırarak, hidrojel ağın gözenek büyüklüğü artar PEG Makromerlerin molekül ağırlığının arttırılmasını da, Şekil 10'da gösterildiği gibi. Bu çalışmada, hidrojel örnekleri meş boyutlu hesaplamalar için hidrojel ıslak ve kuru kitlelerin ölçümü için izin vermek için t = 195 sonrası imha edildi birlikte, bu örnekler daha uzun süreler için inkübe edilmiş BSA salma ortaya çıkabilecek devam eden bir deneyimdir. Başka gruplar da BSA PEG hidrojel ağları ³⁰ içindeki difüzyona dayanıklı olduğunu bildirdi gibi, Şekil 10'da gözlemlenen BSA eksik açıklaması, beklenmedik bir durum değildir. Kapsüllenmiş protein Eksik serbest nedeniyle protein ve PEG Makromerlerin veya PEG ve BSA ³¹ lizin kalıntıları üzerindeki birincil amin grupları üzerindeki metakrilat grubu arasında kovalent bağlanma arasındaki hidrojen bağları nedeniyle oluşabilir (Şekil 2A), ağ İdeallikten sapmalar ve heterojen bir hidrojel göz boyutu eğilimli olarak, kapsüllenmiş BSA bir kısmını önemli ölçüde daha küçük bir örgü olan hidrojel bölgelerinde bulunan da mümkündür salınmasını engelleyen, jel içindeki genel ortalama daha boyutu. Kapsüllenmiş BSA eksik, nonFickian salım (veriler gösterilmemiştir), bu durumda görülürken, insülin ve ovalbümin gibi birçok diğer model ilaçlar, kontrollü salım Fickian, benzer PEGDM ³⁰ hidroj kullanılarak gösterilmiştir. Buna ek olarak, Watkins ve Anseth benzer hidrojeller floresan moleküller bu serbest göstermek için eş odaklı lazer tarama mikroskobu kullanılmıştır Fickian difüzyonu ile kabul edilebilir modellenir me³² Methods.

Bu çalışmada oluşan hidrojeller bozunmayan olmakla birlikte, ağ bozulması dahil, bu ağlar içinde ayarlanabilir bir parametredir. Hidrojel kontrollü bozulması sağlamak için hücre davranışı ^33, doku büyümesinin veya ana doku büyümesinin teşviki, ³⁴ veya cihazın çıkarılması ihtiyacının ortadan kaldırılması değişikliklere neden olabilir. Bozunur PEG hidrojeller yaygın olarak ³⁵ methacrylation önce PEG içindeki hidroksil gruplarının üzerine halka açılması hidrolitik olarak bozunur D, L-laktid, glikolid veya ε-kaprolakton grubu ile sentezlenir. Bu üç grup glikolid esterler nedeniyle farklı hidrofobik için, en büyük laktid ardından bozunmaya duyarlılık, ve kaprolakton ester sahip, ester işlevselliklerinin hidrolizle yok olurlar. Hidrolitik olarak ayrışabilir gruplarının katılmasından sonra, PEG ayrıca methacrylation prosedür detaile ile fonksiyonalize edilebilirsonraki radikal başlatılan zincir polimerizasyonu ^36,37 ile hidrojel ağların oluşumunu sağlayan bu makalede, d. Hidrojel ağların bozunma oranı, hidrolitik olarak bozunur bir grup (glikolid, laktid, vb) kimliğini değiştirilerek ve yapı ^35,38 dahil parçalanabilir tekrar sayısını değiştirilerek kontrol edilebilir.

Teorik olarak, burada açıklanan yöntemler, sırasıyla, 1.3 ve 3.3 adımları akrilik anhidrid ile metakrilik anhidrit yerine PEG ve peptitlerin akrilasyon için kullanılabilir. Ancak, akrilik anhidrid daha az çekici bir mikrodalga destekli methacrylation göre mikrodalga destekli Açilleme yapma, metakrilik anhidrit ^39,40 fazla 20 kat maliyetidir.

Biz bu prosedürün etkinliğini değerlendirmek için nasıl, PEG ve peptidler işlerlik için basit, hızlı bir yöntem gösterdi, ve u için kaynaklar verdikhidrojel ağları oluşturmak için sentezlenmiş malzemeleri şarkı. Bu sentetik araçları kendi uygulamalarında çok yönlü, ve ilaç dağıtım ve malzeme araştırma laboratuarları herhangi bir sayıda bir elyaf ispatlamak zorundadır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
3,6-Dioxa-1,8-oktanedithiol	Tokyo Kimya Sanayi A.Ş., LTD	D2649	CAS 14970-87-7
Asetonitril	JT Baker	UN1648	CAS 75-05-8
Amino Asitler	AAPPTech	Glisin: AFG101	CAS 29022-11-5
		Arginin: AFR105	CAS 154445-77-9
		Asparagin: AFD105	CAS 71989-14-5
		Serin: AFS105 CAS	71989-33-8
Susuz dietil eter	Fisher Scientific	UN1155	CAS 60-29-7
Sitrik asit	Sigma Aldrich	C1857	CAS 77-92-9
Döteryumlu kloroform	Cambridge İzotop Laboratuvarları A.Ş.	DLM-7-100	CAS 865-49-6
Diklorometan	Fisher Scientific	UN1593	CAS 75-09-2
Diizopropiletilamin	Alfa Aesar	A1181	CAS 7087-68-5
Dimetilformamid	Fisher Scientific	D119-4	CAS 68-12-2
Fmoc-Gly-Wang reçine	Peptitleri Uluslararası	RGF-1301-PI	100-200 ağ boyutu
Metakrilik anhidrit	Alfa Aesar	L14357	CAS 760-93-0
N-Metilpirolidon	VWR	BDH1141-4LG	CAS 872-80-4
Reçine üzerinde peptitler		içinde sentezlenen	Reçine üstü peptitler ayrıca Peptides International, GenScript, AAPPTec, etc.
>O-Benzotriazol-N, N, N', N'-tetrametil-uronyum-hekzafloro-fosfat	AnaSpec Inc	510 / 791-9560	CAS 94790-37-1
Peptit Kalibrasyonu Standart	Bakım	206195
Piperazin	Alfa Aesar	A15019	CAS 11-85-0
Poli (etilen glikol) 2 kDa doğrusal	Alfa Aesar	B22181	CAS 25322-68-3
Poli (etilen glikol) 10 kDa doğrusal	Alfa Aesar	B21955
Poli (etilen glikol) 20 kDa lineer	Sigma Aldrich	81300	JenKem Technologies USA, lineer ve çok kollu PEG
Tiyoanisol	Alfa Aesar	L5464	CAS 100-68-5
Trifloroasetik asit	Alfa Aesar	A12198	CAS 76-05-1
Triizopropilsilan	Alfa Aesar	L09585	CAS 6485-79-6
& alfa; -Siyano-4-hidroksisinnamik asit	Tokyo'nun alternatif bir tedarikçisidir. Kimya Sanayi A.Ş., LTD	C1768	CAS 28166-41-8