Yöntem makalesi

Mikroakışkan bir Picoinjection Metal Elektrotlar olmadan Damlalar

10.8K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/50913

⸱

18 Nisan 2014

 ,  ,  , 
1Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, Unversity of California, San Francisco

Bu makalede

Özet

Biz metal elektrot gerektirmez microfluidic damla picoinjecting için bir teknik geliştirdi. Gibi, bizim teknik içeren cihazlar imal ve kullanımı basittir.

Özet

Microfluidic damla içine reaktifler picoinjecting için mevcut yöntemler mikroakışkan çip entegre metal elektrot gerektiren. Bu elektrotların entegrasyonu cihaz imalat işlemine, hantal ve hata eğilimli adımları ekler. Bu picoinjection sırasında metal elektrotlar ihtiyaçlarını ortadan kaldıran bir teknik geliştirdik. Birçok biyolojik reaktif çözündürüldü elektrolitler içeren ve iletken olduğu Bunun yerine, bu, bir elektrot olarak enjeksiyon sıvı kendisini kullanır. Elektrotları ortadan kaldırarak, cihaz imalat süresi ve karmaşıklığı azaltmak ve cihazlar daha sağlam yapmak. Buna ek olarak, yaklaşım ile, enjeksiyon hacmi picoinjection çözeltiye uygulanan gerilimine bağlıdır; Bu bizi hızla uygulanan gerilimi modüle tarafından enjekte sesini ayarlayabiliyorsunuz. Biz teknik tamponlar, enzimler, ve nükleik asitler de dahil olmak üzere ortak bir biyolojik bileşikler içeren reaktifler ile uyumlu olduğunu gösterir.

Giriş

Damlacık bazlı Mikroakiskan olarak, mikron çaplı damlacıkların sulu bir biyolojik reaksiyonları için "test tüpleri" olarak kullanılır. Küçük damlacıklar olarak reaksiyonların gerçekleştirilmesi için avantaj her damla reaktif sadece birkaç pl kullanır ve, mikroflüidik ile damla oluşturulabilir ve kilohertz oranlarında 1 işlenmiş olmasıdır. Birlikte, bu özellikler tek tek hücreler, nükleik asit molekülü ya da toplam malzemenin ul dk 'lık bir madde ifa edilecek olan bileşiklerle tepkimeye milyonlarca izin verir.

Bu gibi uygulamalar için damla kullanmak, teknikleri damla reaktiflerin kontrollü hacim ekleme için gerekli olan; Bu tür işlemler test tüplerine pipetle benzerdir. Tepkime maddesi bir damla bir elektrik alanı uygulamak suretiyle hedef damla ile birleştirilmiş olup, burada bu gerçekleştirmenin bir yöntemi, electrocoalescence olduğunu. Elektrik alanı damlaların arabirimlerde yüzey aktif madde moleküllerinin bir düzenleme bozar indince film istikrarsızlık ucing ve 2, aksi stabil olduğu emülsiyonlarda birleşmesini tetikleme. Elektriksel olarak indüklenen birleştirilmesi de picoinjector, bir basınçlı akış kanalı 3 son olarak damlalar halinde reaktifler enjekte eden bir cihazın tasarımında yararlanılır. Elektrik alanı uygulamak için, picoinjector cihazlar metal elektrotlar kullanan, ancak sıvı-lehim telleri kolayca kanalda hava kabarcıkları veya toz ve diğer enkaz tehlikeye gibi microfluidic cips içine metal elektrotların entegrasyonu genellikle karmaşık ve hata eğilimli süreci yanı sıra, stres kırıkları ya da cihaz kurulumu sırasında eğilme.

Burada imalatı basit ve daha sağlam hale metal elektrot kullanmadan picoinjection gerçekleştirmek için bir yöntem sunuyoruz. Birçok biyolojik reaktif çözündürüldü elektrolitler içeren ve iletken olduğu picoinjection tetiklemek için, bunun yerine, bir elektrot olarak enjeksiyon sıvı kendisini kullanır. Biz de "Faraday Moa eklemekevrensel bir zemin (Şekil 1) olarak cihaz ve hareket hassas bölgeleri korumak için t ". Hendek elektriksel bir zemin sağlayarak istenmeyen damlacık birleşmesini engelleyerek picoinjection sitenin üst damlacıkları ayırır. Bizim tekniğin bir yararı olduğunu damla enjekte hacmi uygulanan sinyal ayarlama ayarlanabilir sağlayan, uygulanan voltajın büyüklüğüne bağlıdır.

Biz yumuşak fotolitografik teknikleri 4,5 kullanılarak poli (dimetilsiloksan) bizim cihazları (PDMS) imal. Yaklaşımımız reçine, plastik ve epoksiler gibi diğer malzemelerden imal cihazlar ile uyumludur. Kanallar yükseklikleri ve damlacıklar çapı 50 um (65 ul) ile birlikte çalışmak için uygun olan, 30 um genişlikleri vardır. Biz yöntemleri descr benzer 0.50 mm biyopsi yumruklar ile cihaz imalat sırasında oluşturulan liman içine yerleştirilen polietilen boru (0.3/1.09 mm iç / dış çap) ile reaktiflerin tanıtmakIBED önce 5. Enjeksiyon sıvısının tam makyaj spesifik uygulamaya bağlıdır. Sıvının sadece ihtiyaç picoinjector iletilecek elektrik sinyali için yeterli iletkenliğe üretmek üzere yeterince yüksek konsantrasyonlarda çözülür elektrolitler içerir. Tezgah test olarak, bu değer, ve sıvı iletkenlik özel cihaz boyutları ve uygulanan voltajın büyüklüğüne bağlı olsa da, 10 mM 'den daha büyük bir iyon konsantrasyonu, 6, yeterli gerektiğini bulduk.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1.. Deneysel dayanarak Tasarım Cihaz Boyutları ve Topolojili Bilgisayar Destekli Tasarım (CAD) yazılımı kullanma İhtiyaçları

Not: küresel damlacıkların daha küçük seçim emülsiyon Kanal çapları. Bu, bir silindirik ya da "sosis" şekil damlacıklar zorlar ve daha etkili picoinjection sağlar. Bizim amaçlarımız için, çapı 50 mikron idi damlacıkları için 30 x 30 mikron kanalları tasarlanmıştır.

  1. Model picoinjection yer (ler) gereksizdir gibi metal elektrotlar için kanallar, kaldırılır hariç Abate et al. 3 ile tarif edilenler sonra.
  2. Faraday Hendek picoinjection site (ler) ve elektrik alanında damlacıklarını kalkan şekilde yukarı emülsiyon arasındaki çalıştırın (Şekil 1) olarak hizmet kanalları ekleyin.
    Not: Bu istenmeyen birleştirilmesini engeller.

Yumuşak Photolith kullanarak, 2. Fabrikasyona Devicesographic Teknikleri

  1. Mevcut ticari hizmetlerini kullanarak CAD dosyası dayalı bir şeffaflık fotolito maskesi oluşturun.
  2. Daha önce 4 açıklandığı gibi photomask ile, bir aygıt ana üretmek için silikon gofret photoresist'i tedavi.
  3. PDMS 5 cm polistiren Petri kabındaki bulunan aygıt yöneticisi üzerinde kür maddesi (11:01 oranı) ile karıştırılır dökün.
  4. Herhangi bir hava kabarcıklarını çıkarmak için yaklaşık 15 dakika boyunca bir vakumlu desikatör içinde PDMS ile ana yerleştirin.
  5. 1 saat için bir 95 ° C fırına yerleştirerek PDMS cihazı Cure. Seçenek olarak ise, PDMS 24 saat sonra oda sıcaklığında tedavi olacaktır.
  6. Bir cerrahi bıçak ile çevresine kesme ve dikkatle ustadan cihazı soyma aygıtı kaldırın.
  7. Giriş yumruk ve bir 0.5 mm biyopsi yumruk kullanarak PDMS içine delik çıkış.
  8. Bir plazma birleştirme düzeni 4 kullanarak bir cam mikroskop lamı cihazı bağ.

3.. Hava Basıncı hazırlayınAkışkan ihtiva eden bir hazne basınç altında tutmak için kontrol Pompa

  1. 2.7 mm iç çaplı polietilen boru uzunluğu boyunca pompa çıkışını örneğin basınçlı hava çıkar ki değiştirin.
  2. Bu tür boru Luer-lock arkasındaki meme üzerinde lümen uyarak bir luer-lock şırınga ucunda sona erer Construct.
  3. Luer-lock parçacığı ve epoksi ile boru arasındaki boşluğu doldurarak Seal.
  4. 27.5 G iğne takın.

4.. Biyo-uyumlu yüzey aktif madde 7 Çözünmüş Sulu bir tek dağılımlı emülsiyon% 2 (ağırlık / ağırlık) ile inert bir fluorinatlı taşıyıcı yağ içerisinde süspanse edildi (su içinde yağ) damlacıklar hazırlayın

Bu damlacıklar içerdiği spesifik reaktifler uygulamaya bağlıdır

  1. Tekrar enjeksiyon için hazırlık olarak, bir 27.5 G iğne ile bir 1 ml şırınga içine emülsiyonu yükleyin.
  2. , Bir şırınga pompası ve şırınga elde edin (iğne yukarı) dikey olarak yönlendirmek pompa.
    NotBu yönlendirme damlacıklar, taşıyıcı yağ üzerinde bir tabaka paketi neden olur. Pompa çalışmaya başladığında, damlacıklar bunların altındaki yağ tabakası ile yüksek hacimli kısmını şırınga dışına itilmiş olacaktır.

5.. Mikroakışkan Chip Introduction to Reaktiflerini hazırlayın

  1. Bir biyopsi yumruk, iğne, ya da matkap kullanarak 15 ml santrifüj tüpüne (bir vidalı kapak ile herhangi bir kap yeterli olacaktır) bir kap içine üç 0.5 mm delikler.
  2. Bu tüpün alt ulaşmak ve böylece deliklerin içinden geçen bir 0.5 mm çaplı tel elektrot ve PE-2 bir boru ~ 20 cm uzunlukta yerleştirin.
  3. Kalan delik, bu sıvı seviyesinin üzerinde kalan örneğin bu PE boru donanımının bir ~ 20 cm uzunlukta bir ~ 2.5 cm iplik.
  4. UV ile sertleştirilen epoksi ile başlığın üst kısmında herhangi bir boşluk kapatın.
  5. Kap picoinjection sıvı ve vida ile tüp doldurun.
  6. Ekin ile boru kısa uzunluğuna hava basınç kontrol pompa çıkışınılümen içine iğne ing. İğne rahatça oturmalıdır.
  7. Faraday Hendek olarak hizmet etmek üzere 1 M NaCI ile bir 1 ml şırınga doldurun.
  8. 27.5 G iğne bağlayın ve bir şırınga pompası şırınga sabitleyin.
  9. , Taşıyıcı / ayırıcı yağ ile başka bir 1 ml şırınga doldurun 27.5 G iğne bağlamak ve bir şırınga pompası sabitleyin.

6. Picoinjection için mikroakışkan Aygıt hazırlayın

  1. Mikroakışkan çip üzerinde picoinjection sıvı giriş portuna enjeksiyon sıvısı kabından çıkış boru (daha uzun uzunluk) takın.
  2. PE boru uzunluğu ile mikroakışkan çip üzerinde Faraday Hendek için giriş noktasına 1 M NaCl ihtiva eden şırınga bağlayın.
  3. PE boru uzunluğu ile mikroakışkan çipin giriş portuna taşıyıcı yağı içeren şırınga bağlayın.
  4. Mikroakışkan çip üzerinde emülsiyon çıkış portuna PE boru yerleştirin. Boru, bir emülsiyon toplama kabı içinde sona, ne gerekenmally 1.5 ml santrifüj tüpü.
  5. Mikroakışkan çip üzerinde Faraday Hendek için çıkış portuna PE boru yerleştirin. Boru olmayan bir iletken ve bir kısa devreyi önlemek için elektriksel olarak yalıtılmış bir kapta sonlandırmak gerekir.
  6. Picoinjection sıvısı içine metal elektrot timsah kelepçe ile yüksek gerilim (HV) yükselticinin çıkışını.
  7. 1 M NaCl ihtiva eden şırınga iğnesinin metaline timsah klip ile HV amplifikatörün toprak elektrotu bağlayın.

Mikroakışkan Chip içine 7. Infuse Reaktifler

  1. 100 'lik bir oranda, cihaza 1 M NaCl (Faraday Hendek) tanıtılması ul / saat.
  2. Cihaz ölçüleri için uygun fiyatla damlacık emülsiyonu ve taşıyıcı yağ tanıtmak. Bizim demo cihaz için, biz sırasıyla damla ve yağ 200 ile 400 ul / saat, tanıtmak. Akış hızları damlacıklar ayrılır düzenli aralıklarla picoinjector geçmesine izin vermelidirtaşıyıcı yağ bir boşluk ile.
  3. Picoinjection deliği akışkan basıncı damlacık kanalı ile mekanik denge içinde olduğu şekilde picoinjection sıvıya uygulanan basıncın ayarlayın.
    Not: Bu basınç (Laplace basıncı) olarak, enjeksiyon sıvı kapalı tomurcuklanma ve (Şekil 2), kendi damla oluşturmaksızın damlacık kanal içine çıkıntı gerekir. Yukarıda tarif edilen bu akış oranları olarak, enjeksiyon yerinde dengenin elde edilmesi için, enjeksiyon sıvıya ~ 13 psi bir basınç uygulamak.

8. Picoinjection başlayın

  1. Damlacıkları enjeksiyon deliği geçerken, uygulamak 0-10 V, 10 kHz, AC sinyali HV-amplifikatör tarafından 1,000 x (Şekil 3) yükseltilir.
  2. Uygulanan gerilim genliğini değiştirerek enjeksiyon hacmi modüle.
    Not: Yükseköğretim gerilimler damlacıkları tanıştırmak için daha akışkan için izin vermelidir. Bizim test, biz gerilimlerde kararlı ve tutarlı enjeksiyon gözlemlemek olabilirara 100 ve 3000 V 10-500 mM (Şekil 4) arasında değişen NaCl enjeksiyon çözeltileri kullanılmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Mikroskobik görüntüler picoinjection sıvının elektrifikasyon enjeksiyonu (Şekil 2) tetiklemek için yeterli olduğunu picoinjection sitesi Show'da alınır. Enjekte edilen hacim, daha yüksek enjeksiyon hacimleri izin veren daha yüksek bir voltaj ile, uygulanan voltajın genliğini modüle edilmesiyle kontrol edilebilir. (Şekil 3) enjeksiyon sıvı üç molariteleri temsil için uygulanan voltajın büyüklüğüne karşı enjeksiyon hacmi arsa. Hızı bizim yöntemini göstermek için, biz seçici varlığında...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Enjeksiyon hacmi ile uygulanan voltaj arasındaki ilişki onlar enjektör geçerken cihazın boyutları, picoinjection sıvının cihazın molarite için picoinjection akışkan taşıyan boru uzunluğu ve damlacıkların hızı dahil olmak üzere birçok faktöre bağlıdır. Bu nedenle biz hacmi / gerilim ilişkisi gerilim ve molaritede çalışma aralıkları kenarlarında enjeksiyon hacimlerini ölçerek picoinjection her koşudan önce karakterize öneririz. Buna ek olarak, daha yüksek bir voltaj ve enjeksiyon sıvısı molariteleri biz picoinjection sıvı...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Biz tamamen bizim deneylerde uygulanan gerilim ve enjeksiyon hacmi arasındaki ilişkinin arkasında tam fiziksel mekanizmasını anlamıyorum. Laboratuarın ilgi ve uzmanlık ilgili alanlarda bu kalan soruyu takip için çok uygun değildir. Biz bu olguyu keşfetmek için daha fazla fizik ve mühendislik zekası ile bu teşvik ediyoruz.

Teşekkürler

Bu çalışma ucsf, Kantitatif Biosciences'den (QB3) için Kaliforniya enstitüde Biyomühendislik ve Terapötik Bilimleri Bölümü tarafından desteklenen edildi Rogers Aile Vakfı Gap Ödülü Bridging.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1 ml Luer-Lok & trade; şırıngalarBD Medical309628
LocTite UV ile kürlenmiş yapıştırıcıHenkel35241
PE-2 boruBilimsel ÜrünlerBB31695-PE/2
Novec HFE-75003M98-0212-2928-5
NaClSigma AldrichS9888
1.5 ml santrifüj tüpleriEppendorf22363531
BD Falcon 15 ml tüpBD Biosciences352097
Hava basıncı kontrol pompasıControl Air Inc.DAQ ve kontrol yazılımının kontrolü altında bir tane öneriyoruz
Şırınga pompalarıNew Era1 ml şırınga tutabilmeli ve 100 & # 956 kadar düşük hızlarda akabilmelidir; l/saat
HV-amplifikatör0,01 ile 10 V arasındaki sinyallerin 1.000x amplifikasyonunu yapabilmelidir
Plazma bağlayıcı/temizleyiciHarrick Plasma
3" silikon gofretlerSigma Aldrich647535
PDMSDow CorningSylgard 184, kürleme maddesi ile dahil edilmelidir
SU-8 fotorezistMicroChemViskozite cihaz boyutlarına bağlıdır

Kaynaklar

  1. Kritikou, E. It's cheaper in the Picolab. Nat. Rev. Genet. 6 (9), (2005).
  2. Ahn, K., Agresti, J., Chong, H., Marquez, M., Weitz, D. A. Electrocoalescence of drops synchronized by size-dependent flow in microfluidic channels. Appl. Phys. Lett. 88 (26), (2006).
  3. Abate, A. R., Hung, T., Mary, P., Agresti, J. J., Weitz, D. A. High-throughput injection with microfluidics using picoinjectors. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 107, 19163-19166 (2010).
  4. Harris, J., et al. Fabrication of a microfluidic device for the compartmentalization of neuron soma and axons. J. Vis. Exp. (7), (2007).
  5. Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J., Whitesides, G. M. Rapid prototyping of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane). Anal. Chem. 70 (23), 4974-4984 (1998).
  6. O'Donovan, B., Eastburn, D. J., Abate, A. R. Electrode-free picoinjection of microfluidic drops. Lab on a Chip. 12 (20), 4029-4032 (2012).
  7. Holtze, C., et al. Biocompatible surfactants for water-in-fluorocarbon emulsions. Lab on a Chip. 8 (10), 1632-1639 (2008).
  8. Chung, C., Lee, M., Char, K., Ahn, K., Lee, S. Droplet dynamics passing through obstructions in confined microchannel flow. Microfluid. Nanofluid. 9, 1151-1163 (2010).
  9. Herminghaus, S. Dynamical instability of thin liquid films between conducting media. Phys. Rev. Lett. 83 (12), 2359-2361 (1999).
  10. Priest, C., Herminghaus, S., Seemann, R. Controlled electrocoalescence in microfluidics: Targeting a single lamella. Appl. Phys. Lett. 89 (13), 134101-134103 (2006).
  11. Florent, M., Siva, A. V., Hao, G., Dirk, E., Frieder, M. Electrowetting-controlled droplet generation in a microfluidic flow-focusing device. J. Phys: Condens. Matter. 19 (46), (2007).
  12. Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. Picoinjection enables digital detection of RNA with droplet rt-PCR. PLoS ONE. 8 (4), (2013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Enjeksiyon S v sVoltaj KontrolCihaz FabrikasyonuFaraday Hende iEm lsiyon KanalY ksek VoltajDamlac k Enjeksiyonu

İlgili makaleler