Yöntem makalesi

Optogenetically Hedeflenen Önbeyin Devreler Lazer tarama photostimulation

DOI:

10.3791/50915

⸱

27 Aralık 2013

 ,  ,  , 
1Department of Comparative Biomedical Sciences, School of Veterinary Medicine, Louisiana State University, 2Department of Neurobiology, University of Chicago

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nöronal popülasyonları in vitro olarak fotostimül etmek için optogenetik bir yaklaşım kullanarak ön beyin devrelerinin fonksiyonel topografyasını ve sinaptik özelliklerini karakterize etmek için bir yöntem açıklıyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Duyusal ön beyin, işlevsel özellikleri henüz tam olarak aydınlatılamamış, karmaşık bir şekilde bağlantılı hücre tiplerinden oluşur. Bu ön beyin devrelerinin etkileşimlerinin anlaşılması, son zamanlarda nöronal aktivitenin ışık aracılı modülasyonu için optogenetik yöntemlerin geliştirilmesiyle desteklenmiştir. Burada, viral aracılı transfeksiyon yoluyla optogenetik olarak eksprese edilen channelrhodopsinin lazer taramalı fotostimülasyonunu kullanarak in vitro olarak ön beyin devrelerinin fonksiyonel organizasyonunu incelemek için bir protokol açıklıyoruz. Bu yaklaşım aynı zamanda transgenik farelerde spesifik nöronal hücre tiplerinde ekspresyonu hedeflemek için cre-lox rekombinasyonunun faydasından da yararlanır. Transfeksiyonu takiben, nöronlar, channelrhodopsin eksprese eden liflerin lazer taramalı fotostimülasyonuna uyarılmış tepkilerini ölçmek için tüm hücre yama kelepçesi kullanılarak dilim preparatlarında fizyolojik olarak kaydedilir. Bu yaklaşım, fonksiyonel topografya ve sinaptik özelliklerin değerlendirilmesini sağlar. Morfolojik korelasyonlar, canlı dilimin veya sonradan sabitlenmiş dokunun konfokal mikroskobu kullanılarak channelrhodopsin eksprese eden liflerin nöroanatomik ekspresyonunun görüntülenmesiyle elde edilebilir. Bu yöntemler, daha geleneksel yaklaşımlara dayanan ön beyin devrelerinin fonksiyonel araştırmalarını mümkün kılar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Memeli ön beyninin ayrıntılı devresi, iç içe geçmiş bileşenlerinin işlevsel rollerini incelemek için deneysel bir zorluk teşkil ediyor. Bu ilişkilerin çözülmesi, son zamanlarda nöronal popülasyonları ve bunların projeksiyonlarını özellikle heyecanlandırmak ve inhibe etmek için optogenetik yöntemlerin geliştirilmesiyle desteklenmiştir1-3. Bu yaklaşımlar, ışığa duyarlı membran kanallarının genetik olarak kontrol edilen ekspresyonunu kullanır4-6. Özellikle, ışık kapılı bir iyon kanalı olan channelrhodopsin, optik stimülasyonu takiben nöronal zarları depolarize eder ve eksprese eden nöronun ve projeksiyonlarının uyarılmasına yol açar4,7. Tersine, ışık kapılı bir klorür pompası olan halorhodopin, zarı hiperpolarize eder, böylece hedeflenen projeksiyonu6,8,9 inhibe eder. Bu opsinlerin çeşitli varyantları tasarlanmış, ilgilenilen nöronal popülasyonlarda transfeksiyon ve ekspresyon için çoklu vektörler üretilmiş ve bu opsinleri yapısal olarak eksprese eden veya ekspresyonlarının cre-lox aracılı kontrolünü sağlayan transgenik fare hatları tasarlanmıştır1,2,10,11.

Bu optogenetik yöntemlerin ve materyallerin faydası, modern deneysel sinirbilimde devrim yaratmış ve organizmanın fizyolojisi ve davranışındaki belirli nöral devrelerin rolünün incelenmesini sağlamıştır12-15. Özellikle, bu yöntemler in vitro dilim preparatları16-20 kullanılarak beyin devrelerinin fonksiyonel diseksiyonuna güçlü bir şekilde uygulanabilir. Bu bağlamda, bu yöntemin temel avantajlarından biri, serebral kortikal hemisferler arasındaki kommissural bağlantılar gibi, kalın bir dilimde korunması imkansız olmasa da zor olan uzun menzilli projeksiyonların fizyolojisini karakterize etme yeteneğidir16. Ayrıca, bu teknoloji, halorhodopsin6,8,9 kullanılarak ince zamansal hassasiyetle projeksiyonların seçici olarak engellenmesi gibi diğer yöntemlerle mümkün olmayan manipülasyonları mümkün kılar. Ayrıca, bu opsinlerin hücre tipine özgü ekspresyonu, bir nöral devredeki izole bileşenlerin seçici olarak uyarılmasına veya inhibe edilmesine izin verir1,2,11,15,21. Bu nedenle, bu yeni optogenetik araçlar, fizyoloji ve davranışa nöronal katkıların benzeri görülmemiş bir analizini mümkün kılar.

Burada, adeno-ilişkili viral (AAV) vektörler1,2 kullanarak fare beyninde channelrhodopsin eksprese etmek için bir protokol açıklıyoruz. Hedeflenen nöronal popülasyonların spesifik transfeksiyonu, hedeflenen nöronlarda Cre-rekombinaz eksprese eden uygun promotör yapıları veya transgenik fareler seçimi ve 'floklanmış' bir viral yapı1,11,15,21 ile bu protokol kullanılarak gerçekleştirilebilir (Şekil 1). Burada örnek olarak, birincil görsel korteks (V1) ve ikincil görsel korteks (V2) arasındaki kortikotortik projeksiyonları inceliyoruz ve ayrıca primer somatorsensoriyel korteksten (S1) ventroposterior medial çekirdeğe (VPm) katman 6 kortikotalamik projeksiyonu araştırıyoruz. Sinaptik fizyolojiyi ve fonksiyonel topografyayı değerlendirmek için bu spesifik ekspresyonu in vitro lazer taramalı fotostimülasyon ile birleştiriyoruz. Burada sunulan kurulum, fotostimülasyon lokuslarının hassas uzamsal konumlandırılmasını ve kontrolünü sağlar. Son olarak, konfokal mikroskopi kullanarak ifade kalıplarının görselleştirilmesini açıklıyoruz.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Cerrahi ve Enjeksiyonlar

  1. İntraperitoneal enjeksiyon (22-25 G iğne önerilir) ketamin (100-120 mg / kg) ve ksilazin (7.5-16 mg / kg) kullanarak fareleri uyuşturun.
    1. Hiçbir yanıt ortaya çıkmayana kadar güçlü ayak parmaklarını tutarak sedasyonu değerlendirin. Açıklanan tüm hayvan prosedürleri için, gerektiği gibi yerel IACUC yönergelerini takip edecek şekilde değiştirin.
  2. Sedasyonlu fareleri, baş ve kulakları kendi tutucularına sabitleyerek stereotaksik bir cihaza yerleştirin.
    1. Hayvanı stereotaksik cihaza yerleştirmeden önce gözleri steril bir oftalmik merhem ile yağlayın.
  3. Saç derisini bir ustura ile tıraş edin ve alanı Betadine çubuklarıyla sterilize edin.
  4. Bir neşter kullanarak orta hat kesisi kesin ve enjekte edilecek alanın üzerindeki cildi ve alttaki kasları yansıtın.
  5. Maruz kalınacak bölgenin üzerinde bir kraniyotomi yapmak için bir neşter bıçağını trephine olarak döndürün. Alternatif olarak, kraniyotomiyi gerçekleştirmek için bir Dremel'e bağlı küçük bir matkap ucu kullanın.
    1. Kraniyotomiyi gerçekleştirmek için, neşter bıçağını veya matkap ucunu kafatasının yüzeyine yerleştirin ve altındaki pia materini ortaya çıkarmak için yeterli kemik kazılana kadar yavaşça döndürün.
    2. İlk kazı yapıldıktan sonra, kemiği kenarlardan dikkatlice çıkarmak için ince forseps kullanarak kraniyotomiyi büyütün.
  6. 1 μl'lik bir şırıngayı enjekte edilecek viral çözelti ile doldurun (UNC Vector Core).
    1. Transfeksiyon etkinliğini arttırmak için 4 μg/ml polibren içeren viral çözelti hazırlayın.
  7. İğneyi enjekte edilecek alana indirin ve bir şırınga pompası ile 200 nl virüs içeren solüsyonu basınçla infüze edin.
    1. İğneyi çekmeden önce şırıngayı 10 dakika bekletin.
  8. Cildi emilmeyen monofilament Naylon ile dikin ve kesiyi antibiyotikli merhem ile kapatın.
    1. Dikişler 7-10 gün sonra alınmalıdır.
  9. Postoperatif analjezi için buprenorfin (0.05-0.1 mg / kg) enjekte edin.
  10. Kanal rodopsininin yeterli ekspresyonunu sağlamak için hayvanların ameliyat sonrası 14-21 gün iyileşmesine izin verin.

2. Dilim Hazırlama

  1. İyileşme dönemini takiben, arka ayak ve / veya ayak parmakları sıkıca sıkıştığında geri çekilme refleksinin yokluğu ile doğrulandığı gibi, hayvanı izofluran anestezisi ile derinlemesine uyuşturun.
  2. Beyni dekapitasyon ile inceleyin, ardından kafatasına orta hat ve önden kesikler yapın.
  3. Beyni ortaya çıkarmak için kafatasını orta hattan ayırın.
  4. Kraniyal sinirleri beynin tabanından ayırmak için ince bir kepçe spatula kullanarak beyni dikkatlice çıkarın.
  5. Diseke edilmiş beyni, soğutulmuş, buz gibi yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF; mM cinsinden: 125 NaCl, 3 KCl, 1.25 NaH2PO4, 1 MgCl2, 2 CaCl2, 25 NaHCO3, 25 glikoz) içeren 100 ml'lik küçük bir behere hızla yerleştirin.
  6. Beyni ACSF'den çıkarın ve ACSF ile önceden ıslatılmış filtre kağıdı ile kaplı bir mikroskop lamına yerleştirin.
  7. Temiz bir tıraş bıçağı kullanarak beynin istenen yönde bloke edici bir kesim yapın.
  8. Beynin tıkalı yüzeyini anında yapıştırıcı kullanarak kesme aşamasına yapıştırın.
  9. Aşamayı bir vibratom kesme haznesine aktarın (kesime hazır olana kadar dondurucuda saklayın).
  10. Buz gibi soğuk ACSF'yi kesme haznesine dökün.
  11. Titreşimli bir doku dilimleyici kullanarak beyin bölümlerini 400-500 μm'de dilimleyin.
  12. Beyin dilimlerini oksijenli ACSF içeren bir tutma odasına aktarın ve deneyden önce en az 1 saat boyunca 30 ° C'de inkübe edin.

3. Fizyolojik Kayıt

  1. İnkübasyon süresinden sonra, modifiye edilmiş bir mikroskop aşamasında bir dilimi bir kayıt odasına aktarın.
  2. Deney sırasında bir platin tel dilim tutucusuna bağlı birkaç iplik Naylon filament kullanarak dilimi banyoya sabitleyin.
  3. Dilimi sürekli olarak ACSF ile perfüze edin.
  4. Aşağıdakileri (mM cinsinden) içeren hücre içi çözelti ile doldurulduğunda kayıt pipetlerini 3-6 MΩ'luk bir uç direncine çekin: 127 K-glukonat, 3 KCl, 1 MgCl2, 0.07 CaCl2, 10 HEPES, 2 Na 2-ATP, 0.3 Na-GTP, 0.1 EGTA. Hücre içi çözelti, KOH veya glukonik asit ile ayarlanmış pH 7.3'e ve 280-290 mOsm ozmolaliteye sahip olmalıdır.
  5. Standart bir görselleştirilmiş tam hücre kayıt kurulumu kullanarak, pozitif basınç22,23 uygularken kayıt pipetini kaydedilecek nöronun yakınına yerleştirin.
  6. Gigaohm contası oluşturmak için emme uygularken pozitif basıncı serbest bırakın.
  7. Membranı kırmak ve tüm hücre konfigürasyon kaydını oluşturmak için kısa bir emme uygulayın.
  8. Nöronların tepkilerini voltaj veya akım kıskacında kaydedin.

4. Lazer taramalı Fotostimülasyon

  1. Önceki raporlarda açıklanan veri toplama yazılımı ve donanımınıbaşlatın 23-29.
    Not: Hem Tidelwave25'i hem de daha yakın zamanda, Matlab'da yazılan ve Janelia Farms30'daki Karel Svboda'nın laboratuvarı tarafından geliştirilen Ephus26 satın alma programlarını kullandık. Ephus'ta lazer taramalı fotostimülasyonun tam bir açıklaması için, bakınız Suter ve ark.26 ve adım adım kılavuz30.
    Not: Bu makalede açıklanan kurulum, Shepherd (2012)23 tarafından açıklanandan türetilmiştir. Lazer ışını, açık bir ayna sistemi aracılığıyla, objektif mercek aracılığıyla mikroskobun üst portuna dilim üzerine yönlendirilir (Şekil 2).
  2. Lazerin küçük bir bölümünü, lazer yoluna yerleştirilmiş bir mikroskop lamel ile bir fotodiyot üzerine yönlendirin ve deneyler sırasında lazer yoğunluğunu izlemek için bu fotodiyottan gelen akım çıkışını kullanın.
    1. Yazılımda kaydedilen fotodiyot akım çıkışını, ekipman kurulumu sırasında bir güç ölçer kullanarak objektifin arka odak düzleminde ölçülen lazer gücüne kalibre edin23.
  3. Değişken nötr yoğunluk çarkını döndürerek lazer gücünü kontrol edin. Deneylerimizde kullanılan lazer gücü 25-70 mW (arka odak düzleminde) arasında değişmiştir.
  4. Lazer ve deklanşör için darbe parametrelerini değiştirerek lazer uyarımının uzunluğunu ve zamanlamasını ayarlayın. Lazer stimülasyonu tipik olarak 2 msn uzunluğundadır.
  5. 'Video Yakala' işlevini kullanarak uyarılacak bölgenin görüntüsünü yakalayın.
  6. İstenen boyutlara göre stimülasyon ızgarasını seçin. Tipik olarak, bitişik satırlar ve sütunlar arasında 80 μm boşluk bulunan 16 x 16'lık bir stimülasyon dizisi kullanırız.
  7. Eşleme ızgarasını elde edilen görüntüyle kaplayın ve x, y ve derece ofsetini istenen konuma ve yöne ayarlayın.
  8. Veri stimülasyonunu ve alımını başlatmak için 'Harita' işlevini etkinleştirin.
  9. Fotostimülasyon uyarılmış yanıtlarının elde edilmesinin ardından, Tidelwave25'teki çevrimdışı harita analiz programını veya Ephus26'daki 'MapAnalysis' programını kullanarak haritalanan verilerin analizini gerçekleştirin.

5. Sabit Dilim Görüntüleme

  1. Kayıtlardan sonra, beyin dilimini gece boyunca 4 ºC'de 0.01 M PBS'de (pH7.4) %4 paraformaldehite (PFA) aktarın.
  2. Dilimi %30 sükroz içinde %4 PFA/0.01 M PBS'de gece boyunca 4 ºC'de aktarın.
  3. Bir kriyostat kullanarak 50 μm'lik kesitler kesin ve 0,01 M PBS'de toplayın.
  4. Bölümleri oda sıcaklığında iki kez 0,01 M PBS'de durulayın.
  5. Bölümleri ve lamel uygun bir antifade ortamına monte edin.
  6. Bölümleri konfokal mikroskoba aktarın.
  7. Beyaz ışığı kullanarak yatırım getirisine odaklanın.
  8. Görüntü elde etmek için dalga boyunu, görüntüleme boyutunu ve tekrarı seçin. YFP için 514 nm (Ex)/527 nm (Em) kullanıyoruz.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Faredeki birincil görme alanı (V1) ile ikincil görsel alan (V2) arasındaki projeksiyonların lazer taramalı fotostimülasyonu, pAAV-CaMKIIa-hChR2(H134R)-EYFP'nin bir Balb/C faresinin V1'ine enjeksiyonlarının ardından gerçekleştirildi (Şekil 3). Bu viral yapıdaki CaMKIIa promotörü, uyarıcı glutamaterjik nöronlarda(1,15) channelrhodopsin-EYFP'nin spesifik ekspresyonunu yönlendirir. Fizyolojik kayıt için dilimlerin hazırlanmasından sonra, channelrhodopsin-EYFP liflerinin ekspresyonu, yani konjuge EYFP'nin epifloresansı, V1'den V2'ye geçerken gözlendi (Şekil 3A). Ek olarak, lateral genikülat çekirdekte (LGN) kortikotalamik lifler de gözlenmiştir (Şekil 3A). V2'deki bir nörondan alınan tüm hücre yama klemp kayıtları, V2'nin alt katmanlarındaki channelrhodopsin-EYFP eksprese eden liflerin lazer taramalı fotostimülasyonunu takiben ortaya çıkan EPSC'leri ortaya çıkardı (Şekil 3B).

Başka bir örnekte, primer somatosensoriyel korteksin (S1) 6. katmanından ventroposterior çekirdeğe (VP) kortikotalamik projeksiyonların lazer taramalı fotostimülasyonu bu protokol kullanılarak gerçekleştirildi. Burada, katman 6 nöronlarında ve ilgilenilen kortikotalamik projeksiyonlarda özellikle channelrhodopsin ekspresyonunu hedeflemek için bir Cre-Lox yaklaşımı kullandık. Açıkça, pAAV-Ef1a-DIO-hChR2 (H134R) -EYFP-WPRE-pA'yı B6'nın S1'ine enjekte ettik. Cg-Tg(Ntsr1-cre)GN220Gsat/Mmcd fareler (Şekil 1 ve 4). Bu transgenik fare suşu, özellikle katman 6 kortikotalamik nöronlarda21 Cre-rekombinazı eksprese eder ve bu nedenle sadece 'floksal' AAV yapısı tarafından transfeksiyonu takiben bu nöronlarda ChR-YFP ekspresyonu ile sonuçlanır. Dilimler hazırlandıktan sonra, tabaka 6 nöronlarında channelrhodopsin-EYFP lifleri ve tabaka 4 ve VP'ye çıkıntı yapan lifler gözlendi (Şekil 4A ve 4B). Tam hücre yama klempi kullanılarak bir VPm nöronundan alınan fizyolojik kayıt, kaydedilen nöronun yakınında lazer taramalı fotostimülasyonun ardından EPSC'lerin ortaya çıkabileceğini ortaya koydu (Şekil 4C ve 4D).

Etiketli liflerin morfolojisi, fizyolojik kayıtların ardından daha kolay değerlendirildi. Burada, 6. tabaka kortikotalamik nöronlarda channelrhodopsin-EYFP ekspresyonu ile (50 μm) kesit preparatları rezeke edildi (Şekil 5). Bu, katman 6'dan katman 4'e geçen, yoğun bir şekilde sonlandırıldıkları ve ağaçlandırıldıkları ince bir etiketli lif modelini ortaya çıkardı (Şekil 5A). Ek olarak, kortikotalamik liflerin beyaz cevhere girdiği ve talamusa doğru geçtiği gözlenmiştir (Şekil 5A ve 5B).

figure-results-1
Şekil 1. Cre-Lox yaklaşımı ile channelrhodopsin'in hedeflenen ifadesinin şematik gösterimi. İlgilenilen nöronal popülasyonlarda Cre-rekombinaz eksprese eden transgenik farelere, YFP gibi bir floresan proteine kaynaşmış channelrhodopsin kodlayan 'floxed' bir virüs enjekte edilir. Transfeksiyonu takiben, sadece Cre-rekombinazlı nöronlar channelrhodopsin-EYFP'yi eksprese edecektir. Resmi daha büyük görmek için buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2. Fotostimülasyon kurulumunun şematik gösterimi. (A) Lazer taramalı fotostimülasyon kurulumunun şeması. Lazer ışını, bir açık ışın sistemi aracılığıyla art arda bir deklanşöre ve bir nötr yoğunluk (ND) filtresine yönlendirilir. Bir lamel ışının bir kısmını lazer gücü ölçümleri için bir amplifikatöre bağlı bir fotodiyota yansıtır. Ayna galvanometreleri, lazer ışınını, ışını mikroskobun üst kısmındaki bir yan porttan geçiren bir tarama merceğinden geçirmek için kullanılır. Işın daha sonra dikroik bir ayna kullanılarak objektif mercekten dilim hazırlığına yansıtılır. Daha fazla ayrıntı için Lam ve Sherman23 ve Shepherd29'a bakınız. (B) Şekil 3'te gösterilen temsili deney için fotostimülasyon ızgara modeli örneği. 16 x 16 stimülasyon ızgarası, dilim hazırlığının bir fotomikrografı üzerine yerleştirilmiştir. Kırmızı bir yıldız, tüm hücre yama kelepçesi kullanılarak kaydedilen bir nöronun yerini gösterir. Lazer ışını konumu, ayna galvanometrelerinin bilgisayarlı konumlandırılmasıyla stimülasyon ızgarasındaki 256 konumun her birine yönlendirilir. 1. 5 stimülasyon bölgesinin lazer pozisyonları şekilde gösterilmiştir. Kaydedilen nörondan her bir bölgede fotostimülasyona verilen yanıtlar Şekil 3'te gösterilmektedir. Resmi daha büyük görmek için buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3. Farede birincil görsel korteksten (V1) ikincil görsel kortekse (V2) kortikokortik projeksiyonların lazerle taranarak fotostimülasyonu. (A) V1'den V2'ye kadar ve lateral genikülat çekirdekte (LGN) channelrhodopsin-EYFP liflerini gösteren dilim preparatının epifloresan görüntüsü. Uyarıcı glutamaterjik nöronlarda channelrhodopsin-EYFP'nin spesifik ekspresyonu, CaMKIIa promotörü içeren viral bir yapı tarafından yönlendirilir. (B) Lazer taramalı fotostimülasyonu takiben V2'deki bir nörondan ortaya çıkan uyarıcı postsinaptik akımlar (EPSC'ler). Kırmızı yıldız, kayıt yerini gösterir. Ölçek çubukları: (A) 500 μm, (B) 200 pA, 100 msn. Resmi daha büyük görmek için buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4. Farede primer somatosensoriyel korteksten (S1) ventroposterior çekirdeğe (VP) kortikotalamik projeksiyonların lazerle taranarak fotostimülasyonu. (A) S1'de channelrhodopsin-EYFP liflerini gösteren dilim hazırlığının epifloresan görüntüsü. (B) VP'deki etiketli liflerin epifloresan görüntüsü. (C) Lazer taramalı fotostimülasyonu takiben bir VP nöronundan ortaya çıkan uyarıcı postsinaptik akımlar (EPSC'ler). (D) Ortalama EPSC'lerin grafiği. Kırmızı yıldız, kayıt yerini gösterir. (C) içindeki kutulu izler, (D) içindeki kutulu değerlere karşılık gelir. Ölçek çubukları: (A) 250 μm, (B) 250 μm, (C) 100 pA, 100 msn. Resmi büyütmek için buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 5. Farenin primer somatosensoriyel korteksinde (S1) channelrhodopsin-EYFP eksprese eden katman 6 nöronlarının görüntülenmesi. (A-B) Katman 6'daki etiketli nöronlar ve katman 4'e ve beyaz maddeye çıkıntı yapan lifler. Ölçek çubukları: (A) 250 μm, (B) 250 μm. Resmi büyütmek için buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Açıklanan protokol, ön beyin devrelerinin, yani talamus ve korteks devrelerinin araştırılmasıyla sınırlı olmayan, nöronal devrelerin fonksiyonel topografyası ve fizyolojisinin in vitro değerlendirmesi için bir yaklaşımı detaylandırmaktadır. Optogenetik transfeksiyon için çeşitli viral yapılar bilim camiasının kullanımına sunulmuştur ve UNC Vektör Çekirdeğinden kolayca elde edilebilir. Kolayca bulunabilen viral yapıların bir açıklaması için, Stanford Üniversitesi32'deki Deisseroth Laboratuvarı'ndaki optogenetik kaynak sayfası olan UNC Vector Core 31'e ve MIT33'teki Boyden sentetik nörobiyoloji laboratuvarına bakın. Bu opsinlerin varyantları bu laboratuvarlar tarafından geliştirilmiştir ve nöronal uyarılabilirliği kontrol etmek için geniş kapsamlı modlar sağlar1,2. Bu vektörlerin UNC Vektör Çekirdeğinden elde edilmesi, kaynak laboratuvarlardan bir Malzeme Transfer Anlaşması gerektirir. Bu protokolde, polibren ilavesinin transfeksiyon etkinliğini arttırdığını not ediyoruz. Ek olarak, ifadeyi etkileyen bir diğer değişken de ameliyat sonrası iyileşme dönemidir ve farelerin ön beyin yollarında sağlam bir ifade elde etmek için en az 14 günlük bir sürenin yeterli olduğunu not ediyoruz.

Spesifik nöronal grupların hedeflenen transfeksiyonu için, geliştirilmiş11 'flokslu' ters çevrilmiş açık okuma çerçevesi viral yapıları ile kombinasyon halinde kullanılabilen birkaç Cre-transgenik fare hattı geliştirilmiştir. Sinirbilim araştırmalarıyla ilgili çeşitli suşlar, Mutant Fare Bölgesel Kaynak Merkezleri34 aracılığıyla edinilebilir. Bu transgenik hatlardaki Cre-rekombinaz ekspresyon paternlerinin atlasları, GENSAT veritabanı35 aracılığıyla sunulmaktadır. Ek olarak, Jackson Labs, belirli nöronal gruplarda opsinleri yapısal olarak eksprese eden diğerlerinin yanı sıra birkaç Cre-transgenik suş sunar. Bu fare hatlarını kullanmanın kritik bir adımı, bir üreme kolonisi elde etmek ve kurmak için gereken süreyi hesaba katmaktır ve bu, ilgilenilen türe göre değişebilir.

Fotostimülasyon için, Northwestern Üniversitesi'ndeki Shepherd Lab tarafından geliştirilen ve yakın tarihli bir protokol29'da açıklanan kurulumu kullandık ve uyarladık. Glutamat kafesinin açılması için optimize edilmiş olmasına rağmen, bu kurulum, modifikasyon yapılmadan channelrodopsin'in fotostimülasyonu için de uygundur. Bu kurulum, kaydedilen nöronların channelrodopsin innervasyonunun fonksiyonel topografyasının değerlendirilmesini sağlayan fotostimülasyon lokuslarının hassas uzamsal kontrolünü ve konumlandırılmasını sağlar. Uzamsal kontrol, bu fotostimülasyon yöntemiyle geliştirilmiş olsa da, LED tabanlı alan aydınlatması20 kullanan yöntemlerden daha uygun maliyetlidir. Ek olarak, beyin dokusunun tekdüze olmaması, optogenetiğin veya ışığın manipülasyonunu içeren herhangi bir tekniğin bir sınırlamasıdır. Ancak pratikte, sonuçlar çoğunlukla niteliksel bir şekilde yorumlandığı için nadiren bir faktördür. Beyin bölgeleri arasında daha niceliksel karşılaştırmaya ihtiyaç duyulması durumunda, "doymuş" tepkiler elde etmek için her zaman maksimum ışık yoğunluğu kullanılabilir.

Ek olarak, lazer taramalı fotostimülasyonu kontrol etmek ve veri toplamak için Matlab'da yazılmış hem Tidelwave hem de Ephus yazılım programlarını kullandık25,26. Bununla birlikte, benzer bir sistem kuranların, Janelia Farms geliştirme sitesi30 aracılığıyla sağlanan desteğe sahip daha yeni Ephus yazılımı26'yı kullanmaları önerilir. Önemli bir adım, donanım gereksinimleri biraz farklı olduğundan, bu yazılım paketlerinden hangisinin kullanılacağını seçmektir. Ek olarak, harita analiz programları ilgili veri toplama programlarına göre uyarlanmıştır.

Bu adımların birçoğu, uygulayıcının özel kurulumuna uyacak şekilde değiştirilebilir. Viral solüsyonların enjeksiyonları, bir şırınganın yanı sıra dağıtım mekanizmalarıyla da gerçekleştirilebilir, örneğin ~40 μm'lik uç çaplarına çekilen kılcal cam pipetler de iyi çalışır. Ameliyatlar için, enjeksiyonları yönlendirmek için bu tür koordinatlar gerekli değilse, stereotaksik olmayan bir başlık ikame edilebilir. Ek olarak, ACSF ve hücre içi çözelti bileşimleri, belirli deneysel gereksinimlere bağlı olarak değiştirilebilir, örneğin inhibitör akımları izole etmek için bir sezyum veya yüksek klorürlü hücre içi çözeltinin ikame edilmesi. Ayrıca, sabit dilimlerdeki ekspresyon paternlerinin görüntülenmesine bir alternatif, banyo perfüzyon sistemine sahip uygun bir görüntüleme teçhizatında canlı dilimde de yapılabilir.

Özetle, bu protokol, uygulayıcının, standart yöntemler kullanılarak mümkün olmayabilecek in vitro projeksiyonların fonksiyonel topografyasını ve sinaptik fizyolojisini karakterize etmesini sağlayacaktır, örn. bir dilimde korunamayan uzun menzilli projeksiyonları karakterize etmek. Açıklanan transfeksiyon protokolü, dağıtım mekanizması aynı olduğu için in vivo optogenetik deneyler1-3,12,14'e uygulanabilir. Son olarak, bu protokol farelerin transfeksiyonunu tanımlasa da, mevcut viral vektörlerin çoğu, bu opsinleri çok çeşitli memeli türlerinde teorik olarak transfekte etmek ve eksprese etmek için kullanılabilir, böylece sayısız karşılaştırmalı ve türe özgü çalışma1-3'e olanak tanır.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, rekabet eden çıkarları olmadığını beyan ederler. Yazar (CCL), bu protokolün bu filme alınmasında kullanılan bir enstrümanı üreten Leica Microsystems'den bir yayın hibesi aldı.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, NIH/NIDCD hibesi R03 DC 011361, SVM CORP hibe LAV3202, NSF-LA EPSCoR hibe PFUND86 ve Leica Microsystems'den (CCL) bir yayın hibesi ve NIH/NIDCD hibesi R01 DC 008794 (SMS) tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
PolybreneSanta Cruz BiotechSC134220
Paraformaldehit %32 çözeltiEMS15714
VECTASHIELDVektör LaboratuvarlarıH-1400
AAV viral yapılarıUNC Vektör ÇekirdeğiNA
Fare stereotaktik kafa tutucuStoelting51730
Nanocool enjektörHarvard Aparat703040
UV lazer: 355 nm, Nd:YVO4; 1 W;DPSS Lasers, Inc3500
GalvonometrelerCambridge Tarama6210
aynalarCambridge Tarama6m2003S-A
montajCambridge Tarama6102103L
kabloCambridge Tarama6010-19-120
sürücü/denetleyiciCambridge Tarama67121-1
Deklanşör - ZM kaplamalı (UV uyumlu)UniblitzL23-ZM2
Deklanşör Kontrol CihazıUniblitzVMM-D1
Akım AmplifikatörüStanford Araştırma SistemleriSR570
6713 kartıUlusal Aletler777741-01
2110 koparma kutusuUlusal Aletler777643-01
PCI-MIO-16E-4Ulusal Aletler777383-01
BNC-2090Ulusal Aletler777270-01
KablolarUlusal Aletler184749-01
MATLABMathworks
TCS SP2Leica Microsystems

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nat. Rev. Neurosci. 13, 251-266 (2012).
  2. Bernstein, J. G., Boyden, E. S. Optogenetic tools for analyzing the neural circuits of behavior. Trends Cog. Sci. 15, 592-600 (2011).
  3. Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71, 9-34 (2011).
  4. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 13940-13945 (2003).
  5. Zemelman, B. V., Lee, G. A., Ng, M., Miesenbock, G. Selective photostimulation of genetically ChARGed neurons. Neuron. 33, 15-22 (2001).
  6. Gradinaru, V., Thompson, K. R., Deisseroth, K. eNpHR: a Natronomonas halorhodopsin enhanced for optogenetic applications. Brain Cell Biol. 36, 129-139 (2008).
  7. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. M. illisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity. Nat. Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).
  8. Lanyi, J. K. Halorhodopsin: A light-driven chloride ion pump. Ann. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 15, 11-28 (1986).
  9. Han, X., Boyden, E. S. Multiple-color optical activation, silencing, and desynchronization of neural activity, with single-spike temporal resolution. PLoS One. 2, (2007).
  10. Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodpsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nat. Methods. 8, 745-755 (2011).
  11. Madisen, L., et al. A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-induced activation and silencing. Nat. Neurosci. 15, 793-802 (2012).
  12. Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annu. Rev. Neurosci. 34, 389-412 (2011).
  13. Gradinaru, V., Mogri, M., Thompson, K. R., Henderson, J. M., Deisseroth, K. Optical deconstruction of parkinsonian neural circuit. Science. 324, 354-359 (2009).
  14. Olsen, S. R., Bortone, D. S., Adesnik, H., Scanziani, M. Gain control by layer six in cortical circuits of vision. Nature. 483, 47-52 (2012).
  15. Zhang, F., et al. Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing mammalian brain structures. Nat. Protoc. 5, 439-456 (2010).
  16. Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections. Na. Neurosci. 10, 663-668 (2007).
  17. Cruikshank, S. J., Urabe, H., Nurmikko, A. V., Connors, B. W. Pathway-specific feedforward circuits between thalamus and neocortex revealed by selective optical stimulation of axons. Neuron. 65, 230-245 (2010).
  18. Lee, C. C., Lam, Y. W., Sherman, S. M. Intracortical convergence of layer 6 neurons. Neuroreport. 23, 736-740 (2012).
  19. Mancuso, J. J., et al. Optogenetic probing of functional brain circuitry. Exp. Physiol. 96, 26-33 (2011).
  20. Valley, M., Wagner, S., Gallarda, B. W., Lledo, P. Using affordable LED arrays for photo-stimulation of neurons. J. Vis. Exp. (57), (2011).
  21. Gong, S., et al. Targeting Cre recombinase to specific neuron populations with bacterial artificial chromosome constructs. J. Neurosci. 27, 9817-9823 (2007).
  22. Cox, C. L., Sherman, S. M. Control of dendritic outputs of inhibitory interneurons in the lateral geniculate nucleus. Neuron. 27, 597-610 (2000).
  23. Lam, Y. W., Sherman, S. M. Mapping by laser photostimulation of connections between the thalamic reticular and ventral posterior lateral nuclei in the rat. J. Neurophysiol. 94, 2472-2483 (2005).
  24. Lam, Y. W., Sherman, S. M. Functional organization of the somatosensory cortical layer 6 feedback to the thalamus. Cereb Cortex. 20, 13-24 (2010).
  25. Shepherd, G. M., Pologruto, T. A., Svoboda, K. Circuit analysis of experience-dependent plasticity in the developing rat barrel cortex. Neuron. 38, 277-289 (2003).
  26. Suter, B. A., et al. Ephus: multipurpose data acquisition software for neuroscience experiments. Front Neural Circuits. 4, (2010).
  27. Lee, C. C., Sherman, S. M. Topography and physiology of ascending streams in the auditory tectothalamic pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 372-377 (2010).
  28. Lee, C. C., Sherman, S. M. Intrinsic modulators of auditory thalamocortical transmission. Hear Res. , 287-2843 (2012).
  29. Shepherd, G. M. Circuit mapping by ultraviolet uncaging of glutamate. , Cold Spring. 998-1004 (2012).
  30. ScanImage, Ephus, and other DAQ software [Internet]. , Janelia Farms. Ashburn (VA). Available from: http://www.ephus.org (2003).
  31. UNC Gene Therapy Center [Internet]. , University of North Carolina. Chapel Hill (NC). Available from: http://genetherapy.unc.edu/services.htm (2003).
  32. Optogenetics Resource Center [Internet]. , Stanford University. Stanford (CA). Available from: http://www.stanford.edu/group/dlab/optogenetics (2003).
  33. Synthetic Neurobiology Group [Internet]. , MIT. Cambridge (MA). Available from: http://syntheticneurobiology.org (2003).
  34. Mutant Mouse Regional Resource Centers [Internet]. , NIH. Bethesda (MD). Available from: http://www.mmrrc.org (2003).
  35. GENSAT Brain Atlas [Internet]. , NIH. Bethesda (MD). Available from: http://www.gensat.org/cre.jsp (2003).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Optogenetic TargetingChannelrhodopsin ExpressionWhole cell Patch ClampConfocal MicroscopyViral TransfectionCre lox RecombinationSlice PreparationFunctional TopographySynaptic Properties

İlgili makaleler