Yöntem makalesi

Bir olarak beyin mikrovasküler endotel hücreleri (cend) olarak gerin

16.7K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/50928

⸱

26 Ekim 2013

 ,  , 
1Klinik und Poliklinik für Anästhesiologie, Zentrum für operative Medizin der Universität Würzburg, 2Department of Medicinal Chemistry, Faculty of Life Sciences, University of Vienna

Bu makalede

Özet

In vitro travmatik beyin hasarı modelleri in vivo beyin deformasyon yeniden geliştirilmektedir. Streç-kaynaklı yaralanma astrositleri, nöronlar, glial hücreler, aort ve beyin endotelyal hücreler için kullanılmıştır. Ancak sistemimiz in vitro TBI modelinde kurmak için BBB meşru bir modeli oluşturan özelliklere sahip bir kan beyin bariyeri (KBB) modeli kullanır.

Özet

Travmatik beyin hasarı (TBI), bir daha bu sürece dahil olan altında yatan mekanizmalar sağlayacak yöntemlerin getirdiği yüksek ölüm olayı nedeniyle tedavi etmek için yararlıdır. In vivo ve bu amaçla kullanılabilir in vitro yöntemler de vardır. Bu TBI sırasında oluşur gibi in vivo modeller gerçek kafa travması taklit edebilir. Ancak, in vivo teknikleri hücre fizyolojisi düzeyinde çalışmalar için yararlanılamaz. Bu düzenleme için, hücreler ve hücre dışı ortama daha kolay erişim sağlamak beri Dolayısıyla, in vitro yöntem, bu amaç için daha avantajlıdır.

Bizim protokol beyin mikrovasküler endotel hücreleri TBI'dan kullanılarak streç yaralanma bir in vitro model sunmaktadır. Bu esnek dipli bir kuyu kültürlenen hücrelere uygulanan basınç kullanır. Basınç kolaylıkla kontrol edilebilir uygulanan ve düşük şiddetli aralıkları bu hasara neden olabilir. SıçangilLaboratuvarımızda oluşturulan beyin mikrovasküler endotel hücreleri (cend) böylece benzer bir teknik istihdam diğer sistemler için bir avantaj sağlayan kan beyin bariyeri (KBB) için çok uygun bir modeldir. Buna ek olarak, yöntem, basitliği nedeniyle, deney grubu-up kolayca çoğaltılır. Dolayısıyla, bu model BBB TBI dahil hücresel ve moleküler mekanizmalarının incelenmesi de kullanılabilir.

Giriş

Travmatik beyin hasarı (TBI) dünya çapında önde gelen ölüm nedenlerinden biridir. Yaklaşık 10 milyon insan önemli bir sağlık ve tıbbi sorunu 1 yaparak TBI tarafından yıllık olarak etkilenir. Bu nedenle, in vivo ve in vitro TBI modellerinde çeşitli kurulan ve mekanizmaları 2,3,4 incelemek için geliştirilmiştir. TBI daha iyi anlaşılması, hasta tedavisi geliştirmek ve ilgili mortalite, morbidite ve maliyet azaltmak yardımcı olabilir edilmiştir.

In vivo ve in vitro yöntemler hem kullanmak beyin hasarı için birçok model var. Vivo modellerde kafa travması gerçek olay taklit olabilir. Ancak, in vivo durumda karmaşıklığı, ilgi dokuya erişilebilirlik nedeniyle 2 sınırlı olur. Vurulur hasarının bir sonucu olarak, tek tek hücrelerin fizyolojik tepki anlamada, bu hücrelerin izole edilmesi önemlidir sistemik etkileri hangikendi cevap 5 inhibe veya değiştirebilir. Bu nedenle, travma hücre modellerinin hücrelerin mekanik ortamı tam 6 kontrol edilebildiğinden dolayı, hayvan modelleri üzerinde önemli avantajlar sağlar.

Yaralanma Böyle bir yöntem ile oluşturulan değişikliklerini saptamak için hücreler veya dokular, mekanik yükün kullanımı istihdam in vitro sistemler geliştirilmiştir. Örneğin, hücreler, mekanik hasar etkisini incelemek için bir yöntem astrositleri, nöronlar, glial hücreler ve aortik endotel hücreleri 7,8,9 kurulmuştur. Kemirgen ve bizim model için kullandığınız aynı bir basınç kontrol cihazı kullanılan insan astrosit Tepkime 10 çalışma için kurulan in vitro travma modelinde. Aynı yöntem, fare beyin mikrovasküler endotelyal hücreleri (bEnd3) 11 ve kortikal nöronlar gibi 12,13 yanı sıra, beyin endoth gerilme ile hasara yol uygulandıYeni doğmuş domuz 14 elial hücreler. cihaz böylece mekanik gerilme yaralanması 10 üretiminde de kültür alt deforme eder. Bu hücreler üzerinde hava basıncı uygulanması ile kültürlenmiş hücreler üzerinde hasar uğratan. Bu basınç, böylece hücreler uzanan, hücreler artan edildiği membran saptırmak olabilir. Streç çeşitli derecelerde (", yani" düşük ", orta" ya da "ağır) uygun şekilde hava basıncı darbe süresi ve yoğunluğu ayarlayarak elde edilebilir. Esnetilebilir-kaynaklı yaralanma Bu yöntem, in vivo 7 travması ile ilişkili olmuştur. Dahası , yaralanma bu yöntem, hücre dışı ortamın hassas kontrolünü sağlar ve kolay bir şekilde çoğaltılabilir.

Benzer bir yaklaşım, bEnd3 de dahil olmak üzere pek çok diğer beyin hücre türleri için kullanılabilir olmasına rağmen, bizim modeli fare beyin mikrovasküler endotel hücre (cend) oluşturulur kılan bir avantajdırLaboratuvarımızda. Bu hücre hattı, kan beyin bariyeri (KBB) bir çok uygun bir modeldir. BBB model olarak kullanılan in vitro hücre kültürlerinde onları geçirgenliği ekran olarak hizmet sağlayacak özelliklere sahip olmalıdır. KBB geçirgenliğinin bir belirleyici olarak in vitro hücre modelinde için önemli bir kriter fizyolojik gerçekçi hücre mimarisi 15 sahip gerektiğidir. BEnd3 hücreleri görüntülemek rağmen farklı iğ gibi onlar yerine fibrin jel 17 düzenli tübüler yapılar daha kist benzeri boşluklar oluşturur sayede kültür 16 skuamöz morfolojisi, onlar in vitro düzensiz morfogenetik davranışlar. Ayrıca, hücreleri embriyonik ve yeni doğmuş farelere enjekte edildiğinde, bunlar ancak yeni doğmuş ve genç farelerde embriyonik mice öldürücü hızlı büyüyen tümörlerin neden olmuştur. Bu nedenle, normal endotelyal büyüme, göç, ve farklılaşma yöneten bir veya daha fazla işlem değiştirilmiş veya elimine edilmiş önerilmektedirBu hücre hattı, 18 ed. Öte yandan, endotelyal ve BBB işaretleyici ifade, biyo ve paraselüler akı ölçümlerini morfolojik, immünositokimyasal değerlendirme eden BBB modeli cend gerçekten BBB 19 uygun bir model olduğunu göstermektedir.

In vivo olarak beyin endotel trans-endotel elektrik direnci (TEER) Ωcm 2 2,000-5,000 kadar olan son derece sıkı bir geçirgenliği ile karakterize edilir. Ilaç, beyin mikrovasküler bariyer özelliklerini çalışmaları için, hücreler arasında paraselüler sıkılık ve sızdırmazlık dikkate alınmalıdır. En çok beyin kapiller endotel hücreleri (BCEC), bu hücreler sergi TEER 50-100 Ωcm 2 20 arasında değişen olarak korunur. Ölümsüzleştirilmiş beyin endotelyal hücre hattı bEnd3 hiçbir büyük 15 2 Ωcm 60 den daha TEER değerleri oluşturur. Ihtiva eden ortam ile cend hücrelerinin aksine farklılaşma serum ekran azaltılmış300-500 Ωcm 2 19,21 arasında değişen TEER değerleri.

Bugüne kadar, kültür beyin endotelyal hücrelerinde streç yaralanma in vitro modeller azdır. Bu nedenle, BBB modeli olarak hareket kültürlü beyin endotel hücreleri kullanarak gerilme yaralanması ile travma için bir in vitro model yararlı olduğunu kanıtlayabilir. Bu protokol, beyin hücreleri, BBB özellikle beyin mikrovasküler endotel hücreleri, TBI alınan kabul edilmiş gerçek etkisi taklit ederek bir in vitro model sunuyoruz. Bu modelin avantajı yaralanma miktarı hücreleri hem de hücre dışı ortamda kolayca deneysel kurulum kolay tekrarlanabilirlik sağlayan hassas bir şekilde kontrol edilebilir uygulanabilir olmasıdır.

Protokol

1. Peki Tabaklar içine Endotel Hücreleri tohum

  1. Izdiham ulaşılana kadar, iki kez ortamı (DMEM,% 10 FCS, 50 U / ml penisilin / streptomisin,% 1 L-glutamin ihtiva eden) bir hafta değiştirme, T75 kültürü şişesi fare beyin mikrovasküler endotel hücreleri (cend) yetiştirilir. (.; Förster ve diğerleri, 2005 21.19. Beyin mikrovasküler endotel hücrelerinin üretimi ve ölümsüzleşme için, burek ve arkadaşları, 2012 e bakınız).
  2. Fosfat hücrelerin yıkayın tuzlu su (PBS). PBS çıkarın ve 2 ml ılık tripsin-EDTA çözeltisi ile hücrelerin trypsinize.
  3. Hücre tabakası dağılana kadar 5 dakika boyunca ya da 37 ° C 'de inkübe hücreleri.
  4. Hücrelere 8 ml kültür ortamı ekleyin. Hücreleri ayırmak için şişeyi birkaç kez dokunun.
  5. Şişesi tam dekolmanı sağlamak için mikroskop altında hücreleri göster.
  6. Müstakil hücreleri yukarı ve aşağı ile pipet orta. Hücre suspensi karıştırmak için girdap şişeyiüzerinde.
  7. , Hücre süspansiyonu 20 ul alın Hemasitometre koymak ve hücrelerin sayısını.
  8. Hücre yoğunluğu ve tohum 20.000 hücre / kuyu içine cm2 belirler.
  9. Collagen1 hücre süspansiyonu içine aktarın, 3 ml / iyi bir toplam hacim içinde 6-esnek dipli bir kültür plakaları (57,75 cm 2) önceden kaplanmış. Her iyi 9.62 cm 2 lik bir alana sahiptir.
  10. Birleşik kadar bir hafta boyunca 37 ° C'de hücreleri büyütün. Haftada iki kez kültür ortamı değiştirin.

2. Önce Stretch bağlı Sakatlık hücre farklılaşması

  1. Farklılaşma ortamı (DMEM, serum soyulmuş fetal dana serumu (ssFCS)% 1, 50 U / ml penisilin / streptomisin içeren) ile, hücre kültür ortamı değiştirin.
  2. 24 saat boyunca 37 ° C'de inkübe hücreleri.

3. Endotel Hücreleri esnetilebilir-kaynaklı yaralanma

  1. Hücre hasarı kontrol cihazı açın.
  2. 50 msn için gecikme ayarlayın.
  3. Regülatör basıncı 15 psi olarak ayarlayın ve kayıtlı tepe basıncı stabil hale gelinceye kadar tetiği birkaç kez basın.
  4. Istenen değere regülatör basıncını ayarlayın. Gerilme yaralanması, çeşitli derecelerde üretmek için bir kılavuz olarak Tablo 1 kullanın.
  5. Tepsi tutucu içine 6-iyi esnek tabanlı bir kültür plaka (57.75 cm 2) yerleştirin. De seçici doğru iyi boyutu (yani büyük bir iyi) olarak ayarlanmış olduğundan emin olun.
  6. Sıkıca aşkın adaptörü yerleştirin. Öte yandan tetiği iter ise bir elinizle sıkıca yerine fişi tutun.
  7. Oluşturulan tepe basıncı kaydedin.
  8. Hemen zaman istenilen uzunlukta için 37 ° C inkübatör geri plaka koymak veya deney veya değerlendirme başarı için hemen kullanın.

4. Boya Alımı Testi ile Stretch Yaralanma Değerlendirilmesi

  1. Hücrelerin str alındıktan hemen sonra,kazınmış (adım 3.7), canlılığı leke bir 1 mg / ml solüsyon 30 ul eklediğiniz hücre kültür ortamı (Not bir sitotoksisite işaretleyici (malzeme ve ekipman ek tabloya bakınız lütfen) gibi davranır: boya çözüm 10 ul ) hücre kültür ortamı, her ml için kullanılacak.
  2. Hücrelere boya ilavesi üzerine, hemen bir floresan mikroskobu altında görüntüle.

5. Laktat Dehidrogenaz tarafından Stretch Yaralanma Değerlendirme (LDH) Sürüm

  1. Hemen hücrelerinin (adım 3.7) gerilmesinden sonra, iyi bir hücre kültür ortamı, 200 ul çıkarın. Eğer LDH sürümü sizin soruşturma dahil etmek istiyorum her zaman noktası sonrası yaralanma için de yapın (yani örneğin 30 dakika, 1 saat, 2 saat, vb.)
  2. Herhangi bir hücre kalıntılarını uzaklaştırmak için 5 dakika boyunca bir mikro bölgesinin yüksek ayarda hücre kültürü ortamı santrifüjleyin. Süpernatantı ve sonraki adımları için kullanabilirsiniz.
  3. Eğer h kezave adım 5.1 bitmiş ve size, araştırmak LDH tahlil kiti (malzeme ve ekipman ek tabloya bakın) dahil lizis çözüm kullanarak hücrelerin lyse istiyorum çeşitli zaman noktalarından istiyorum gerekli örnekleri almış.
  4. Kit sağlanan bir 96-kuyu plaka her iyi tahlilinde Kitto dahil tahlil ortamı 100 ul koyun.
  5. Deney kiti içinde yer alan bir 96-kuyu plaka iki paralel kuyulara hücre içermeyen hücre kültürü aracı maddesi içinde 100 ul koyun.
  6. 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe plakası.
  7. 492 nm'de absorbansı okumak.

Sonuçlar

Kollajen kültüre Hücreler ben hücre sedye cihaz kullanarak streç yaralanma çeşitli derecelerde maruz kaldılar 6-iyi esnek dipli kültür plakaları (57.75 cm 2) kaplanmış. Yaralanma hücreleri tabi sonra, hücre morfolojisi için streç bağlı yaralanma etkilerini mikroskop altında incelendi. Bu esneme gibi daha yüksek derecede hücre bozulma daha büyük bir ölçüde de gözlenebilir hücreleri (Şekil 1) uygulandı olduğu gözlenmiştir. Şekil 1A gösterildiği, yaralanma tabi değildi kontrol hücreleri hücre şişme veya bozulma dair herhangi bir gösterge olmadan düzenli olarak şeklinde serebrovasküler endotel hücreleri (cend) görünür. Gerilme yaralanması uygulandı zaman (Şekil 1B-D), deformasyon ışık mikroskobu altında gözlenebilir. 3.5-4.5 psi arasında bir tepe basıncı ile ciddi hücreleri germe sonra cend hücreler belirgin bir şekilde, geri çekilmiş ve şişmiş ile değil deforme çıktı mümkün arası boşluk. Buna ek olarak, leke canlılığı (100 nM nihai konsantrasyon) alımından da streç yaralanma derecesi (Şekil 2) arttıkça artış göstermiştir. Canlılığı kullanılan leke hücrelerin plazma membran bütünlüğü tehlikeye zaman geçirgen hale sağlıklı hücrelere bir boya geçirgenliği olup. Boya gerilmiş hücreleri (Şekil 2B-D) ile karşılaştırıldığında, bu nedenle, hücrelerin sadece birkaç (Şekil 2A) ile boyandı, kontrol hücrelerinin çoğu çıkarıldı. Daha fazla hücre streç yaralanma artan derecesi ile yeşil fluoresced.

Laktat dehidrogenaz yaralanma, serbest (LDH) bir biyokimyasal belirteç olarak enzimin aynı zamanda üretici talimatlarına göre incelenmiştir. Şekil artan hücre streç yaralanma artan LDH serbest neden olduğu 3 gösterir.

"928/50928fig1.jpg" width = "500px />
Şekil 1. Normal vs yaralı hücrelerin ışık mikroskobu incelemesi. (A) Normal gerilmemiş birleşik hücre tek tabaka istightly dolu ve uzamış. Hücreler daha az kompakt görünür 1.8-2.0 psi (yani düşük streç) bir tepe basınç darbe uygulayarak gergin edildiğinde, boşluk oklar (B) ile gösterilir. Hücreleri orta bir 2.5-3.0 tepe basınç darbe ile yaralandı, bazıları şişmiş ve (C) deforme çıktı. Hücreleri gibi ok (D) ile gösterilen 3.5-4.5 psi, şiddetli streç ile geri çekilmiş olur. 100X büyütme. Büyük resim görmek için buraya tıklayın .

figure-results-1
Şekil 2. Kalsiyum flüorürüNormal vs yaralı hücrelerin çeşitli teda mikroskobik inceleme yaralanma sonrası canlılığı leke 2 hr ile tedavi Hücreleri A: kontrolü gerilmemiş hücreleri BD: gergin hücreleri (B - düşük, C - orta, D - ağır).... 100X büyütme. Büyük resim görmek için buraya tıklayın .

figure-results-2
Şekil 3,. Streç yaralanma sonrası süpernatantı laktat dehidrojenaz (LDH) enzim salınması. LDH kültür ortamına salınan gerilme kaynaklı yaralanma sonrası çeşitli zaman aralıklarında ölçüldü. LDH, toplam serbest bırakılabilir LDH (ortam artı hücre LDH) bir yüzdesi olarak ifade edildi. Değerler ± SEM bulunmaktadır. Her bir zaman noktası için n 0 saat v haricinde 5'tiralue n = 3, şiddetli streç tabi tutulmuştur. Düşük ve orta streç maruz kaldılar hücrelerden LDH serbest gerilmemiş kontrollerin bundan ve birbirinden anlamlı fark yoktu. Ciddi bir şekilde gerilmiş olan hücreler 1 saat de orta uzatılmış numune hariç diğer tüm numuneler, LDH ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde daha büyük bir miktarda serbest bırakıldı. (P <0.05, bir faktör ANOVA, Holm-Sidak yöntemi). büyük resim görmek için buraya tıklayın .

Tablo 1. Streç yaralanma değişik derecelerde üretmek için Kılavuzu.

Regülatör Basınç Tepe Basıncı Yaralanma derecesi
15 psi 1.2-1.5 psi
20-25 psi 1.8-2.0 psi Düşük
30-35 psi 2.5-3.0 psi Orta
40-50 psi 3.5-4.5 psi Ağır
60 psi 4,8-6,0 psi > Şiddetli

Tartışma

Astrositleri, nöronlar, glial hücreler ve aortik endotel hücreler 8, 9, 22 in vitro olarak mekanik hasar etkileri incelenmiştir ve yöntem kurulmuştur. Hala kültürlenmiş beyin endotelyal hücrelerinde streç yaralanma in vitro model bilinmektedir Ancak şimdiye kadar, yoktur. Travma Hücresel modelleri hücrelerin mekanik ortamı tam 6 kontrol edilebildiğinden dolayı, hayvan modelleri üzerinde önemli avantajlar sağlar. Bu nedenle, bir kültür endotel beyin hücreleri kullanarak gerilme yaralanması ile travma için in vitro model böyle bizim protokol hediyeler yararlı olduğu ortaya çıkabilir ne gibi kan beyin bariyeri (KBB) modeli olarak hareket.

Bu protokol cend hücrelerin kullanımı, laboratuvarımızda kurulu bir BBB modeli yapar. BBB arıza genellikle TBI hastalarda belgelenmiştir ve TBI genellikle ödem oluşumu 23, 24 neden olabilir BBB bozulması ile bağlantılı olduğundan, yöntem presBurada özellikle ented TBI ile ilgili olarak BBB yürütülmesinde kullanılan olabilir.

Bu modelde, bu streç yaralanma derecesi hücrelerine uygulanan ne kadar dikkat çekmek için önemlidir. Hücreler, herhangi bir durumda, ve uygulanan basınç ne olursa olsun miktarı ile yaralandı kadar olarak, endotel hücreleri etkileyebilir yaralanma derecesi diğer hücre tiplerinde de son derece çok farklıdır. Aort endotel hücreleri astrositlerin veya karışık glial hücreler 9 daha yaralanma germek için daha dayanıklıdır. Diğer hücre tipleri ile karşılaştırıldığında ek olarak, yaralanma sonrası daha hızlı onarım. Bu nedenle, beyin endotelyal hücrelerinde, özellikle cend hücreleri, streç yaralanma daha büyük bir miktarda bir yaralanma yüksek derecede üretmek için gereklidir. Bir Tablo 1 'de gösterilen ilgili basınç uygulayarak yaralanma istenilen ölçüde elde olabilir. Cend hücreler için, ancak, ciddi yaralanma zorlanma onların direnci nedeniyle tercih edilir. LDH yapılan deneyler göstermiştirstreç artar derecesi olarak, daha fazla LDH süpernatanı içine salgılanır. Bunun aksine, gerilme yaralanması, düşük miktarda verilen hücreler kontrol etmek için benzer bir miktarda LDH üretti. Protokolde belirtildiği gibi, bir orta, uygun miktarda ortam miktarında bir artış veya azalma yuvalara uygulanmış tepe basıncı farklılıklara neden olabilir çünkü kullanılan dikkat edilmelidir. 45 psi basınç uygulandığında boş de 3.8 psi'lik bir ortalama kaydeder Örneğin, bir sıvı de içeren 5 ml 4.0 psi ortalama bir tepe basıncı kaydeder. Bu nedenle, elde edilecek tepe basıncı istenen miktarına karşılık gelen sağlamak için iyi bir kontrolü üzerinde tetikleyici birkaç kez itmek için en iyisidir.

Deneylerimizde bir canlılığı, hücre zarının geçirgenliği streç etkisini belirlemek için leke kullanılır. Kullandığımız esnek dipli kültür plakaların optik bize vi sağlarew doğrudan mikroskop altında boyanan hücrelerin. Ancak, bir doğrudan streç-yaralanma sonrası immünoişaretleme çalışmalar yapmak istediğinde, zorluklar ortaya çıkabilir. İlk olarak, plaka boyutu ve kalınlığı bazı mikroskop görüntüleme platformları ile ilgili bir sorun oluşturabilir. İkincisi, kuyunun esnek membran optik görüntüleme temizlemek için bir engel olabilir.

Yukarıda belirtilen sınırlı rağmen, tarif edilen prosedüre BBB in vitro mekanik yaralanmaya için bir model olarak kullanılabilir. Travmatik beyin hasarı (TBI) olmak üzere iki bileşen, iskemi ve travma içerir. İskemi düşük kan basıncı ya da beyin sonucu çıkan ciddi kan kaybı olduğunda örnekleri TBI'dan ardından beyne oksijen kaynağını şişkinlik sınırlayan ikinci bir yaralanma olarak oluşabilir. Bu yaralanma 25 şu anda başlatılan ardışık patolojik süreçleri temsil eden bir gecikmiş, Mekanik olmayan hasar olarak kabul edilir. Hipoksi bir oluşumuFrangoulis ciddi travmatik beyin hasarı sık 26 olduğunu. Oksijen glikoz yoksunluğu (OGD) güncel in vitro modeli iskemi için kullanılan bir yöntemdir. Bu nedenle, germe sonra hücreler için ikincil bir hakaret olarak OGD hücre tabi iskeminin ardından TBI sıklığı taklit edebilir. Bu nedenle, bir in vitro modelinin mevcut geliştirmek TBI ve mümkün olduğunca yakın gerçek bir TBI için in vivo olarak ortaya çıkar deseni, gelecekte daha da gerilme travması ile bir arada OGD kullanacaktır.

Açıklamalar

Çıkar çatışması ilan etti.

Teşekkürler

Bu araştırma Hibe sözleşmesi No SAĞLIK-F2-2009-241778 için altında hibe sayısı FO 315/4- altında Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Alman Araştırma Vakfı) ve Avrupa Birliği Yedinci Çerçeve Programı (FP7/2007-2013) tarafından desteklenmiştir CF.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Hücre Yaralanması Kontrol Cihazı IIÖzel Tasarım ve İmalat, Virginia, ABD&nbsp;
Bioflex Kültür Plakası - Kollajen Tip IFlexcell, Dunn LabortechnikBF - 3001C 
Dulbecco' s değiştirilmiş Kartal' s orta (DMEM)Sigma-AldrichD5796 
Fetal Buzağı Serumu (FCS)PAA LaboratuvarlarıA15110-1333nihai konsantrasyon %10, ısıyla inaktive edilmiş (56 ° C'de 30 dakika; C)
L-glutaminBiochrom AGK0282Depolama: ≤ -15 & derece; C
MEM VitaminBiochrom AGK0373Depolama: ≤ -15 & derece; C
Na-piruvatBiochrom AGL0473 
Esansiyel olmayan amino asitler (NEA)Biochrom AGK02934 °C'de depolama; C
Penisilin / StreptomisinBiochrom AGA2212Depolama: ≤ -15 & derece; C
Fetal Buzağı Serumu, kömürden sıyrılmış (ssFCS)Life Technologies12676-011 
Tripsin-EDTA çözeltisiPAA LaboratuvarlarıL11-004Depolama: ≤ -15 & derece; C
Image-iT DEAD GreenLifeTechnologies I10291Depolama: ≤ -15 & derece; C, ışıktan korumalı
Sitotoksisite Tespit Kiti PLUS (LDH) Roche4744926001Depolama: ≤ -15 & derece; Ç

Kaynaklar

  1. Hyder, A. A., Wunderlich, C. A., Puvanachandra, P., Gururaj, G., Kobusingye, O. C. The impact of traumatic brain injuries: a global perspective. NeuroRehabilitation. 22 (5), 341-353 (2007).
  2. Morrison, B. III, Saatman, K. E., Meaney, D. F., McIntosh, T. K. In vitro centralnervoussystemmodels of mechanicallyinducedtrauma: a review. J. Neurotrauma. 15 (11), 911-928 (1998).
  3. Albert-Weissenberger, C., Sirén, A. L. Experimental traumatic brain injury. Exp. Transl. Stroke Med. 2 (16), 1-8 (2010).
  4. Morrison, B., Elkin, B., Dollé, J. P., Yarmush, M. In vitro models of traumatic brain injury. Annu. Rev. Biomed. Eng. 13, 91-126 (2011).
  5. Cargill, R. S., Thibault, L. E. Acute alterations in [Ca2+]i in NG108-15 cells subjected to high strain rate deformation and chemical hypoxia: an in vitro model for neural trauma. J. Neurotrauma. 13 (7), 395-407 (1996).
  6. Geddes-Klein, D., Schiffman, K., Meaney, D. Mechanisms and Consequences of neuronal stretch injury in vitro differ with the model of trauma. J. Neurotrauma. 23 (2), 93-204 (2006).
  7. Ellis, E. F., McKinney, J. S., Willoughby, K. A., Liang, S., Povlischock, J. T. A new model for rapid stretch-induced injury of cells in culture: characterization of the model using astrocytes. J. Neurotrauma. 12 (3), 325-339 (1995).
  8. McKinney, J. S., Willoughby, K. A., Liang, S., Ellis, E. F. Stretch-induced injury of cultured neuronal, glial and endothelia cells (Effect of polyethylene glycol-conjugated superoxide dismutase. Stroke. 27 (5), 934-940 (1996).
  9. Wanner, I. B., Deik, A., et al. A new in vitro model of the glialscarinhibitsaxongrowth. Glia. 56 (15), 1691-16709 (2008).
  10. Wanner, I. B. An In Vitro Trauma Model to Study Rodent and Human Astrocyte Reactivity. Methods Mol. Biol. 814, 189-219 (2012).
  11. Berrout, J., Jin, M., O'Neil, R. G. Critical role of TRPP2 and TRPC1 channels in stretch-induced injury of blood-brain barrier endothelial cells. Brain Res. 1436, 1-12 (2011).
  12. Weber, J. T., Rzigalinski, B. A., Willoughby, K. A., Moore, S. F., Ellis, E. F. Alterations in calcium-mediated signal transduction after traumatic brain injury of cortical neurons. Cell Calcium. 26, 289-299 (1999).
  13. Zhang, L., Rzigalinski, B. A., Ellis, E. F., Satin, L. S. Reduction of voltage-dependent Mg2+ blockade of NMDA current in mechanically injured neurons. Science. 274, 1921-1923 (1996).
  14. Gidday, J. M., Beetsch, J. W., Park, T. S. Endogenous glutathione protects cerebral endothelial cells from traumatic brain injury. J. Neurotrauma. 16 (1), 27-36 (1999).
  15. Gumbleton, M., Audus, K. L. Progress and limitations in the use of in vitro cell cultures to serve as permeability screen for the blood-brain barrier. J. Pharm. Sci. 90, 1681-1698 (2001).
  16. Omidi, Y., Campbell, L., Barar, J., Connell, D., Akhtar, S., Gumbleton, M. Evaluation of the immortalised mouse brain capillary endothelial cell line, b.End3, as an in vitro blood-brain barrier model for drug uptake and transport studies. Brain Res. 990 (1-2), 95-112 (2003).
  17. Montesano, R., Pepper, M. S., Mohle-Steinlein, U., Risau, W., Wangner, E. F., Orci, L. Icreased proteolytic activity is responsible for the aberrant morphogenetic behaviour of endothelial cells expressing the middle T oncogene. Cell. 62, 435-445 (1990).
  18. RayChaudhury, A., Frazier, W., D'Amore, P. Comparison of normal and tumorigenic endothelial cells: differences in thrombospondin production and responses to transforming growth factor-beta. J. Cell Sci. 107, 39-46 (1994).
  19. Förster, C., Silwedel, C., et al. Occludin as direct target for glucocorticoid-induced improvement of blood-brain barrier properties in a murine in vitro system. J. Physiol. 565 (Pt 2), 475-486 (2005).
  20. Rubin, L. L., Hall, D. E., et al. A cell culturemodel of the blood-brain barrier. J. Cell Biol. 115 (6), 1725-1735 (1991).
  21. Burek, N. M., Salvador, E., Förster, C. Y. Generation of an immortalized murine brain microvascular endothelial cell line as an in vitro blood brain barrier model. J. Vis. Exp. (66), (2011).
  22. Weber, J. T., Rzigalinski, B. A., Gabler, H. C. Alterations in calcium-mediated signal transduction after traumatic injury of cortical neurons. Cell Calcium. 26, 289-299 (1999).
  23. Shlosberg, D., Benifla, M., Kaufer, D., Friedman, A. Blood brain barrier breakdown as a therapeutic target in traumatic brain injury. Nat. Rev. Neurol. 6, 393-403 (2010).
  24. Thal, S. C., Schaible, E. V., et al. Inhibition of proteasomal glucocorticoid receptor degradation restores dexamethasone-mediated stabilization of the blood-brain barrier after traumatic brain injury. Crit. Care Med. , (2013).
  25. Werner, C., Engelhard, K. Pathophysiology of traumatic brain injury. Br. J. Anaesth. 99 (1), 4-9 (2007).
  26. Tanno, H., Nockels, R. P., Pitts, L. H., Noble, L. J. Breakdown of the blood-brain barrier after fluid percussion brain injury in the rat: Part 2: Effect of hypoxia on permeability to plasma proteins. J. Neurotrauma. 9 (4), 335-347 (1992).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Germe YaralanmasH cre Germe CihazEsnek Tabanl KuyucuklarLDH Sal n m AnaliziCanl l k Boyama AnaliziH cre DiferansiyasyonuBas n Uygulama

İlgili makaleler