Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Yerinde Sıvıda Biyolojik Montajlar TEM

9.7K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/50936

⸱

30 Aralık 2013

 ,  ,  ,  , 
1Applications Science, Protochips, Inc., 2Virginia Tech Carilion Research Institute

* These authors contributed equally

Bu makalede

Düzeltme bildirimi

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Özet

Burada, viral kompleksleri bir iletim elektron mikroskobu kullanarak nanometre çözünürlüğünde sıvı olarak görüntüleme prosedürünü açıklıyoruz.

Özet

Araştırmacılar, biyolojik varlıkları incelemek ve yeni malzemeleri değerlendirmek için düzenli olarak İletim Elektron Mikroskoplarını (TEM' ler) kullanırlar. Burada, bu aletler için ek bir uygulama açıklıyoruz - viral montajları sıvı bir ortamda görüntülemek. Biyolojik yapıları görselleştirmenin bu heyecan verici ve yeni yöntemi, yakın zamanda geliştirilen mikroakışkan bazlı bir numune tutucuyu kullanır. Video makalemiz, bir TEM içindeki sıvı örnekleri görüntülemek için bir mikroakışkan tutucunun nasıl birleştirılacağını ve kullanılacağını göstermektedir. Özellikle simian rotavirüs çift katmanlı partikülleri (DLP' ler) model sistemimiz olarak kullanıyoruz. Ayrıca, sıvı odasının yüzeyini GÖRÜNTÜLEME penceresine DLP'leri bağlayan benzeşim biyofilmleri ile kaplama adımlarını da açıklıyoruz. Bu, montajları 3D yapı belirlemeye uygun bir şekilde görüntü oluşturmamızı sağlar. Böylece, doğal bir sıvı ortamda subviral parçacıkların ilk bakışını sunuyoruz.

Giriş

Biyologların ve mühendislerin ortak amacı moleküler makinelerin iç işleyişini anlamaktır. İletim Elektron Mikroskopları (TEM'ler), bu karmaşık ayrıntıları atoma yakın çözünürlük1-2'degörselleştirmek için ideal araçlardır. Bir TEM'in yüksek vakum sistemini sürdürmek için, biyolojik numuneler tipik olarak vitreus buz 3 ,şekerler4,ağır metal tuzları5veya6'nınbir kombinasyonunun ince filmlerine gömülür. Sonuç olarak, gömülü örneklerin görüntüleri dinamik süreçlerin yalnızca sınırlı anlık görüntülerini ortaya çıkabilir.

Çevresel sıvı odalarında nemlendirilmiş biyolojik örneklerin korunması için erken girişimler Parsons ve meslektaşları tarafından diferansiyel pompalama aşamaları kullanılarak gerçekleştirilendir. Lekesiz katalaz kristallerinin elektron kırınım desenleri, hidratlı bir durumda 3 şçözünürlüğe başarıyla kaydedildi7-8. Ek olarak, faza ayrılmış lipit alanları insan eritrositlerinin hidratlı zarlarında incelenebilir9-10. Bununla birlikte, sıvının yayılmasından ve elektron ışınlarına müdahalesinden kaynaklanan hareket, ciddi çözünürlük kaybına neden oldu ve yakın zamana kadar biyolojik örnekler kullanılarak daha fazla deney yapılmaya çalışılamamıştır.

Mikro ölçekli bir çevre odası oluşturmak için yarı iletken mikroçipleri kullanan yeni geliştirilen mikroakışkan numune tutucular tanıtıldı. Bu cihazlar, numuneleri bir TEM sütunu11-12'yeyerleştirilmişken sıvı halde muhafaza edebilir. TEM görüntülemedeki bu teknik atılım, araştırmacıların ilk kez moleküler düzeydeki ilerici olayları görüntülemelerini sağladı13. Deneyler artık EM sütunu14-15içinde gerçekleştirilebildiği için bu yeni modaliteyi"yerinde moleküler mikroskopi" olarak adlandırıyoruz. Bu yöntemin genel amacı, nanometre çözünürlüğünde dinamik davranışlarını gözlemlemek için biyolojik montajları sıvı içinde görüntülemektedir. Geliştirilen tekniğin arkasındaki mantık, gerçek zamanlı gözlemleri kaydetmek ve biyolojik makinelerin yeni özelliklerini çözümde incelemektir. Bu metodoloji, hücresel ve moleküler biyolojide daha geniş amaçlar için TEM kullanımını genişletir12-16.

Mevcut video makalesinde, piyasada bulunan bir mikroakışkan numune tutucuyu birleştirmek ve kullanmak için kapsamlı bir protokol sunuyoruz. Bu özel tutucular, dakika hacimlerini içeren bir sıvı odası oluşturmak için entegre aralayıcılarla üretilen silikon nitrür mikroçiplerini kullanır. İnce, şeffaf pencereler görüntüleme amacıyla mikroçiplere kazınır12. Bir TEM kullanarak sıvıdaki simian rotavirüs çift katmanlı partikülleri (DLL'ler) incelemek için mikroakışkan tutucunun doğru kullanımını gösteriyoruz. DLP'ler gibi biyolojik montajların görüntüleme sırasında büyük mesafelerde hızla yayılmasına izin vermek için, onları mikroakışkan odanın yüzeyine bağlamak için Benzeşim Yakalama yaklaşımını16. Bu moleküler yakalama adımı, biyolojik örneklerin sıvı içinde görüntülenmesi için alternatif tekniklere göre büyük bir avantaja sahiptir, çünkü aşağı akış işleme rutinleri için kullanılacak görüntülerin elde edilmesine izin verir. Mikroakışkan görüntüleme ile birlikte kullanılan bu yakalama adımı prosedürlerimize özgüdür17. TEM veya mikroakışkan görüntüleme odalarını kullanarak yapısal biyoloji uygulamaları kullanan okuyucular, moleküler düzeyde dinamik gözlemler nihai hedef olduğunda benzeşim yakalama tekniklerinin kullanımını düşünebilirler.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Benzeşim Yakalama Cihazları Hazırlayın16

  1. Silikon nitrür E-çiplerini 2 dakika boyunca 15 ml aseton ve ardından 2 dakika boyunca 15 ml metanol(Şekil 1A)inkübe ederek temizleyin. Talaşların laminer hava akışı altında kurumasına izin verin.
  2. Kurutulmuş talaşları 150 °C'de 1,5 saat boyunca ısıtılmış bir karıştırma plakasında (karıştırmadan) kuluçkaya bırakın, ardından kullanmadan önce oda sıcaklığına soğumalarını bekleyin.
  3. %25 kloroform içermek için küçük cam tüplerde lipit karışımları oluşturmak için Hamilton şırınnalarını kullanın, Kloroformda %55 DLPC (1,2-dilauroyl-fosfokolin) ve toplam 40 μl hacim için kloroformda (1 mg/ml) %20 Ni-NTA lipid (1,2-dioleoyl-iminodiacetic acid-succinyl-nikel tuzu).
  4. Nemli bir Petri kabındaki bir Parafilm parçasına her 15 μl Milli-Q su damlasına karışımın 1 μl'lik bir aliquotunu uygulayın (Şekil 1B). Örnekleri en az 60 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatır.

2. Makromolekülleri Yakalayın17

  1. Monolayer örneğinin üzerine 150 nm entegre ara parça içeren bir E-çip yerleştirin ve 1 dakika kuluçkayayatırın (Şekil 1C).
  2. Çipi numuneden yavaşça kaldırın ve oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 3 μl'lik bir Protein A. Incubate ekleyin (Şekil 1D).
  3. Whatman #1 filtre kağıdını kullanarak fazla damlayı blot ve hemen 3 μl aliquot antikor çözeltisi ekleyin. Oda sıcaklığında 1 dakika kuluçkaya yatır.
  4. Bir Hamilton şırıngı kullanarak fazla çözeltiyi çıkarın ve hemen 50 mM HEPES (pH 7.5), 150 mM NaCl, 10 mM MgCl 2 ve 10 mM CaCl2içeren tampon çözeltiye 1 μl'lik bir rotavirüs DLPs (0.1 mg /ml) ekleyin. Oda sıcaklığında en az 2 dakika kuluçkaya yatır. DLL'lerin hazırlanması daha önce açıklanmıştır18.

3. Mikroakışkan Hazneyi Monte Edin ve Yerinde Numune Tutucuyu Yükleyin

  1. Viral örneği içeren ıslak E-çipi mikroakışkan numune tutucunun ucuna yükleyin. 1 dakika boyunca ikinci bir düz E-çipi kızdırma deşarjı, daha sonra ara parça yongasının üzerine yüklenir(Şekil 2, paneller 1-5).
  2. Alternatif olarak, biyolojik makromoleküllerin kontrastını artırmak için, ıslak numuneye ikinci E çipi yerleştirmeden önce ıslak örneklere ağır metal lekesi(örneğin% 0,2 uranil format) eklenebilir. Bununla birlikte, numuneyi içeren E-çipin kontrast reaktifini eklemeden önce Milli-Q suyu ile yıkanması gerekecektir.
  3. 3 pirinç vida ile tutucu içinde mekanik olarak tutulan kapalı bir muhafaza oluşturmak için tüm montajı bir araya getirin(Şekil 2, paneller 6-8).
  4. Montajdan sonra, tutucuyu TEM içine yerleştirmeden önce turbo pompalı kuru pompa istasyonu kullanılarak tutucunun ucu10 -6 Torr'a pompalanır.

4. İletim Elektron Mikroskobu Kullanarak Sıvıda Görüntüleme

  1. Yerinde numune tutucuyu LaB6 filamenti ile donatılmış ve 120 kV'da çalışan bir İletim Elektron Mikroskobuna (FEI Company) yükleyin.
  2. TEM filamentini açın ve numuneyi sütunda -15° ila +15° ileri geri eğmek için yalpalama işlevini kullanarak mikroskop aşamasının ösantrik yüksekliğini numuneye göre ayarlayın. Bu prosedür, sıvı haznesinin uygun kalınlığını hesaba katmaya yardımcı olmak için z yönünde aşamayı ayarlar. Bu adım ayrıca görüntüleri kaydederken doğru bir büyütmenin kullanılmasını sağlar.
  3. Önce mikroakışkan odanın kenarları boyunca ve köşe bölgelerinde görüntüleri kaydedin. Bu alanlar genellikle en ince çözümü içerir. CCD kamera kullanarak düşük doz koşullarında (1-3 elektron/ş2)örneklerin görüntülerini kaydedin. 6.000X - 30.000X nominal büyütme kullanın.
  4. Akışkan odanın kenarına odaklanarak uygun defokus değerini belirleyin. Görüntüleri 30.000X büyütmede kaydetmek için -1,5 μm değerini kullanın. Kalın çözelti ile karşılaşılırsa veya numune hazırlanmasında kontrast maddesi kullanılmazsa, -2 ila -4 μm aralığında daha yüksek defokus değerleri kullanın.
  5. Deneyler boyunca çözeltinin mikroakışkan haznede bulunduğundan emin olmak için, kabarcıklar cihaz içindeki sıvıda oluşana kadar elektron ışınını odaklayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Parlama deşarjı yapılan E-çipler kullanılarak sıvıdaki DLL'lerin temsili görüntüleri (Şekil 3A), benzeşim yakalama cihazlarında zenginleştirilmiş DLL'lere kıyasla, muhtemelen difüzyon nedeniyle belirli bir görüntüleme alanında daha az DLL göstermektedir (Şekil 3B). Görüntüleme odasına uranil format eklenmesi, numunenin kontrastını ve dolayısıyla çözeltideki bireysel DLL'lerin görünürlüğünü arttırır(Şekil 3C, üst panel). Daha iyi kontrast, daha önce açıklandığı gibi parça...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Sunduğumuz çalışmada, rotavirüs DLP'lerini mikroakışkan bir platforma bağlamaya yönelik benzeşim yakalama yaklaşımını çalıştık. Bu, sıvı bir mikroçevrinde makromoleküler komplekslerin yerinde görüntülenmesini sağladı. Yakalama yaklaşımı, diğer mikroakışkan görüntüleme teknikleri açısından önemlidir, çünkü görüntüleri sıvı olarak kaydederken ortaya çıkan büyük difüzif sorunları reddetmek için biyolojik örnekleri görüntüleme penceresine lokalize eder. Bununla birlikte, protokolümüzdeki en kr...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazar Madeline J. Dukes, Protochips, Inc.'in bir çalışanıdır.

Teşekkürler

Yazarlar, Virginia Tech Carilion Araştırma Enstitüsü Direktörü Dr. Michael J. Friedlander'ı araştırma çabalarımızı teşvik etmek için kabul ediyorlar. Bu proje S.M.M ve D.F.K.'ye geliştirme fonları ve kısmen Virginia Tech Kritik Teknoloji ve Uygulamalı Bilim Enstitüsü'nün Nano-Bio girişimi tarafından desteklendi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
E-çipler, ara çipProtochips, Inc.EPB-52TBD400 & mu; m x 50 & mu; m pencere
E-çip, üst çipProtochips, Inc.EPT-45W400 ve mu; m x 50 & mu; m penceresi
Ni-NTA lipidAvanti Polar Lipidler790404PToz form
DLPC (12:0) lipidAvanti Polar Lipidler850335PToz form
Hacimsel şişeler Fisher Scientific20-812A; 20-812C1 ml; 5 ml 
Hamilton ŞırıngalarHamilton Co.80300, 804001-10 ve mu; l; 1-25 μ l
Whatman #1 filtre kağıdıWhatman1001 090100 adet, 90 mm
Cam Petri kaplarıCorning70165-101100 mm x 15 mm
Cam Pastör pipetleriVWR14673-01014673-010
Cam kültür tüpleriVWR47729-5666 mm x 50 mm
AsetonFisher ScientificA11-11 L
MetanolFisher ScientificA412-11 L
Kloroform Elektron Mikroskobu Bilimleri12550100 ml 
Onun etiketli Protein AAbcam, Inc.ab5295310 mg
Milli-Q su sistemiEMD Millipore Corp.Z00QSV001Ultra Saf Su
HEPESFisher ScientificBP310-500500 g
Ekipman 
Poseidon In situ numune tutucuProtochips, Inc.  FEI uyumlu
FEI Spirit BioTwin TEMFEI Co.120 kV
Eagle 2k HS CCD kameraFEI Co.10  Å/30.000X
Gatan 655 Kuru pompa istasyonundaGatan, Inc.Pompa tutucu ucu 10-6  aralığı
PELCO easiGlow, kızdırma deşarj ünitesiTed Pella, Inc.  Negatif polarite modu:
Isotemp ısıtmalı karıştırma plakasıFisher Scientific150 >m'ye kadar ısı; 1,5 saat için C
piksel örneklemesi ,

Kaynaklar

  1. Zhou, Z. H. Towards atomic resolution structural determination by single-particle cryo-electron microscopy. Curr. Opin. Struct. Biol. 18, 218-228 (2008).
  2. Wolf, M., Garcea, R. L., Grigorieff, N., Harrison, S. C. Subunit interactions in bovine papillomavirus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 6298-6303 (2010).
  3. Dubochet, J., et al. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Q. Rev. Biophys. 21, 129-228 (1988).
  4. Unwin, P. N., Henderson, R. Molecular structure determination by electron microscopy of unstained crystalline specimens. J. Mol. Biol. 94, 425-440 (1975).
  5. Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative Staining and Image Classification - Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biol. Proced. Online. 6, 23-34 (2004).
  6. Adrian, M., Dubochet, J., Fuller, S. D., Harris, J. R. Cryo-negative staining. Micron. 29, 145-160 (1998).
  7. Parsons, D. F. Structure of wet specimens in electron microscopy. Improved environmental chambers make it possible to examine wet specimens easily. Science. 186, 407-414 (1974).
  8. Parsons, D. F., Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Turner, J. N. Electron microscopy and diffraction of wet unstained and unfixed biological objects. Adv. Biol. Med. Phys. 15, 161-270 (1974).
  9. Hui, S. W., Parsons, D. F. Electron diffraction of wet biological membranes. Science. 184, 77-78 (1974).
  10. Hui, S. W., Parsons, D. F., Cowden, M. Electron diffraction of wet phospholipid bilayers. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 71, 5068-5072 (1974).
  11. Ring, E. A., de Jonge, N. Microfluidic system for transmission electron microscopy. Microsc. Microanal. 16, 622-629 (2010).
  12. Dukes, M. J., Ramachandra, R., Baudoin, J. P., Gray Jerome, W., de Jonge, N. Three-dimensional locations of gold-labeled proteins in a whole mount eukaryotic cell obtained with 3nm precision using aberration-corrected scanning transmission electron microscopy. J. Struct. Biol. 174, 552-562 (2011).
  13. Yuk, J. M., et al. High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells. Science. 336, 61-64 (2012).
  14. Peckys, D. B., de Jonge, N. Visualizing gold nanoparticle uptake in live cells with liquid scanning transmission electron microscopy. Nano Lett. 11, 1733-1738 (2011).
  15. Klein, K. L., Anderson, I. M., de Jonge, N. Transmission electron microscopy with a liquid flow cell. J. Microsc. 242, 117-123 (2011).
  16. Degen, K., Dukes, M., Tanner, J. R., Kelly, D. F. The development of affinity capture devices-a nanoscale purification platform for biological in situ transmission electron microscopy. Rsc. Adv. 2, 2408-2412 (2012).
  17. Gilmore, B. L., et al. Visualizing viral assemblies in a nanoscale biosphere. Lab Chip. 13, 216-219 (2013).
  18. Bican, P., Cohen, J., Charpilienne, A., Scherrer, R. Purification and characterization of bovine rotavirus cores. J. Virol. 43, 1113-1117 (1982).
  19. Frank, J., et al. SPIDER and WEB: processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields. J. Struct. Biol. 116, 190-199 (1996).
  20. Zhang, X., et al. Near-atomic resolution using electron cryomicroscopy and single-particle reconstruction. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 1867-1872 (2008).
  21. Scheres, S. H. A Bayesian view on cryo-EM structure determination. J. Mol. Biol. 415, 406-418 (2012).
  22. Kelly, D. F., Abeyrathne, P. D., Dukovski, D., Walz, T. The Affinity Grid: a pre-fabricated EM grid for monolayer purification. J. Mol. Biol. 382, 423-433 (2008).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Düzeltme


Formal Correction: Erratum: In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid
Posted by JoVE Editors on 10/10/2024. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/50936

Etiketler

Sıvı OrtamMikroakışkan TutucuAfinite YakalamaRotavirüs DLP'leriTEM GörüntülemeVirüs GörselleştirmeNanoparçacık İzlemeElektron Mikroskobu
Yerinde Sıvıda Biyolojik Montajlar TEM
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.