Yöntem makalesi

AFM-tabanlı Tek-molekül Kuvvetleri Spektroskopisi ile cellulosome Reseptör-ligand Sistemleri Araştırılması

7.2K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/50950

⸱

20 Aralık 2013

 ,  ,  , 
1Lehrstuhl für Angewandte Physik and Center for Nanoscience, Ludwig-Maximilians-Universität

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Selülozomlar, selülozu sindirmek için tasarlanmış multienzim kompleksleridir. AFM tabanlı SMFS, selülozomla ilişkili protein düzeneklerinin mekanik özelliklerini ve katlanma konfigürasyonunu incelemek için kullanıldı. Selülozom montajında yer alan bireysel reseptör-ligand komplekslerinin etkileşimlerini incelemek için protein immobilizasyonu, veri toplama ve veri analizi için eksiksiz bir iş akışı sunuyoruz.

Özet

Cellulosomes lignoselülozik alt tabakaların sindirimi anaerobik bakteri ve mantar bir alt kümesi tarafından kullanılan ayrı çoklu enzim kompleksleridir. Katalitik olmayan iskele proteine ​​enzimlerin montaj etkileşim cohesin ve dockerin modülleri içeren ilgili reseptör-ligand çifti bir aile arasındaki etkileşimler ile yönlendirilir. Konvansiyonel dökme yöntemleri ile doğru off-rate ölçümlerini engel olabilir nanomolar aralığında düşük pikomolar DİSOSİASYON sabitler, içinde ve kohezinin dockerin modüller sonuçlar arasında son derece güçlü bağlama. Atomik kuvvet mikroskopu ile tek molekül kuvvet spektroskopisi (SMFs) zorlamak için bireysel biyomoleküllerin tepki ölçer ve diğer tek molekül manipülasyon yöntemleri (örneğin optik cımbız) aksine, yüksek afiniteli reseptör-ligand etkileşimlerini incelemek için uygun olduğu için yüksek kuvvet rejimi (> 120 pN) prob kabiliyetini. Burada Cellul eğitim için tam bizim protokol mevcuttek-molekül düzeyinde protein osomal meclisleri. Yerel cellulosome türetilen bir protein topoloji kullanarak, modül cohesin (CBM-cohesin) füzyon proteinleri, bir sistein artığı da erişilebilir bir serbest tiyol grubu ile her bir bağlama enzim dockerin ve karbohidrat ile çalışmıştır. Biz yüksek yakınlık kompleksi için ayrıntılı bağlama parametrelerini elde etmek için bizim ölçüm ve veri analizi prosedürü ile birlikte, sitemiz-spesifik yüzey immobilizasyon protokol mevcut. Biz tek subdomain açılımı güçleri, karmaşık kopma kuvvetleri, off-oranları kinetik ve iyi bağlayıcı potansiyel genişlikleri ölçmek nasıl gösterilmektedir. Multidomain selülolitik komplekslerinin topluluğundan sorumlu-cohesin dockerin etkileşimi karakterize etmede, bu yöntemlerin başarılı bir uygulama daha da tarif edilmektedir.

Giriş

Selülozomlar, bitki hücre duvarı lignoselülozunu çözünür oligosakkaritlere verimli bir şekilde depolimerize etmek için evrimleşmiş anaerobik selülolitik bakterilerin (örneğin C. thermocellum) yüzeyinde görüntülenen büyük multienzim kompleksleridir1. Selülozomların merkezi bir özelliği, yüksek afiniteli kohezite-dockerin etkileşimidir. En belirgin paradigmada, çeşitli bakteriyel enzimlerin C-terminal ucunda yüksek oranda korunmuş bir 60-75 amino asit tip I dockerin modülü görüntülenir. Docker modülü, enzimlerin sinerjik kombinasyonlarının, tip I dockerin modülüne özgü kohezin alanlarının bir poliproteinini içeren katalitik olmayan iskele proteini ('iskele') üzerine montajını yönlendirir. Daha yüksek seviyelerde, selülozom mimarisi çok karmaşık hale gelebilir, yapıları hücre yüzeyine sabitleyen ve çoklu iskele içeren dallı yapıların montajına izin veren alternatif kohezin ve dockerin çiftlerini (örneğin tip II, tip III) içerebilir2. Çeşitli kohezin-dockerin tipleri, ilgili yapılara sahip olmalarına rağmen, istenmeyen iskeleler veya diğer selülozom üreten bakteri türlerinden gelen bileşenlerle çapraz reaktiviteyi baskılayan diferansiyel bağlanma özgüllükleri sergiler. Biyoinformatik yaklaşımlar genetik düzeyde binlerce benzersiz selülozomal bileşeni başarıyla tanımlamış olsa da, nispeten az sayıda protein yapısı bilinmektedir ve kohezin-dockerin özgüllüğünün belirlenmesinde iş başında olan mekanizmalar, yapısal biyoloji araştırmalarının aktif bir alanı olmaya devam etmektedir.

Binnig ve arkadaşları tarafından atomik kuvvet mikroskobunun (AFM) icadından bu yana.3, temassız görüntüleme, salınım modu görüntüleme4 ve tek moleküllü kuvvet spektroskopisi (SMFS) 5,6 dahil olmak üzere çeşitli AFM operasyonel modları geliştirilmiş ve sürekli iyileştirilmiştir. SMFS, tek tek proteinleri7-11, nükleik asitleri12-15 ve sentetik polimerleri16-19 doğrudan araştırmak için yaygın olarak kullanılan bir tekniğe dönüşmüştür. Reseptör-ligand bağlanmasını araştırmak için tipik bir SMFS deneyinde20,21, bir AFM konsol ucu, bağlanma ortaklarından biri ile modifiye edilirken, düz bir cam yüzey tamamlayıcı bağlama ortağı ile modifiye edilir. Modifiye edilmiş konsol, yüzeyle temas ettirilerek ortakların bağlanmasına izin verilir. Konsolun tabanı daha sonra sabit hızda geri çekilir ve kuvvet, optik kol sapma yöntemi kullanılarak ölçülür. Ortaya çıkan kuvvet-mesafe veri izleri, bağlanma kurulmuşsa testere dişi benzeri tepeler sergiler. Bağlanma ortaklarının birden fazla protein alanına kaynaştığı durumlarda, kuvvet-mesafe izindeki her bir zirve, tek bir protein alanının veya katlanmış alt alanın açılmasıyla ilişkilendirilebilirken, son zirve, protein bağlanma arayüzünün yırtılmasına karşılık gelir. Kuvvete dayanıklı elemanların spesifik konumları, ilgilenilen çeşitli protein alanlarını tanımlamak için parmak izi olarak kullanılabilir. Bu yöntem, protein katlanması ve stabilizasyonunda yer alan önemli amino asitleri sorgulamak için kullanılabilir. SMFS deneylerinde gözlemlenen karakteristik kuvvet uzama davranışını tedavi etmek için literatürde birçok model bildirilmiştir. En yaygın olarak kullanılan modeller arasında serbest mafsallı zincir (FJC) model22, sonsuz mafsallı zincir (WLC) model18,23-25 ve serbestçe dönen zincir (FRC) model25,26 bulunur.

Önceki çalışmamız11'de, kohezin ve dockerin modüllerinin etkileşimini araştırmak için tek moleküllü kuvvet spektroskopisi kullandık. Burada, enzim-dockerin ve CBM-kohezin protein yapıları ile cam yüzey ve konsol fonksiyonelizasyonu için deneysel bir protokol sunuyoruz. Ayrıca, veri toplama ve analiz prosedürlerini içeren AFM tabanlı bir SMFS protokolü sunuyoruz. Açıklanan protokol diğer moleküler sistemlere kolayca genelleştirilebilir ve yüksek afiniteli reseptör ligand çiftleri ile ilgilenen araştırmacılar için özellikle yararlı olmalıdır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Cohesin-dockerin etkileşimini incelemek için bu çalışmada kullanılan çekme geometrisinin şeması Şekil 1A'da gösterilmiştir. Kantilever ve lameli fonksiyonelleştirmek için burada bildirilen protein immobilizasyon protokolü, daha önce yayınlanan prosedürün27 modifiye edilmiş bir versiyonudur. Proteinler, konvansiyonel yöntemler kullanılarak E. coli içinde plazmid vektörlerden eksprese edilmiştir. Proteinler, proteini stabil bir tioeter bağı aracılığıyla lamel yüzeyine ve kantilevere bağlamak için maleimid kimyası ile birlikte kullanılan çözücüye erişilebilir bir tiyol grubuyla tasarlanmıştır. Hem CBM-cohesin hem de xylanase-dockerin füzyon proteinlerindeki mühendislik ürünü sistein kalıntıları, proteinlerin N-terminal tarafına, cohesin-dockerin bağlanma arayüzünden uzağa yerleştirilmiştir11. Protein immobilizasyonunda kullanılan kimyasal bağlanmanın ayrıntılı bir özeti Şekil 1B'de gösterilmiştir.

1. Numune Hazırlama

  1. Tamponlar
    1. Kalsiyum takviyeli Tris tamponlu salin (TBS) hazırlayın: 25 mM TRIS, 75 mM NaCl, 1 mM CaCl2, pH 7.2
    2. Sodyum borat tamponu hazırlayın: 50 mM Na2B4O7, pH 8.5
      Numune hazırlama basamaklarını gösteren işlem akış diyagramı Şekil 2'de gösterilmiştir.
      Kantiliverler ve lamel camlar ile çalışırken kendinden kilitli cımbızların kullanılması önerilir.
  2. Lamel camın aminosilanizasyonu (yaklaşık 1,5 sa)
    1. Lamel camı (24 mm çap, 0,5 mm kalınlık) bir PTFE tutucuya yerleştirin.
    2. Lamel camı 1:1 etanol : ultra saf su (v/v) içinde 15 dk sonikasyona tabi tutun.
    3. Lamel camı ultra saf su ile durulayın.
    4. Lamel camı piranha solüsyonunda (1:1 H2SO4 (konsantre) : H2O2 (30%) (v/v)) 30 dk bekletin, ardından ultra saf su ile iyice durulayın. Lamel camı hafif bir N2 akımı altında kurutun. Dikkat: piranha solüsyonu son derece koroziftir. Göz ve cilt koruması gereklidir.
    5. Lamel camı 45:5:1 etanol : ultra saf su : 3-aminopropil dimetil etoksisilan (v/v) karışımına daldırın. Oda sıcaklığında (RT) bir çalkalayıcı üzerinde 60 dk (yaklaşık 50 rpm) bekletin.
    6. Lamel camı sırasıyla etanol ve ultra saf su içinde (her biri 2x) daldırın. Lamel camı hafif bir N2 akımı altında kurutun.
    7. Lamel camı fırında pişirin (80 °C'de 30 dk).
    8. Silanize edilmiş lamel camlar argon altında 6 haftaya kadar saklanabilir.
  3. Kantiliverlerin aminosilanizasyonu (yaklaşık 1,5 sa)
    NOT: Sunulan uç fonksiyonelleştirme protokolü silikon kantiliver uçları için uygundur.
    1. Kantiliverleri temiz bir cam lam üzerine yerleştirin. 15 dk boyunca UV-ozon ile işlem yapın.
    2. Kantiliverleri katalitik miktarda (0,25%, (v/v)) ultra saf su içeren 1:1 etanol : 3-aminopropil dimetil etoksisilan (v/v) karışımına 3 dk boyunca daldırın.
    3. Kantiliverleri hafifçe karıştırarak sırasıyla toluen, etanol ve ultra saf su içeren beherlerde 60 sn boyunca durulayın. Durulamalar arasında kantiliverleri filtre kağıdı üzerinde dikkatlice kurutun.
    4. Kantiliverleri temiz bir cam lam üzerine yerleştirin ve pişirin (80 °C'de 30 dk).
  4. Protein disülfit indirgenmesi (yaklaşık 3 sa)
    Tüm solüsyonlar, kantiliver başına yaklaşık 30 µl ve lamel cam başına 20 µl seyreltilmiş protein elde edecek şekilde hazırlanmalıdır. Protein solüsyonları, Tris(2-karboksietil)fosfin (TCEP) disülfit indirgenme jeli ile 1:2 (v/v) oranında karıştırılmalıdır.
    1. Mikro tüplerde TCEP disülfit indirgenme boncukları alikotları hazırlayın. TCEP boncuk süspansiyonunu pipetlerken delik çapını genişletmek için mikropipet uçlarının makasla kesilmesi önerilir.
    2. TCEP boncuk süspansiyonunu 1 ml TBS tamponu ile durulayın ve 850 rcf'de 3 dk santrifüjleyin.
    3. Süpernatantı bir mikropipetle dikkatlice uzaklaştırın ve atın.
    4. 1.4.2-1.4.3 basamaklarını 2x tekrarlayın.
    5. Konsantre protein solüsyonunu (1-10 mg/ml) TCEP boncuklarına uygulayın (1:2 protein : TCEP boncuk süspansiyonu (v/v)) ve mikropipet ucuyla karıştırarak nazikçe harmanlayın. Hava kabarcığı oluşmamasına dikkat edin.
    6. Protein/TCEP boncuk süspansiyonu karışımını bir rotatörde 2,5 sa bekletin.
  5. Lamel camların ve kantiliverlerin PEGilasyonu (yaklaşık 1,5 sa)
    1. NHS-PEG-maleimid bağlayıcılar ile modifikasyondan önce, yüzeydeki primer amin gruplarını deprotonize etmek için aminosilanize edilmiş kantiliverleri ve lamel camları sodyum borat tamponunda (pH 8.5) 45 dk boyunca bekletin.
    2. Kapağı açmadan ve 25 mM'lık bir solüsyon için uygun miktarı tartmadan önce NHS-PEG-maleimid tozunun oda sıcaklığına (RT) geldiğinden emin olun. Kullanılmayan NHS-PEG-maleimid -20 °C'de argon altında saklanmalıdır. Kantiliver başına yaklaşık 30 µl polimer solüsyonu ve (üst üste getirilmiş) 2 lamel cam başına 90 µl gereklidir.
    3. 5 kDa NHS-PEG-maleimid tartıldıktan sonra sodyum borat tamponu ekleyin ve 25 mM'lık bir solüsyon elde etmek için vorteksleyin.
      Not: pH 8.5'te NHS'nin yarı ömrü son derece kısa olduğu için solüsyon mümkün olan en kısa sürede kullanılmalıdır. Vortekseleme ve sıvının kantiliverlere/lamel camlara aktarılması 1-2 dk içinde tamamlanmalıdır.
    4. Kantiliverleri bir Petri kabı içindeki 30 µl'lik NHS-PEG-maleimid solüsyonu damlacıklarında inkübe edin. Lamel camlar için, tek bir lamel cam üzerine 90 µl NHS-PEG-maleimid solüsyonu yerleştirin ve üzerine ikinci bir lamel cam ekleyerek ortasında NHS-PEG-maleimid solüsyonu bulunan bir lamel cam sandviçi oluşturun.
    5. Kantiliverleri/lamel camları NHS-PEG-maleimid solüsyonu ile suyla doyurulmuş bir atmosferde oda sıcaklığında (RT) 1 sa boyunca inkübe edin.
  6. Protein konjugasyonu (yaklaşık 2 sa)
    Kritik: PEGile edilmiş kantiliverlerin ve lamel camların havaya maruziyetini en aza indirin.
    1. TCEP-boncuk/indirgenmiş protein solüsyonlarını 100 rcf'de 1 dk santrifüjleyin ve süpernatantı toplayın.
    2. Protein solüsyonunu TBS ile seyreltin. Yüzey konjugasyonu sırasında 0,5-2 mg/ml aralığında bir protein konsantrasyonu hedefleyin. Kantiliverleri ve lamel camları durularken indirgenmiş ve seyreltilmiş protein solüsyonlarını birkaç dakika kenara ayırın.
    3. Kantiliverleri ve lamel camları sırasıyla üç ultra saf su beheri içinde durulayın.
    4. Lamel camlardaki kalıntı sıvıyı, kenarları hafif bir N2 akımı altında filtre kağıdına dikkatlice dokundurarak uzaklaştırın. Kantiliverlerdeki kalıntı sıvıyı filtre kağıdına dokundurarak dikkatlice uzaklaştırın. Seyreltilmiş protein solüsyonunu hemen uygulayın.
    5. Lamel camları, AFM cihazı ile uyumlu uygun bir numune tutucuya yerleştirin.
    6. PEGile edilmiş lamel camları ve kantiliverleri ilgili seyreltilmiş protein solüsyonları ile oda sıcaklığında (RT) 1-2 sa boyunca inkübe edin.
    7. Bağlanmamış proteinleri uzaklaştırmak için kantiliverleri sırasıyla üç beherde TBS ile durulayın. Lamel camları pipetleme ile en az 10x durulayın.
    8. Ölçümden önce kantiliverleri ve lamel camları TBS altında saklayın.

2. Veri Elde Etme

Bu çalışmada, Asylum Research firmasından MFP-3D AFM kontrol cihazı ve özel olarak yazılmış Igor Pro yazılımı ile kontrol edilen, özel yapım bir AFM28 kullanılmıştır. Kantilever sapması, optik ışın sapma yöntemiyle ölçülmektedir29. Burada sunulan numune hazırlama ve veri analizi protokolleri, kullanılan kesin AFM modelinden bağımsız olarak uygulanabilir. Ancak AFM modeli, sıvılarda ölçüm yapmaya uygun olmalı ve z-piezo üzerinde yaklaşık 200-5.000 nm/sec değerinde erişilebilir bir hız aralığını desteklemelidir.

  1. Fonksiyonelleştirilmiş kantileveri ve cam yüzeyi AFM'ye yerleştirin. Tüm işlem boyunca yüzey, tampon çözelti ile kaplı kalmalıdır. Kantileveri yerleştirirken havaya maruz kalma süresini en aza indirin. Lazer ışınının doğru ayarlanmasının ardından, sürüklenme (drift) etkilerini azaltmak için sistemin en az 30 dakika dengelenmesini bekleyin ve gerekirse ayarları yeniden yapın.
  2. Kantilever yüzeyden uzaktayken bir termal gürültü spektrumu kaydedin, yani sönümleme etkilerinin yokluğunda.
  3. Ölçüm öncesinde konsantre ucuna zarar vermeden yüzeyi bulmak için akustik yaklaşım gibi minimal invaziv bir yöntem kullanın. Mümkünse, konsantre ile yüzeye manuel olarak yaklaşın ve AFM kontrolöründen gelen ham sapma çıktısındaki termal gürültüyü dinlemek için kulaklık kullanın. Konsantre yüzeye yaklaştığı anda, seste belirgin bir değişim duyulur.
    Not: Konsol ucu şu an 2-5 µm yüzeyin. Ses değişiminin doğası, kullanılan kantilever koluna bağlıdır. Bu çalışmada kullanılan kantilever kolunun rezonans frekansı, su içerisinde yaklaşık 25 kHz'dir ve insan işitme aralığının üzerindedir. Yüzey yakınındaki sönümleme etkileri nedeniyle rezonans, daha düşük frekanslara kayarak kantilever rezonansını işitilebilir aralığa getirir. Bu nedenle, frekansta ve ses şiddetinde görünür bir artış algılanır.
    Sapma sinyalinin sesli çıktısının mevcut olmadığı durumlarda, sapma sinyali üzerinden aktif bir geri besleme etkinleştirilerek yüzeye z-piezo ile yaklaşılabilir. Yüzeye batma nedeniyle sapma sinyali tanımlanmış bir miktarda arttığı anda yaklaşma işlemi durdurulur.
  4. Volt başına sapma sinyaline karşılık gelen uç yer değiştirme mesafesini (nm cinsinden) temsil eden ters optik kaldıraç hassasiyetini (InvOLS) belirleyin. Bunu, yüzeyi konsol ucuyla bastırarak gerçekleştirin. Yaklaşık 3 nm'lik bir konsol ucu yer değiştirmesine karşılık gelen bir sapma set noktası voltajı önerilir.
  5. Eşit dağılım teoremine göre, termal gürültü spektrumuna basit bir harmonik osilatör yanıt fonksiyonu uydurarak konsolun yay sabitini belirleyin.30,31.
  6. Bir deneysel rutin başlatın. Bu çalışma için aşağıdaki ölçüm parametreleri seti kullanılmıştır: yaklaşma hızı: 3.000 nm/sn; girinti kuvveti: 180 pN; yüzey bekleme süresi: 10 ms; geri çekilme hızları: 0,2, 0,7, 2,0, 5.0 µm/sec sırasıyla 2.000, 5.000, 15.000, 20.000 Hz örnekleme hızlarında; geri çekilme mesafesi: 500 nm.
    Not: Aşırı örneklemeden kaçınmak ve veri boyutlarını makul düzeyde tutmak için örnekleme hızı 10 nokta/nm'den daha yüksek ayarlanmamalıdır.
  7. Her kuvvet-mesafe izinden sonra, her kuvvet-mesafe eğrisinde yeni bir yüzey konumunu konsantreye maruz bırakmak için x ve y-piezo sahnelelerini hareket ettirin. Bu teknik, uzun süreli ölçümler sırasında lamel cam yüzeyinin daha geniş bir alanından örnekleme yapılmasını sağlar.
  8. sapma tablasının periyodik olarak sıfırlanmasını kullanın (yani sapma sinyalinin aralık dışına çıkması veya yüzeyle temasın kesilmesi durumunda, uzun süreli ölçümler sırasında (fotodiyot konumu) ve z-piezo şasisi yüksekliği.
  9. Ölçüm çalışması tamamlandığında, daha hassas bir InvOLS değeri elde etmek için ölçümlerden önce kullanılan değerden önemli ölçüde daha yüksek bir girinti kuvveti ile bir InvOLS ölçümü daha gerçekleştirin.
  10. Yüzeyden uzak bir noktada başka bir termal gürültü spektrumu kaydedin. Deneysel çalışmanın sonunda yay sabitini belirleyin.

3. Veri Analizi

Şekil 3'teki akış şeması, veri analiz sürecini göstermektedir. Tüm veri manipülasyonlarını Igor Pro veya MATLAB gibi uygun bir yazılım paketi kullanarak gerçekleştirin. Öncelikle, detektörden gelen ham sinyali kuvvet birimlerine dönüştürün, ofset ve sürüklenme düzeltmelerini yapın. Ardından, açılma yollarındaki enerji bariyerlerini belirlemek ve protein alt alanlarını tanımlamak için biyopolimer elastisite modellerini kullanın. Son olarak, reseptör-ligand etkileşiminin kinetik ve enerjik parametreleri elde edilir.

  1. Birim dönüştürme ve veri düzeltmeleri
    1. Dedektör voltajını kuvvet birimlerine dönüştürmek için ham sapma sinyalini (volt), InvOLS (nm/volt) ve yay sabitle (pN/nm) çarpın.
    2. Yüklenmemiş konsolun kuvvet değerini sıfır pN yapacak şekilde verileri ötelemek için, öncelikle kuvvet-mesafe izinin (yüzeyden en uzak noktada elde edilen) son %10'luk kısmındaki kuvvet değerlerinin ortalamasını alın ve ardından bu ortalamayı veri izindeki tüm kuvvet değerlerinden çıkarın.
    3. Her bir izi, mesafe ekseniyle olan ilk kesişim noktası 0 nm mesafeye denk gelecek şekilde x yönünde kaydırın.
    4. InvOLS, lazer noktasının konsol üzerindeki konumuna bağlıdır. Konsolun iz alanı lazer nokta boyutuyla kıyaslanabilir olduğunda, optik okuma sistemindeki küçük miktarlardaki kaymalar bile InvOLS'de belirgin değişikliklere neden olabilir. Bunu, sıfır kuvvetindeki sapma sinyali üzerindeki gürültünün analiziyle düzeltin. Ortam koşullarının sabit olduğu varsayıldığında, sapma sinyali üzerindeki gürültü InvOLS ile doğrudan orantılıdır.
      1. Her bir kuvvet-mesafe izinin son %10'luk kısmının kök ortalama kare (RMS) sapma değerini (sıfır kuvvet altındaki gürültü seviyesi) ölçün.
      2. Gürültüyü eğri numarasına karşı grafiğe dökün ve uygun bir uyum uygulayın. Genellikle şu formdaki bir eksponansiyel uyum kullanılır: Exponential decay formula, N(n_i)=N_0 * e^(-kn_i), mathematical representation. N gürültüyü, ni eğri numarasını, N0 ve k ise uyum parametrelerini temsil etmek üzere, en iyi sonucu verecektir. Belirli veri setleri için doğrusal bir uyum da uygun olabilir.
      3. Her eğri için bir ölçeklendirme faktörü (SF) belirleyin:

        Denklem 1:
        static equilibrium equation; (SF)=(N₀e^(-knᵢ)+C)/(N₀e^(-knₓ)+C); mathematical formula
        burada ni eğri numarası, nf son eğri numarası ve C bir ofset değeridir.
      4. Ardından, her bir münferit eğrideki tüm kuvvet değerlerini ölçekleme faktörüne bölün. Bu işlem, her bir eğriyi, mevcut eğrinin RMS gürültü değerinin, InvOLS ölçümünden hemen önce elde edilen son izleğin RMS gürültü değerine olan oranında ölçeklendirir.
      5. Mesafe eksenini (z) moleküler uzamaya (z*) dönüştürmek için bir sapma düzeltmesi gerçekleştirin. Bu işlem, kuvvet altında kantileverin bükülmesini ve böylece kantilever ucu ile örnek arasındaki mesafenin, z-piezo sensör konumunun bildirdiği değerden daha kısa olmasını hesaba katar.

        Denklem 2:
        Static equilibrium equation, z* = z - F/k, formula; physics calculations, force analysis
        Nerede z ölçülen z-sensör konumudur, F konsol üzerine etki eden kuvvet ve k yay sabiti.
  2. Kontur uzunluğu analizi
    Bir proteinin kontur uzunluğu, polipeptit zincirinin maksimum gerilmiş uzunluğudur. Bir proteinin katlanma durumu, ikincil ve üçüncül yapı tarafından belirlenen geometrisi ve uçtan uca mesafesi anlamına gelir. Bir proteinin kontur uzunluğu, katlanma durumuyla doğrudan ilişkilidir.9,25,32Kuvvet-uzama izlerindeki spesifik kopmaların konumları, PEG bağlayıcıların polidispersitesinin yanı sıra sıcaklık, tampon özellikleri ve yükleme hızları gibi dış parametreler nedeniyle geniş bir değişkenlik gösterir. Bu durum doğrudan veri analizini karmaşıklaştırsa da kuvvet-uzama verilerinin kontur uzunluğu uzayına dönüştürülmesiyle aşılabilir. Bu teknik, devasa veri setleri üzerinden ortalama alınmasına olanak tanır ve karakteristik açılma olaylarının belirlenmesi için otomatik örüntü tanıma yöntemlerinin kullanılmasına imkan verir. Bu sayede, tekil kuvvet izlerini sergilenen etkileşim türüne göre sınıflandırmak mümkündür. Daha önce tanımlanmış olan aşağıdaki prosedür25 kuvvet-uzama verilerini kontur uzunluğu uzayına dönüştürmek için kullanılır.
    1. WLC modelinin çözülmesi (Denklem 3)23 kontur uzunluğu için L sabit bir kalıcılık uzunluğunda p kontur uzunluğunu veren Denklem 4'teki sonuçlar L(x,u)Burada, Lütfen çevirmemi istediğiniz metni sağlayın. mesafe ve u=F*p/kBT, burada kB Boltzmann sabitidir ve T sıcaklıktır. Yalnızca reel çözümler dikkate alınabilir. Ek kısıtlamalar şunlardır: Lütfen çevirmek istediğiniz kaynak metni sağlayın., F>0, L>0, x>0;

      Denklem 3:
      Force-extension formula, F(x,L), polymer physics equation, illustrates entropic elasticity.

      Denklem 4:
      Static equilibrium, L(x,u), complex formula, educational diagram, analytical expression interpretation.
      burada,
      Polynomial function \( g(u) \) equation, mathematical analysis, symbolic computation.
    2. Dönüştürülmüş veri noktalarını bir kuvvet-kontur uzunluğu grafiğine yerleştirin. Gürültüyü hariç tutmak için yaklaşık 10 pN'lik bir kuvvet eşiği uygulayın. Spesifik olmayan etkileşimler, uzun geçiren bir uzunluk filtresi uygulanarak dışlanabilir. Kontur uzunluklarından oluşan bir histogram oluşturun.
    3. Çapraz korelasyon kurmak33 elde edilen histogramlar bir şablon histogram ile karşılaştırılır ve PEG polidispersitesini düzeltmek için x-ekseni boyunca kaydırılır. Bireysel veri izlerinin benzerliğini ölçmek için ortaya çıkan korelasyon değerlerini kullanın. Böylece, daha ileri analizleri basitleştirmek amacıyla veri izleri önceden tanımlanmış sınıflara ayrılabilir.
    4. Otokorelasyon yardımıyla tek bir izdeki tekrarlayan özellikleri bulmak için benzer bir teknik kullanın, örn. çoklu Ig-domayin açılımı için.
    5. Diğer açılma olaylarını incelemek için izleri manuel olarak sınıflandırın.
  3. Yükleme Hızı Analizi
    Kuvvet spektrumuna uygun modeller uygulayarak, reseptör-ligand ayrışmasına ilişkin kinetik ve enerjetik bilgileri çıkarın, yani kopma kuvveti - ln(yükleme hızı) grafiği.
    1. Belirli bir çekme hızı için, ilgilenilen kopma olaylarının kopma kuvvetini ve yükleme hızını belirleyin:
      1. İlgilenilen kopma olayının civarındaki bir kuvvet-zaman izine doğrusal uyum yapın. Yükleme hızını, zirve noktasına yapılan doğrusal uyumun eğiminden belirleyin. Bu prosedürü, ilgilenilen kopma olayını gösteren her bir iz için tekrarlayın.
      2. Kopma kuvvetleri histogramına Gauss uyarlaması uygulayarak en olası kopma kuvvetini belirleyin. Alternatif uyarlama fonksiyonları da kullanılabilir.
      3. En olası yükleme hızını belirleyin.
    2. Tüm çekme hızları için 3.3.3.1 - 3.3.3.3 adımlarını tekrarlayın.
    3. Kuvvet spektrumunu elde etmek için, en olası kopma kuvvetlerini, en olası yükleme hızlarının doğal logaritmasına karşı grafiğe dökün.
    4. Kinetik ve enerjetik parametreleri elde etmek için kuvvet spektrumuna uygun bir teorik model uygulayın (Şekil 4C). Birçok durumda, doğrusal Bell-Evans modeli20,34 kullanılabilir ve ... için iyi tahminler sağlayacaktır koff, kuvvet yokluğundaki disosiyasyon hızı ve Dx, Denklem 5'te gösterildiği gibi, reaksiyon koordinatı boyunca geçiş durumuna olan mesafe.

      Denklem 5:
      static force equation ⟨F⟩, k_B T/Δx, formula analysis for thermal fluctuation experiments

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

C. thermocellum'dan alınan bir tip I kohezin-dockerin çiftini incelemek için açıklanan prosedürü kullandık. Kohezin-dockerin çiftinin başarılı bir şekilde bağlanmasının ardından, kaydedilen kuvvet-mesafe izleri karakteristik pik desenleri göstermiştir. Tipik bir iz Şekil 4a'da gösterilmiştir. İzdeki her bir pik, bir protein alt alanının açılmasını temsil ederken, son pik reseptör-ligand kompleksinin ayrışmasına karşılık gelmektedir.

Bu çalışmada incelenen CBM-kohesin-...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Tek moleküllü kuvvet spektroskopisi deneylerinden anlamlı veriler elde etmek için iyi tanımlanmış ve tekrarlanabilir çekme geometrileri elde etmek çok önemlidir. Burada kullanılan protokol, tanımlanmış bir çekme geometrisinde protein komplekslerinin bölgeye özgü immobilizasyonu ile sonuçlanır.

Bu çalışmada kullanılan konsollar, kuvvet hassasiyetleri ve sudaki yüksek rezonans frekansları nedeniyle seçilmiştir. Ayrıca, yaklaşık 10 nm'lik küçük uç eğriliği, çoklu etkileşim olasılığının azalması n...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Yazarlar, Avrupa Araştırma Konseyi'nin Hermann Gaub'a verdiği ileri düzey hibeden fon sağlandığını kabul ediyor. Michael A. Nash, Society in Science - The Branco Weiss Fellowship programından sağlanan fonu minnetle kabul eder. Yazarlar, Weizmann Bilim Enstitüsü'nden Edward A. Bayer, Yoav Barak ve Daniel B. Fried'e bu çalışmada kullanılan proteinleri cömertçe sağladıkları için teşekkür eder. Yazarlar yararlı tartışmalar için Hermann E. Gaub, Elias M. Puchner ve Stefan W. Stahl'a teşekkür eder.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
3-Aminopropil dimetil etoksisilanABCR GmbHAB110423
5 kDa NHS-PEG-maleimidRapp Polimer13 5000-65-35
TCEP Disülfür indirgeyici jelThermo Scientific, Pierce77712www.thermoscientific.com/pierce
Tris(hidroksimetil)aminometan
BioLever mini silisyum nitrür konsollarOlympusBL-AC40TS-C2Yumuşak partiler
XYZ Piezoelektrik aktüatörlerPhysik Instrumente GmbH
Kızılötesi " geniş spektrum" IR lazerSuperlum
MFP-3D AFM Kontrol Cihazıİltica Araştırması
Igor Pro 6.31WavemetricsVeri toplama ve analizi
Sodyum klorür
Kalsiyum klorür
pH Metre
Sodyum borat
Cımbız
Kapak gözlükleriThermo Scientific, Menzel-Glä ser24 mm çap, 0,5 mm kalınlık
PTFE numune tutucuısmarlama
Sonikatör banyosu
Etanolanalitik saflık
Sülfürik asit (konsantre)analitik saflık
Hidrojen peroksit (% 30)analitik saflık
Orbital çalkalayıcı
Toluenanalitik saflık
Filtre kağıdı
Cam slaytlar Mikrotüpler
Mikropipetler
Mikrotüpler için uygunsantrifüj
Döndürücü
Petri kapları
Beherler
Optik mikroskop

Kaynaklar

  1. Bayer, E. A., Belaich, J. P., Shoham, Y., Lamed, R. The cellulosomes: Multienzyme machines for degradation of plant cell wall polysaccharides. Annu. Rev. Microbiol. 58, 521-554 (2004).
  2. Bayer, E. A., Lamed, R., White, B. A., Flint, H. J. From Cellulosomes to Cellulosomics. Chem. Rec. 8 (6), 364-377 (2008).
  3. Binnig, G., Quate, C. F. Atomic Force Microscope. Phys. Rev. Lett. 56 (9), 930-933 (1986).
  4. Garcı́a, R., Perez, R. Dynamic atomic force microscopy methods. Surf. Sci. Rep. 47 (6), 197-301 (2002).
  5. Engel, A., Müller, D. J. Observing single biomolecules at work with the atomic force microscope. Nat. Struct. Biol. 7 (9), 715-718 (2000).
  6. Li, H., Cao, Y. Protein Mechanics: From Single Molecules to Functional Biomaterials. Acc. Chem. Res. 43 (10), 1331-1341 (2010).
  7. Florin, E. -L., Moy, V. T., Gaub, H. E. Adhesion forces between individual ligand-receptor pairs. Science. 264 (5157), 415-417 (1994).
  8. Oberhauser, A., Hansma, P., Carrion-Vazquez, M., Fernandez, J. Stepwise unfolding of titin under force-clamp atomic force microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (2), 468-472 (2001).
  9. Puchner, E. M., Gaub, H. E. Force and function: probing proteins with AFM-based force spectroscopy. Curr. Opin. Struct. Biol. 19 (5), 605-614 (2009).
  10. Rief, M., Gautel, M., Oesterhelt, F., Fernandez, J., Gaub, H. Reversible unfolding of individual titin immunoglobulin domains by AFM. Sci. 276 (5315), 1109-1112 (1997).
  11. Stahl, S. W., Nash, M. A., et al. Single-molecule dissection of the high-affinity cohesin–dockerin complex. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (50), 20431-20436 (2012).
  12. Boland, T., Ratner, B. D. Direct measurement of hydrogen bonding in DNA nucleotide bases by atomic force microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (12), 5297-5301 (1995).
  13. Morfill, J., Kühner, F., Blank, K., Lugmaier, R. A., Sedlmair, J., Gaub, H. E. B-S Transition in Short Oligonucleotides. Biophys. J. 93 (7), 2400-2409 (2007).
  14. Rief, M., Clausen-Schaumann, H., Gaub, H. E. Sequence-dependent mechanics of single DNA molecules. Nat. Struct. Biol. 6 (4), 346-350 (1999).
  15. Severin, P. M. D., Zou, X., Gaub, H. E., Schulten, K. Cytosine methylation alters DNA mechanical properties. Nucleic Acids Res. 39 (20), 8740-8751 (2011).
  16. Geisler, M., Balzer, B. N., Hugel, T. Polymer Adhesion at the Solid-Liquid Interface Probed by a Single-Molecule Force Sensor. Small. 5 (24), 2864-2869 (2009).
  17. Giannotti, M. I., Vancso, G. J. Interrogation of Single Synthetic Polymer Chains and Polysaccharides by AFM-Based Force Spectroscopy. Chem. Phys. Chem. 8 (16), 2290-2307 (2007).
  18. Hugel, T., Rief, M., Seitz, M., Gaub, H., Netz, R. Highly Stretched Single Polymers: Atomic-Force-Microscope Experiments Versus Ab-Initio Theory. Phys. Rev. Lett. 94 (4), 10-1103 (2005).
  19. Nash, M. A., Gaub, H. E. Single-Molecule Adhesion of a Stimuli-Responsive Oligo(ethylene glycol) Copolymer to Gold. ACS Nano. 6 (12), 10735-10742 (2012).
  20. Merkel, R., Nassoy, P., Leung, A., Ritchie, K., Evans, E. Energy landscapes of receptor-ligand bonds explored with dynamic force spectroscopy. Nature. 397 (6714), 50-53 (1999).
  21. Morfill, J., Neumann, J., et al. Force-based Analysis of Multidimensional Energy Landscapes: Application of Dynamic Force Spectroscopy and Steered Molecular Dynamics Simulations to an Antibody Fragment–Peptide. Complex. J. Mol. Biol. 381 (5), 1253-1266 (2008).
  22. Ortiz, C., Hadziioannou, G. Entropic Elasticity of Single Polymer Chains of Poly(methacrylic acid) Measured by Atomic Force Microscopy. Macromolecules. 32 (3), 780-787 (1999).
  23. Bustamante, C., Marko, J. F., Siggia, E. D., Smith, F. Entropic Elasticity of l-phage DNA. Science. 265 (5178), 1599-1600 (1994).
  24. Marko, J. F., Siggia, E. D. Stretching DNA. Macromolecules. 28 (26), 8759-8770 (1995).
  25. Puchner, E. M., Franzen, G., Gautel, M., Gaub, H. E. Comparing Proteins by Their Unfolding Pattern. Biophys. J. 95 (1), 426-434 (2008).
  26. Livadaru, L., Netz, R. R., Kreuzer, H. J. Stretching Response of Discrete Semiflexible Polymers. Macromolecules. 36 (10), 3732-3744 (2003).
  27. Zimmermann, J. L., Nicolaus, T., Neuert, G., Blank, K. Thiol-based, site-specific and covalent immobilization of biomolecules for single-molecule experiments. Nat. Protoc. 5 (6), 975-985 (2010).
  28. Gumpp, H., Stahl, S. W., Strackharn, M., Puchner, E. M., Gaub, H. E. Ultrastable combined atomic force and total internal fluorescence microscope. Rev. Sci. Instrum. 80 (6), 063704 (2009).
  29. Gustafsson, M. G. L., Clarke, J. Scanning force microscope springs optimized for optical-beam deflection and with tips made by controlled fracture. J. Appl. Phys. 76 (1), 172 (1994).
  30. Cook, S. M., Lang, K. M., Chynoweth, K. M., Wigton, M., Simmonds, R. W., Schäffer, T. E. Practical implementation of dynamic methods for measuring atomic force microscope cantilever spring constants. Nanotechnology. 17 (9), 2135-2145 (2006).
  31. Proksch, R., Schäffer, T. E., Cleveland, J. P., Callahan, R. C., Viani, M. B. Finite optical spot size and position corrections in thermal spring constant calibration. Nanotechnology. 15 (9), 1344-1350 (2004).
  32. Ainavarapu, S. R. K., Brujic, J., et al. Contour Length and Refolding Rate of a Small Protein Controlled by Engineered Disulfide Bonds. Biophys. J. 92 (1), 225-233 (2007).
  33. Dietz, H., Rief, M. Detecting Molecular Fingerprints in Single Molecule Force Spectroscopy Using Pattern Recognition. Jap. J. Appl. Phys. 46, 5540-5542 (2007).
  34. Evans, E., Ritchie, K. Dynamic strength of molecular adhesion bonds. Biophys. J. 72 (4), 1541-1555 (1997).
  35. Dietz, H., Rief, M. Protein structure by mechanical triangulation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (5), 1244-1247 (2006).
  36. Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. Intrinsic Rates and Activation Free Energies from Single-Molecule Pulling Experiments. Phys. Rev. Lett. 96 (10), 108101 (2006).
  37. Friddle, R. W., Noy, A., De Yoreo, J. J. Interpreting the widespread nonlinear force spectra of intermolecular bonds. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (34), 13573-13578 (2012).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Atomik Kuvvet MikroskopisiKohezin Dockerin Etkile imiSel lozom MontajProtein A lma KuvvetleriDinamik Kuvvet SpektrumuBell Evans ModeliB lgeye zg mmobilizasyonResept r Ligand Ba lanmasKinetik Ayr lma H zlar

İlgili makaleler