Lenf düğümü Stromal Hücre Menşe Çalışmaları Lenf-yağ Pad Kimeralar Üretimi

Summary

Lenf nodu stromal hücre orijininin incelenmesi için lenf nodu/yağ yastığı kimeralarının oluşturulması anlatılmaktadır. Yöntem, yeni doğan farelerden ve embriyonik yağ yastıkçıklarından lenf düğümlerinin izolasyonunu, kimerik lenf nodu yağ yastıkçıklarının oluşturulmasını ve bunların bir konakçı farenin böbrek kapsülü altına transferini içerir.

Abstract

Strom, lenf nodu yapısının ve fonksiyonunun önemli bir bileşenidir. Bununla birlikte, kökeni, kesin hücresel bileşimi ve oluşumunu yöneten mekanizmalar hakkında çok az şey bilinmektedir. Lenf nodları her zaman adipoz doku içinde kapsüllenir ve son zamanlarda lenf nodu stroması oluşumu için bu ilişkinin önemini gösterdik. Adiposit öncü hücreleri, gelişimi sırasında lenf noduna göç eder ve Lenfotoksin-b reseptörünün devreye girmesi üzerine adipogenezi kapatır ve lenfoid stromal hücrelere farklılaşır (Bénézech ve ark.¹⁴). Yağ dokusunun lenfoid stroma potansiyeline dayanarak, lenf nodu stromal hücre öncüllerinin soy izlemesine izin veren bir lenf nodu / yağ yastığı kimerası kullanan bir yöntem sunuyoruz. Yenidoğan lenf nodlarının ve EYFP ⁺ embriyonik yağ dokusunun nasıl izole edileceğini ve bir LN / EYFP ⁺ yağ yastığı kimerasının nasıl yapılacağını gösteriyoruz. Bir konakçı farenin böbrek kapsülü altına transfer edildikten sonra, lenf nodu lokal yağ dokusu öncü hücrelerini içerir ve oluşumunu tamamlar. Elde edilen lenf nodlarındaki EYFP ⁺ yağ yastıkçığı hücrelerinin döl analizi, enzimatik olarak sindirilen lenf nodlarının akış sitometrik analizi veya lenf nodlarının kriyoseksiyonlarının immünofloresan analizi ile gerçekleştirilebilir. Farklı nakavt fare modellerinden yağ pedleri kullanarak, bu yöntem farklı lenf nodu stromal hücre popülasyonlarının kökenini analiz etmenin etkili bir yolunu sağlayacaktır.

Introduction

Lenf düğümleri (LN'ler), lenfatik damar sistemi ağı boyunca vücudun stratejik bölgelerinde bulunan bağışıklık sisteminin kilit organlarıdır. Antijenlerin ve patojenlerin filtrasyonunu sağlarlar ve lenfositlere antijen sunumu ve adaptif immün yanıtların indüklenmesi için bir alan sağlarlar. LN'nin temel yapısını oluşturan ve adaptif immün yanıtın farklı hematopoietik katılımcılarının hareketini düzenleyen stroma, bu organların işlevinin merkezinde yer alır. Farklı stromal hücre popülasyonları, bağışıklık sisteminin hematopoietik bileşeninin hareketleri, lokalizasyonu, hayatta kalması, çoğalması ve olgunlaşması için gerekli ve spesifik ipuçları sağlar^1-3. Yetişkin LN stromal hücreleri üç kategoriye ayrılır: kan endotel hücreleri, lenfatik endotel hücreleri ve fibroblastlar. Bu üç kategori heterojen popülasyonları kapsar. Fibroblastik popülasyonlar fibroblastik retiküler hücreler (FRC), foliküler dendritik hücreler (FDC), marjinal retiküler hücreler (MRC), kapsülü oluşturan fibroblastlar, medulla ve henüz tanımlanmamış diğer hücreleri içerir^1-5. Farklı LN stromal hücre popülasyonlarının kökenleri ve olgunlaşmasını yöneten mekanizmalar belirsizdir ve spesifik LN stromal hücre popülasyonlarının kader haritasına izin veren spesifik belirteçlerin yokluğu, çalışmalarını özellikle zorlaştırmaktadır. Bununla birlikte, LN stromal hücrelerinin ontogenezisinin tam olarak anlaşılması, adaptif immün yanıtların, toleransa katkıda bulunan mekanizmaların anlaşılması için gereklidir ve yapay LN'lerin gelişiminin temelini oluşturur.

Şimdiye kadar, LN stromal hücre kökeni ve gelişimi üzerine yapılan çalışmalar, çoğunlukla vahşi tip farelerde ve farklı nakavt fare suşlarında^6-9 embriyolarda ve yenidoğanlarda LN gelişiminin doğrudan değerlendirilmesi ile sınırlı kalmıştır. Bu yaklaşımlar, LN gelişimi için önemli olan genlerde delesyonlar taşıyan bazı fare suşlarının embriyonik ve perinatal ölümcüllüğü ile sınırlıdır. Ayrıca, lenfoid doku gelişimi için gerekli olan bazı genler, RANK^10-11 veya NF-κB2^12'de olduğu gibi çok çeşitli biyolojik süreçlerde de yer almaktadır. Bu sorunları ele almak için, bir konakçı farenin böbrek kapsülü altında embriyonik LN'lerin izolasyonu ve transplantasyonu gerçekleştirilmiştir^12-13. Bu teknik, örneğin, organ gelişimini ve konakçı hücrelerin işe alımını ve organizasyonunu değerlendirmek için genetik olarak değiştirilmiş embriyonik LN'lerin vahşi tip bir ortamda transferine izin verir. Bununla birlikte, yetişkin bir konağın böbrek kapsülü altına aşılanan embriyonik LN'nin büyümesi bozulur ve bu nedenle bu tekniğin kullanımı sınırlanır.

LN'ler ve yağ birikintileri anatomik olarak yakından ilişkilidir ve embriyogenez sırasında eş zamanlı olarak gelişirler. Yakın zamanda, LN/adipoz doku birlikteliğinin, LN'ler için stromal hücre progenitörlerinin sağlanmasında çok önemli bir rol oynadığını gösterdik. Özellikle, LTβR yoluyla sinyalleşme, adipogenezi bloke ederek ve bunun yerine bir LN stromal hücre fenotipi^14'e doğru olgunlaşmayı teşvik ederek adiposit öncü hücrelerinin kaderini kontrol eder. Burada, gelişmekte olan LN'de yağ dokusundan türetilmiş hücrelerin izlenmesine izin veren LN-yağ pedi kimeralarının üretilmesine dayanan bir yöntemi açıklıyoruz. Bu yöntem, yağ dokularının farklı LN stromal hücre popülasyonlarına katkısını belirlemek için faydalı olacak ve genetik olarak değiştirilmiş fare suşlarından alınan dokuların kullanımı ile birleştirildiğinde, farklı LN stromal hücre alt kümelerinin farklılaşmasını kontrol eden mekanizmaların daha iyi anlaşılmasını sağlayacaktır.

Protocol

Fareler, Birleşik Krallık İçişleri Bakanlığı ve yerel etik kurul düzenlemelerine göre Birmingham Üniversitesi'ndeki Biyomedikal Hizmet Birimi'nde SPF koşulları altında yetiştirildi ve bakımı yapıldı. Bu protokolde açıklanan tüm prosedürler, hem yerel etik kurul hem de İçişleri Bakanlığı tarafından onaylanmış bir Proje Lisansı kapsamındadır.

1. Yenidoğan LN'lerinin İzolasyonu

1. Yeni doğan fareleri servikal çıkık ile kurban edin.
2. Başı bölümlere ayırın ve vücudu torasik bölgenin tepesinden karın bölgesinin altına kadar makasla açın ve tüm iç organları (kalp, akciğerler, karaciğer, bağırsak, böbrek, mesane) karın boşluğundan dikkatlice çıkarın.
3. Vücudu RF10 ortamı (% 10 fetal sığır serumu, 100 U / ml penisilin, 100 mg / ml streptomisin ve 2 mM L-glutamin ile desteklenmiş RPMI1640 ortamı) içeren 2 mm'lik bir Petri kabına aktarın. Bu adımdan itibaren dokular steril koşullar altında tutulacak ve bir doku kültürü başlığında ele alınacaktır.
4. Vücudu RF10 içeren yeni bir 90 mm Petri kabına aktarın.
5. Diseksiyon mikroskobu altında, peritonu kasık bölgesindeki deriden dikkatlice ayırın. Kasık LN, yağ yastıkçığındaki üç kan damarının kesişme noktasında bulunur.
6. LN'yi dikkatlice çıkarın. Tüm yağ dokusunun alındığından emin olun. LN'yi RF10 ortamı içeren 50 mm'lik bir Petri kabına aktarın. İşleme devam ederken dokuları buz üzerinde tutun.

2. E18.5 Yağ Yastıkçıklarının İzolasyonu

1. Gebeliğin 18.5. gününde (E18.5) fare embriyoları oluşturmak için, gece boyunca kafes başına bir dişi ve bir erkek fare yerleştirerek zamanlanmış gebelikler ayarlayın. Sabahları fareleri ayırın ve vajinal tıkaç olup olmadığını kontrol edin (gebelik günü E0.5).
   1. Gebeliğin 18.5. gününde tıkalı dişileri servikal çıkık ile ötenazi yapın.
   2. Embriyoları çıkarın ve RF10 içeren 90 mm'lik bir Petri Kabına yerleştirin.
2. Bu aşamadan itibaren dokular, doku kültürü başlığında steril teknik kullanılarak ele alınmalıdır. Diseksiyon mikroskobu altında, başı bölümlere ayırın, embriyoları torasik bölgeden karın bölgesinin dibine kadar makasla açın ve tüm iç organları (kalp, akciğerler, karaciğer, bağırsak, böbrek, mesane) vücut boşluğundan dikkatlice çıkarın.
3. Vücudu kalan tüm iç organlardan temizleyin ve diseksiyonu daha zor hale getirebilecek tüm kan izlerini ortadan kaldırmak için PBS'de yıkayın.
4. Temiz gövdeleri RF10 içeren 90 mm'lik yeni bir Petri kabına aktarın.
5. Peritonu kasık bölgesindeki deriden dikkatlice ayırın. Kasık LN, yağ yastıkçığındaki üç kan damarının kesişme noktasında bulunur.
6. LN'yi dikkatlice çıkarın ve atın. Kimeralar için kullanılan yağ yastığının herhangi bir lenfoid stromal hücre tarafından kontamine olmamasını sağlamak için LN'nin tamamen çıkarılması çok önemlidir.
7. Kasık yağ pedini çıkarın ve RF10 ortamı içeren 50 mm'lik bir Petri kabına aktarın. İşleme devam ederken dokuları buz üzerinde tutun.

3. LN-fat Pad Chimera'nın Üretilmesi

1. İn vitro organ kültürü sistemini hazırlayın¹⁵.
   1. Sünger ve filtrelerin hazırlanması: Bu önceden yapılabilir ve süngerler ve filtreler kültür davlumbazındaki bir Petri kabında steril olarak saklanabilir.
      1. Vulkan Underwrap'ı 1-1,5 cm,² parça halinde kesin
      2. Süngerleri damıtılmış suda 2 saat kaynatın.
      3. Süngerleri hücre kültürü davlumbazında birkaç saat kurumaya bırakın.
      4. Filtreleri 20 dakika kaynatın.
      5. Filtreleri hücre kültürü davlumbazında birkaç saat kurumaya bırakın.
   2. % 10 fetal sığır serumu, 10 mM HEPES, 1x MEM Esansiyel Olmayan Amino Asit Çözeltisi, 50 mM 2-Merkaptoetanol, 100 U / ml penisilin, 100 mg / ml streptomisin ve 2 mM L-Glutamin ile tamamlanmış DMEM ortamını hazırlayın.
   3. 50 mm'lik bir Petri kabına 2 ml ortam ekleyin.
   4. Petri kabının dibine bir sünger yerleştirin. Süngerin her iki tarafını da ortama batırarak ıslatın.
   5. Süngerin üzerine bir filtre yerleştirin. Filtre, sıvı-hava arayüzüne yerleştirilmiştir.
2. Diseksiyon mikroskobu altında, bir yenidoğan LN'yi bir embriyonik yağ pedi ile dikkatlice yeniden ilişkilendirin.
3. LN yağ pedi kimerasını filtrenin üzerine yerleştirin.
4. Petri kabını, nemden emin olmak için kapağında birkaç delik bulunan ve altta su bulunan dikdörtgen bir plastik kutuya aktarın.
5. Kutunun kapağını bantla kapatın. Kapaktaki iki deliği açık bırakın.
6. Kutuyu% 5 CO₂ ile 37 ° C'de bir hücre kültürü inkübatörüne aktarın. Kapaktaki delikleri bantla kapatmadan önce kutunun 2 saat dengelenmesine izin verin.
7. LN'nin yağ yastığına yapışmasını ve böbrek kapsülü altına aktarılabilmesini sağlamak için dokuları en az 2 gün inkübe edin.

4. LN-yağ pedi kimerasının konakçı farelerin böbrek kapsülü altına transferi

1. LN-yağ pedi kimeralarını filtreden toplayın ve bunları konakçı farelerin böbrek kapsülünün altına aktarın. Böbrek kapsülü transfer yöntemi daha önce tarif edilmiştir ¹⁶.

5. Aktarılan LN'lerin İzolasyonu

1. Böbrek kapsülünün altında 3-4 hafta sonra, LN yağ yastıkçıkları kimeraları hasat edilmeye hazırdır. Onaylanmış kılavuzu kullanarak konakçı farelere ötenazi yapın.
2. Böbreği konakçı farelerden çıkarın.
3. Diseksiyon mikroskobu altında, LN-yağ pedi kimerasını izole edin ve LN'yi inceleyin.

6. Akış-Sitometrik Analiz için Transfer Edilen LN'lerin Enzimatik Sindirimi

1. Enzimlerin organa nüfuz etmesini sağlamak ve sindirimi kolaylaştırmak için LN'de küçük bir makasla bir kesi yapın.
2. 600 μl sindirim tamponu (RPMI% 1 FCS, 2.5 mg / ml Kollajenaz D, 100 μg / ml DNaz I) içeren 1.5 ml Eppendorf içine bir LN yerleştirin.
3. Çalkalayıcı bir termal blok üzerinde 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin. Her 10 dakikada bir dokuların ayrışmasına yardımcı olmak için yukarı ve aşağı pipetleyin.
4. Tüpe 6 μl EDTA 0.5 M ekleyin ve dokuların ayrışmasını bitirmek için yukarı ve aşağı pipetleyin.
5. 490 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.
6. Hücre peletini, birincil antikorların kombinasyonunu içeren boyama çözeltisinde (PBS,% 0.1 BSA,% 5 sıçan serumu ve% 5 fare serumu) yeniden süspanse edin.
7. Buz üzerinde 30 dakika inkübe edin.
8. PBS'de iki kez yıkayın
9. Gerekirse ikincil antikorlarla 20 dakika inkübe edin.
10. PBS'de 2 kez yıkayın.
11. Akış sitometresinde analiz edin.

7. Aktarılan LN'lerin İmmünofloresan ile Analizi

1. Dondurma ve kriyoseksiyon işlemi sırasında EYFP koruması için fiksasyon: LN'yi PBS,% 4 PFA ve% 10 sükroz çözeltisine koyun ve 3-4 saat bekletin.
2. Küçük bir alüminyum folyo parçası üzerine tek bir küçük damla soğuk OCT bileşiği koyun. Hava kabarcıklarından kaçının. LN'yi damlanın ortasına herhangi bir sıvı olmadan dikkatlice yerleştirin.
3. Alüminyum folyoyu kuru buzun üzerine yerleştirerek organı dondurun.
4. Bir kriyostat kullanarak ekstra yapışkanlı cam slaytlar üzerine 8-10 μm'lik bölümler kesin. Slaytları -20 °C'de saklamadan önce 2 saat kurumaya bırakın.
5. Boyama prosedürleri, kullanılan primer antikorlara göre değişebilir ve aşağıdaki protokolden optimize edilebilir. Bölümleri, birincil antikorların kombinasyonunu içeren boyama çözeltisi (PBS,% 1 BSA) ile boyayın.
6. Nemlendirilmiş bir odada oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
7. PBS'de 5 dakika boyunca iki kez yıkayın
8. İkincil antikorlarla 1 saat inkübe edin.
9. PBS'de 5 dakika boyunca iki kez yıkayın.
10. Kızakları DAPI içeren montaj ortamına monte edin.
11. Floresan veya konfokal mikroskop kullanarak görüntü yakalayın.

Results

Transplantasyondan üç hafta sonra, LN/yağ yastıkçığı kimerası böbrekten geri kazanılır. Chimera artık kendi yağ yastıkçığındaki normal bir LN'ye çok benzemektedir ve LN, yağ dokusunun merkezinde görülebilir (Şekil 1). LN tespit edilemezse, böbrek nakli sırasında kaybolmuş olabilir. LN gelişiminde potansiyel olarak önemli olan genlerin rolünü değerlendirirken, geri kazanılan LN'ler çok küçük kalabilir ve bulunması daha zor olabilir. Bu, LTβR^-/- farelerden alınan yağ dokusunun yenidoğan LN'leri<...

Discussion

Bu makalede, yağ dokusu progenitör hücrelerinin gelişmekte olan LN'lere katkısını test etmek ve ölçmek için bir yöntem ve bunların soylarının analizine izin veren iki teknik sunduk. Embriyonik yağ yastıkçıklarının ve yenidoğan LN'lerinin diseksiyonu hassastır ve gerçek LN-yağ yastığı kimerasının oluşumundan önce birçok uygulama ile kazanılan el becerileri gerektirir. Diseksiyonların kalitesini kontrol etmek için yağ yastıkçıkları ve LN'ler üzerinde akış-sitometrik analiz yapılabilir. Embriyonik yağ yastıkçığı preparasyo...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Merkaptoetanol	Sigma	M3148
50 mm Sterilin Petri Kabı	Appleton Woods	SC265
90 mm Sterilin Petri Kabı	Appleton Woods	SC260
Yapışkanlı slaytlar	Surgipath	00202
Anti-fare CD31 eFluor 450 eBioscience		48-0311
Anti-fare CD4 Alexa 647	eBioscience	51-0041
Anti-fare CD45 PerCP-Cy5.5	eBioscience	45-0451
Anti-fare IgM Rhodamine Red	Stratech	715-296-020-JIR
Anti-fare Podoplanin PE / Cy7	Biolegend	127411
Anti-fare Podoplanin saflaştırılmış	eBioscience	14-5381
Kollajenaz D	Roche
DMEM Orta	Sigma	D5671
DNase I	Sigma	DN25-1G
Dumont # 5 Forseps Inox Biologie	FST	11252-20	Embriyonik ve yenidoğan diseksiyonları için ekstra ince forseps
EDTA çözeltisi 0.5 M	Sigma	E7889
ERTR-7	Biogenesis
Fetal sığır serumu	Sigma	F9665
Sertleştirilmiş ince iris makası düz 11 cm	FST	14090-11	Diseksiyon için küçük makas
HEPES çözeltisi	Sigma	H0887
İzopor Membran Filtreler 0.8 & mu; m ATTP	Millipore	ATTPO 1300
L-Glutamin çözeltisi	Sigma	G7513
MEM Esansiyel Olmayan Amino Asit Çözeltisi (100x)	Sigma	M7145
OCT Bileşik	Doku-Tek	4583
Penisilin-Streptomisin	Sigma	P4458
Kapaklı plastik kutu	Watkins ve Doncaster	E6052	in vitro organ kültürü için sandviç kutusu. CO2 inkübatörde gaz değişimine izin vermek için kapağa iki delik açın.
RPMI 1640 Orta Sigma		R0883
Süngerler Vulkan Underwrap	Patterson Medical	004383
Stereomikroskop	Leica	LEICA MZ95	Yakınlaştırmalı diseksiyon mikroskobu
Thermomixer	Eppendorf	5436
Vektör Laboratuvarları	H-1200		ile Vectashield Montaj Ortamı