Lipoksijenaz (LOX) izozimler nöroinflamatuarasyonu ve nörodejenerasyonu artırabilecek veya azaltabilecek ürünler üretebilir. Gen-çevre etkileşimi çalışması LOX izozime özgü etkileri tanımlayabilir. İki LOX izozim eksikliği olan transgenik çizgilerde nigrostriatal hasarın 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidromiridin (MPTP) modelinin kullanılması, LOX izozimlerinin dopaminerjik bütünlük ve inflamasyona katkısının karşılaştırılmasını sağlar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Parkinson Hastalığında Maskeyi Düşürme Duyarlılık Mekanizmalarına Gen-Çevre Etkileşim Modelleri
Bu makalede
Özet
Özet
Lipoksijenaz (LOX) aktivitesi Alzheimer hastalığı gibi nörodejeneratif bozukluklara karışmıştır, ancak Parkinson hastalığı (PD) patogenezinde etkileri daha az anlaşılmaktadır. Gen-çevre etkileşim modelleri, sadece genetik veya toksik bir hastalık modeli kullanılarak gözlemlenemeyen toksisitedeki belirli hücresel yolların etkisinin maskesini düşürmede yardımcı olur. Farklı LOX izozimlerinin PD ile ilgili nörodejenerasyona seçici olarak katkıda bulunup bulunmadığını değerlendirmek için, transgenik(yani 5-LOX ve 12/15-LOX eksikliği) farelere hücre yaralanmasını ve bozukluktaki ölümü taklit eden bir toksinle meydan okunabilir. Burada, LOX izozimlerinin PD ile ilgili nörodejenerasyona belirgin katkılarını ortaya çıkarmak için nigrostriatal bir lezyon üreten nörotoksin, 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidromiridin (MPTP) kullanımını açıklıyoruz. Farede MPTP kullanımı ve insan dışı primat, PD'deki nigrostriatal hasarı yeniden oluşturmak için iyi kurulmuştur. MPTP kaynaklı lezyonun kapsamı, dopamin ve metabolitlerinin HPLC analizi ve dopamin sentezi için hız sınırlayıcı enzim olan tirozin hidroksilaz (TH) için striatumun yarı nicel Batı blot analizi ile ölçülür. LOX iozim seçici duyarlılığı gösterebilen inflamatuar belirteçleri değerlendirmek için substantia nigra içeren beyin bölümlerinde glial fibril asidik protein (GFAP) ve Iba-1 immünofizokimyası, striatal homojenatlar üzerinde ise GFAP Batı blot analizi yapılır. Bu deneysel yaklaşım, nigrostriatal dejenerasyon ve PD'nin altında kalan gen-çevre etkileşimleri hakkında yeni içgörüler sağlayabilir.
Giriş
Gen-çevre etkileşim modellerinin kullanımı, idiyopatik Parkinson hastalığını (PD) etkilemesi muhtemel risk faktörlerini taklit etmek için bir yaklaşım sağlar ve sadece genetik veya toksik bir sistemin kullanılmasıyla aydınlatılması muhtemel olmayan mekanistik içgörüleri ayırt etme fırsatı sunar1,2. Burada bu noktayı göstermektedir ve lipoksijenaz (LOX) izozim aktivitesinin nöroinflamasyon ve toksisite üzerindeki seçiciliğini daha iyi anlamak için nigrostriatal dejenerasyon3'ün 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidromiridin (MPTP) fare modelinin uygulanmasını açıklıyoruz4. LOX izozimler için bir rol periferik bozukluklarda5,6 ve i....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Not: Tüm hayvan prosedürleri ve hayvan bakım yöntemleri kurumun Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmalıdır. Burada açıklanan çalışma, SRI International'ın IACUC tarafından belirlenen yönergelere uygun olarak gerçek gerçekleştirildi.
1. LOX eksikliği olan farelerin edinimi ve bakımı
- 7-8 haftalıkken 5-LOX eksikliği veya 12/15-LOX eksikliği olan fareler ve ilgili suş ve cinsiyetle eşleşen kontrolleri satın alın ve varıştan sonra tesise alışmak için birkaç gün izin verin.
- Fareleri 12-h açık-karanlık bir döngüde grup konutunda koruyun ve....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu toksin maruziyet paradigması, MPTP ve salin enjekte edilen hayvanlarda önemli ve tespit edilebilir% 20 striatal dopamin tükenmesi üretebilir. Farklı mptp çok az veya çok lezyon verebilir dikkat önemlidir; bu nedenle, daha iyi hassasiyet için, yeni bir nörotoksin çok fazla alındığında transgeniklerde kullanılmadan önce wildtype farelerde bir ön deney önerilir. Hafif-orta dereceli lezyon kullanımı transjenin etkisinin gözlenmesini sağlar; şiddetli bir lezyon, zayıflamak için çok sağlam veya zararlı bir yaralanma ile zar.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu gen-çevre etkileşimi çalışmasının tasarımı, nigrostriatal yoldaki 5-LOX izoziminin çift doğası hakkında yeni bilgiler edinmemizi sağladı. 5-LOX izozim ve wildtype çöp arkadaşlarından yoksun transgeniklerde salin veya MPTP tedavisinden sonra striatal monoaminleri ölçmek için HPLC yaparak, eksikliğinin toksik koşullar altında koruyucu göründüğünü not edebildik (Şekil 1), ancak normal koşullarda enzim eksikliği striatal dopamin seviyelerini azaltır ve zararlı olabilir. Böylece, 5-LOX izozim normal koşull.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Açıklayacak bir şey yok.
Teşekkürler
Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri NIGMS 056062 tarafından finanse edildi.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 1-Metil-4-fenil-1,2,3,6-tetra-hidropiridin hidroklorür (MPTP-HCL) | PD modellemesi için | Sigma-Aldrich | M0896 |
| % 4 Formaldehit (paraformaldehit) çözeltisi, fosfat tamponlu (PFA) | fiksasyonu için | American MasterTech Scientific | BUP0157 |
| Perklorik asit ACS reaktifi,% 70 (PCA) | HPLC asit ekstraksiyonu | ||
| için Sigma-Aldrich 244252Doku | homojenizasyonu için | Sigma-Aldrich | T1503 |
| Etilendiaminotetraasetik asit disodyum tuzu dihidrat (EDTA) | Doku homojenizasyonu için | Sigma-Aldrich | E1644 |
| Proteaz inhibitörü kokteyli | Doku homojenizasyonu için | Sigma-Aldrich | P8340 |
| Doku homojenizasyonu için | fosfataz inhibitör kokteyli | Sigma-Aldrich | P5726 |
| Lowry protein tahlili için | Sodyum Hidroksit (NaOH) | Sigma-Aldrich | S5881 |
| Sükroz, moleküler biyoloji ve ge; %99,5 (GC) | Kriyoproteksiyon için | Sigma-Aldrich | S0389 |
| Fosfat tamponlu tuzlu su, toz, pH 7.4 (0.01 M PBS için) | IHC BCA | Sigma-Aldrich | P3813 |
| Protein tayini için | Pierce/Thermo | 23225 | |
| Novex %12 Tris-Glisin Mini Jeller 1.0 mm, SDS-PAGE | NuPAGE | Invitrogen/Life Technologies | |
| SDS-PAGE için | Canlandırıcı/Yaşam Teknolojileri | NP0007 | |
| Novex Sharp Önceden Boyanmış Protein Standardı | Invitrojen / Yaşam Teknolojileri | LC5800 | protein merdiveni |
| SDS-PAGE için | Glisin | Sigma-Aldrich | G7126 |
| Sodyum dodesil sülfat, elektroforez,% 98,5 (SDS) | SDS-PAGE için | Sigma-Aldrich | L3771 |
| Metil Alkol, Susuz, Reaktif | American MasterTech Scientific | ||
| Yağsız kuru süt tozu | İmmünoblotlama için | karanfil | n/a |
| %5 asetik asit içinde Ponceau S çözeltisi | İmmünoblotlama için | Sigma-Aldrich | P7170 |
| Anti-Tirozin Hidroksilaz (TH), koyun poliklonal | Chemicon / Millipore | AB1542 | immünofloresan için |
| Anti-Tirozin Hidroksilaz (TH), tavşan poliklonal | Pel-Freez Biologicals | P40101-0 | immünoblotlama |
| için Anti-β Aktin, tavşan | Sigma-Aldrich | A2066 | immünoblotlama için |
| Anti-Glial Fibriler Asidik Protein (GFAP), | immünofloresan | Chemicon / Millipore | AB5804 |
| , fare monoklonal | Covance Inc. | İmmünoblotlama için | SMI-22R |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | immünoblotlama için |
| Keçi Anti-Tavşan IgG (H + L), Peroksidaz Konjuge ve nbsp; | İmmünofloresan | Fisher Scientific | 31462 |
| , peroksidaz konjuge | Pierce/Thermo | 31480 | immünofloresan |
| keçi anti-fare için, peroksidaz konjuge | Pierce/Thermo | 31430 | immünofloresan |
| SuperSignal West Pico Kemilüminesan Substrat | Pierce/Thermo | 34078 | immünoblotlama için |
| CL-XPosure Film 7 inç x 9,5 inç | İmmünoblotlama için | Pierce / Thermo | 34089 |
| Western Blot Sıyırma Tamponunu Geri Yükle | İmmünoblotlama için | Pierce/Thermo | 21059 |
| Sitrik asit monohidrat, ACS reaktifi vb.; 99.0% | IHC | Sigma-Aldrich | C1909 |
| Polivinilpirolidon (PVP) | için | Sigma-Aldrich | P5288 |
| IHC için | liyofilize | Sigma-Aldrich | A3294 |
| IHC için | |||
| Eşek anti-Tavşan IgG, Alexa Fluor 568 etiketli | IHC | Invitrogen/Life Technologies | A10042 |
| , FITC | Jackson ImmunoResearch | 713-095-147 | DAPI |
| Vektör Laboratuvarları | VECTASHIELD Sert Set Montaj Ortamı | H-1500 | IHC |
| Normal Keçi | Serumu Millipore | S26-100ML | için IHC |
| VECTASTAIN ABC Kiti (Tavşan IgG ) | Vektör Laboratuvarları | PK-4001 | ; 10 & l 1 ml PBS başına A ve B çözeltilerinin her biri (talimatlara göre |
| ) DAB Peroksidaz Substrat Kiti, IHC için 3,3'-diaminobenzidin | Vektör Laboratuvarları | SK-4100 | ; 5 ml soğuk ddH < alt > 2 < / alt >O başına 2 damla tampon stok çözeltisi, 2 damla DAB ve 1 damla H < alt > 2 < / alt > O <> 2 < / alt > (H < alt > 2 < / >alt ekleyin O2 kullanımdan hemen önce eklenir) |
| Hidrojen peroksit,% 30 | Sigma-Aldrich | 216763 IHC | söndürme adımı |
| için IHC | |||
| Cresyl Violet Çözeltisi, Düzenli Mukavemet | FD Neurotechnologies | PS102-01 | Iba1 IHC |
| %95 Etanol, reaktif alkol | IHC için Sigma-Aldrich | R8382 | dehidrasyonu |
| 100 Mutlak etanol | Mallinckrodt | 7019-10 | IHC |
| Asetik asit | Sigma-Aldrich | A6283 | IHC |
| Ksilen | giderme Sigma-Aldrich | 534056 | temizleme maddesi IHC |
| DPX Mountant | Sigma-Aldrich | 06522 | için montaj ortamı DAB IHC |
| O.C.T. Bileşik - Donmuş Kesit Gömme Ortamı | Amerikan MasterTech Scientific | EMOCTCS | kriyostat kesimi için gömme ortam |
| DAB çözeltisini dekontamine etmek için | permanganat | Sigma-Aldrich | 223468 |
| 3,4-Dihidroksifenilasetik asit (DOPAC) | |||
| Dopamin hidroklorür | Sigma-Aldrich | H8502 | HPLC |
| Homovanilik asit (HVA) | için Sigma-Aldrich 850217 | HPLC Perklorik | H1252 |
| HPLC için | %70 | Sigma-Aldrich | 244252 |
| HPLC için | sodyum dihidrojen fosfat monohidrat | Sigma-Aldrich | 71504 |
| sitrik asit monohidrat | HPLC için | 1-Oktansülfonik | |
| Sigma-Aldrich | O8380 | ||
| HPLC | için EDTA Sigma-Aldrich | E1644 | HPLC |
| için Asetonitril | EMD | AX0145-1 | |
| HPLC dereceli damıtılmış deiyonize su (ddH2< / sub>O) | HPLC | millipor; | |
| m GSTF membran | Filtrasyon için | millipore | |
| Corning Netwells | Sigma-Aldrich | CLS3477 | polyester ağ tabanlı polistiren uç, IHC |
| Ultrasonik hücre bozucu (Soniprep 150) | MSE | MSE.41371.274 | |
| Mikrosantrifüj | Eppendorf | 5414R | |
| ESA MD-150 ters fazlı kolon ve nbsp; | ESA | ||
| HPLC Pompası (Ultimate 3000) | Dionex | ISO-3100BM | |
| HPLC Otomatik Numune Alma Cihazı (Ultimate 3000) | Dionex | WPS-3000TSL | |
| Elektrokimyasal dedektör | ESA | Coulochem III | |
| Koruma Hücresi | ESA | 5020 | |
| Analitik Hücre | ESA | 5011A | |
| Chromeleon yazılımı | Dionex | ||
| Eclipse E400 | Nikon | E400 | ışık/floresan mikroskobu |
| Tek kullanımlık fare kafesi | Ancare | N10HT | |
| Mikrofiltre üst | Ancare | N10MBT | |
| 5-LOX eksikliği olan fareler | Jackson Laboratuvarı | 004155 | |
| 12/15-LOX eksikliği olan fareler | Jackson Laboratuvarı 002778 |
Kaynaklar
- Manning-Bog, A. B., Langston, J. W. Model fusion, the next phase in developing animal models for Parkinson's disease. Neurotox. Res. 11, 219-240 (2007).
- Vance, J. M., Ali, S., Bradley, W. G., Singer, C., Di Monte, D. A. Gene-environment intera....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
