Bakteriyel biyolüminesans gen kasetinin ifade eden memeli hücreleri ( Lux) Özerk ışık üretirler. Kimyasal maruz kalma üzerine çıkan biyolüminesens dinamikleri bu hücrelerin kolayca yüksek verimli otomasyon için adapte edilebilir bir ucuz, sürekli, gerçek zamanlı toksisite tarama aracı yapma, hücresel büyüme ve metabolizma üzerindeki tedavi etkilerini yansıtacak şekilde gösterilmiştir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Sitotoksisite Sürekli ve gerçek zamanlı izlenmesi için özerk Bioluminescent Memeli Hücre
Bu makalede
Özet
Özet
Memeli hücre tabanlı in vitro deneyleri yaygın olarak toksikolojik çalışmalar için hayvanlar üzerinde test alternatif olarak istihdam edilmiştir ama nedeniyle ateşböceği lusiferaz-tabanlı tarama yöntemlerinin yıkıcı doğası zorunlu paralel numune hazırlama, yüksek para ve zaman maliyetleri nedeniyle sınırlı kalmıştır . Bu video ilgi çekici bir bileşik olan sitotoksik etkilerinin izlenmesi için bir ucuz ve kolay bir yöntem olarak, bir lusiferin substratının yıkıcı ilave gerektirmeyen Bağımsız biyolüminesans memeli hücrelerinin kullanımını tarif etmektedir. Stabil bir şekilde tam bakteriyel biyolüminesans (luxCDABEfrp) geni ifade kaseti, memeli hücreleri bağımsız olarak bir optik sinyal üreten bir harici enerji kaynağı, ya da geleneksel bir numunenin tahrip edilmesi pahalı ve muhtemelen müdahale lusiferin substratının, uyarma ilavesi olmadan 490 nm pik optik görüntüleme işlemi sırasında yapılans. Dış stimülasyon gelen bu bağımsızlık çıkan sinyal sadece aktif metabolizma sırasında tespit, yani sadece hücre bioluminescent reaksiyon korumak için yük getirmektedir. Biyolüminesans üretiminde değişimler hücre büyümesi ve metabolizması üzerindeki olumsuz etkilerin bir göstergesi olduğundan, bu özellik, lux-eksprese eden hücre soyu sitotoksik etkilerine karşı biosentinel olarak kullanım için mükemmel bir aday yapar. Benzer bir şekilde, gerekli örnek imha özerk doğası ve eksikliği zehiri maruz kalma süresi boyunca gerçek zamanlı olarak aynı numune üzerinde tekrar görüntüleme izin verir ve otomatik bir şekilde mevcut görüntüleme ekipmanı kullanarak çoklu örnekler yardımıyla gerçekleştirilebilir.
Giriş
Onlar Gıda ve İlaç İdaresi tarafından tüketici kullanım için onaylanmıştır önce ABD'de, insan tüketimine yönelik ilaç ve diğer ürünleri kapsamlı bir değerlendirme gerektirir. Bu testinin yapılması için mali yük büyük ölçüde tüketiciler için artan maliyet yeni bileşik geliştirme ve bu nedenle çevirir maliyetini artırır geliştirici 1, yerleştirilir. Bu tarama geleneksel olarak çok insan ana için temsilci olarak vekaleten Hayvanlar üzerinde kullanılan olsa da, bu (Tox / ADME adsorpsiyon, dağılım, metabolizma, boşaltım ve toksisite her yıl harcanan yaklaşık 2800000000 $ ile, büyük bir mali yük olduğu kanıtlanmıştır ) Tek başına tarama 2 ve hayvan modellerinde güvenilir insan toksikolojik yanıtları 3 tahmin edemez düşündüren montaj kanıtlar. Bu nedenle, in vitro insan hücre kültürü tabanlı test nedeniyle nispeten daha düşük olan son yirmi yılda popülerlik kazanmıştırmaliyet, daha yüksek verim ve insan biyoyararlanım ve toksikoloji 4 daha iyi temsil. Mevcut hücre kültürü bazlı toksisite tarama yöntemleri hücre canlılığı 5 değerlendirmek için, hücresel membran bütünlüğünü sondalama veya mitokondriyal aktivite düzeyi izleme, endojen olarak mevcut sitoplazmik enzimlerin aktivitesinin taranması, örneğin ATP seviyelerinin ölçümü gibi, uç noktalar, istihdam , 6. Ölçümler ve böylece tek bir zaman noktasında veri üreten alınabilir önce Ancak, ne olursa olsun seçilen nokta dolayı, bu yöntemler her numunenin imha gerektirir. Sonuç olarak, çok sayıda numune hazırlanmış ve temel toksikolojik kinetik çalışmalar için paralel olarak tedavi, daha yeni bir bileşik geliştirilmesi için gerekli maliyet ve iş gücü ekleyerek olması gerekir. Alternatif olarak, bu tür tahliller kullanılarak Gaussia 7 lusiferaz, Vargula lusiferaz 8 ve 9 Metridia lusiferaz gibi lusiferaz salgılananhücre parçalama için olan ihtiyacı ortadan kaldırır ve son nokta ölçümü için, ortamın bir kısmını gerektirir, ancak, yine de bu önceden belirlenmiş zaman noktalarında, örnekleme ile sınırlıdır ve ayrıca dışsal ışık aktive edici yüzeyler ilavesi gerektiren geliştirilmiştir.
Örnek gerekli imha zararına yanı sıra substratlar maliyeti ortadan kaldırmak için önlemek için, bir insan hücre hattı benzer canlı hücreler sürekli olarak izlenmesi için izin vermek için tam bakteriyel biyolüminesans (lux) gen kasetinin (luxCDABEfrp) ifade eden tasarlandı floresan-boya tabanlı canlı hücre görüntüleme için, ancak ek foton-aktive edici ve mikroskobik inceleme prosedürler olmaksızın. Bu hücre hattı, böylece numunenin imha kaçınarak, yapısal olarak dış uyarılması için gerek olmaksızın sürekli, doğrudan saptanması için bir optik sinyal üretme yeteneğine sahiptir. Mekanik olarak, bu hücrelerden üretilen bioluminescent sinyal nedens luxAB şekillendirilmiş lusiferaz enzim indirgenmiş riboflavin fosfat varlığında (FRP geni tarafından FMN ikinci geri kazanılır FMNH 2, uzun zincirli bir yağ aldehid (endojen maddeleri kullanarak luxCDE gen ürünleri tarafından sentezlenen ve rejenere) oksidasyonunu katalize zaman ürün) ve moleküler oksijen 10. Konakçı hücre içinde, lux kaset ekspresyonu bu nedenle üretilen ve hücre yıkımı veya eksogen bir substrat ilave edilmeden tespit edilmesi ışık sağlar. Benzer şekilde, lux genler ve endojen olarak mevcut FMN ve O 2 cosubstrates ve FMNH 2 FMN dönüşüm destekleyen bir ortamın bakım gereksinimi, arasındaki etkileşim, elde edilen biyolüminesans sinyali sadece oturma tespit edilebilir olmasını sağlar , metabolik olarak aktif hücrelerin.
Bu gereksinimler daha önce o lüks-bas göstermek için istismar edilmiştired bioluminescent çıktı hücresel nüfus büyüklüğü 11 ve zehirli bileşik maruz kalma bir doz-yanıt moda 12 autobioluminescent üretim bozar ile güçlü ilişkilidir. Burada toksisite testi için autobioluminescent memeli hücrelerinin uygulama doğrulamak için temsili bir örnek olarak bilinen DNA hasarına aktivitesi ile bleomisin ailesinin bir antibiyotik otomatik toksikolojik tarama göstermek için, daha önce karakterize edilen autobioluminescent insan embriyonik böbrek (HEK293) hücre hattı 11 kullanır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Hücre Hazırlanması
- Sıvı azot donmuş stok biyolüminesans HEK293 hücreleri bir şişe elde etmek ve Dulbecco'nun Modifiye Edilmiş Eagle% 10 cenin sığır serumu ile desteklenmiş ortamı (DMEM), 0.01 mM esansiyel olmayan amino asitler, 1 x antibiyotik antimikotik ve T, 0.01 mM sodyum piruvat onları büyümeye 37, 75 doku kültürü şişesi ° C ve% 5 CO2.
Not: Medya ve ek parçaları hücre hatları göre değişir ve bu nedenle buna göre seçilmelidir. - Yenile orta her kapsamlı kadar 2-3 gün ~ 80% izdiham.
Not: gerekli hücrelerin miktarı deneysel tasarım dayalı olacaktır. Gerekirse, daha fazla hücre alt kültüre ile elde edilebilir. - Testleri için hasat hücreleri.
- Orta kaldırmak ve fosfat hücreleri yıkayın şişeye yavaşça dönen ve daha sonra çıkarılır ve PBS ile peynir salin (PBS).
- 2 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe tripsin ve eklemeveya hücre kadar şişesi müstakil.
- PBS içinde müstakil hücreleri toplamak ve temiz bir santrifüj tüpü içine aktarabilirsiniz.
Not: nonadherent hücre hatları santrifüj, ayrı hücrelere kullanılan ve PBS ile bir kez yıkayın varsa.
- Hemasitometre ya da başka hücre sayımı sistemi kullanılarak toplam hücre sayısı belirlenir.
- 5 dakika boyunca 300 x g'de hücre süspansiyonu santrifüj. Süpernatantı atın ve taze, önceden ısıtılmış orta hücreleri tekrar süspansiyon.
- Opak bir çok-çukurlu plaka bireysel kuyular içine hücre çekirdeği eşit sayıda. Bu örnekte, plaka 5 x 10 siyah 24 oyuklu plakanın her kuyuya, 1 ml'lik bir hacimde 5 hücreleri. Plaka üç kopya halinde kuyularda ortamına ait eşit bir hacmi negatif kontrol olarak hareket eder.
Not: her iyi kaplama hücrelerin sayısı esnek ve ayrı deneyler için optimize edilebilir. Her bioluminescent hücre hattı için, deneysel hücre sayısı ve biolumi arasındaki ilişkiyi belirlemeknescent çıkış yanı sıra, en az saptanabilir hücre önce herhangi bir toksisite testleri sayılır. Standart koşullar altında görüntüleme nüfusun boyutlarda geniş bir aralığı (örneğin, 1 x Ekim 3-1 x 10 hücre 6) karşısında yer alan bu tedbir, biyolüminesans yapmak için. - Aşağıda tarif edildiği gibi test bileşik (ler) ile birlikte hücre tedavisi.
2. Kimyasal Hazırlama
- Bir konsantre stok çözeltisi olarak test edilen kimyasal hazırlayın. Bu örnekte, bir 100 mg / bleomisin ailesinin bir antibiyotik ml stok çözeltisi kullanın.
Not: organik bir çözücü kimyasal eklenmesi için bir araç olarak kullanıldığında, özellikle de potansiyel taşıyıcı bazlı toksik etkilerini minimuma indirmek için, stok konsantrasyonu, en az 1000 kat, istenen uygulama sonrası konsantrasyon olması önerilir. - Doğrudan hücrelere hazırlanan kimyasal stok ekleyin. Bu örnekte, doz nihai konsantrasyonları 100, 200, 300, ve tri 400 ug / ml 'de ilgi antibiyotikkuyu plicate. Tedavi edilmeyen kontrol olarak hücreler üç kuyu bırakın.
Not: Hedef kimyasal nihai konsantrasyon spesifik deneysel hedeflerine göre seçilmelidir. Konsantrasyonları geniş bir aralık, normalde toksik etkilerin tam bir spektrum elde etmek için test edilir.
3. Görüntüleme ve Veri Analizi
- Hemen kimyasal ilave edildikten sonra, görüntü elde etme ve biyolüminesans ölçümü için uygun enstrümanın görüntüleme odasında plaka yerleştirin.
- Her okuma için bir 10 dakika entegrasyon zaman kullanarak 24 saatlik süre içinde önlem biyolüminesans her 15 dk.
Not: Bu örnekte kullanılan entegrasyon zaman bir başına plaka bazında ve seçtiğiniz diğer luminometreyle kullanılarak her iyi bazında ölçümü için ayarlanabilir. Entegrasyon süresi seçilen bioluminescent hücre hattı dayalı da ayarlanabilir. Biyolüminesans hücre yıkımı ya da herhangi bir dış uyarı olmaksızın özerk üretilir çünkü okumakbulgular spesifik deney amaçları yerine getirmek için arzu edilen herhangi bir zaman noktasında alınabilir. - Uyumlu yazılım kullanarak ilgi bir bölge belirleyerek her kuyudan bioluminescent yoğunluğunu ölçmek. Ya toplam akı (fotonlar / saniye) veya her numunenin (fotonlar / cm / saniye 2 / steridian) olarak ışık çıkışı görüntüleyin.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu çalışmada, autobioluminescent HEK293 hücreleri ve dinamikleri spektrumlu antibiyotik (Şekil 1) tepki olarak 24 saatlik bir süre boyunca sürekli olarak izlenmiştir. Bağlanabilen ve DNA 13 yarılması ile, canlı hücreleri öldürmek için bilinen bleomisinin ailesinin bir üyesi olan bu antibiyotik, toksik etkileri, Pseudocolor görüntü doğrudan görselleştirilebilir tedavi edilmemiş hücrelere kıyasla, biyolüminesans üretiminde bir azalma ile ortaya konmuştur (Şekil 2). Değişen ısla...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu yöntem, canlı hücreler sürekli olarak kullanım süresi boyunca takip edilmesine olanak in vitro sitotoksisite tarama deneyi, bir özerk olarak biyolüminesans memeli hücrelerinin kullanımını gösterir. Bu protokol, esnek ve gerektiğinde gibi belirli deney koşulları karşılamak için modifiye edilebilir. Örneğin, deney akut toksik etkilerini izleme için uygundur Burada yer ama art arda artan zaman aralıklarında (yani her 24 saat) görüntüleme ve arasında standart enkübasyon koşulları altında hücrel...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
DM Kapat, SA Ripp ve GS Sayler 490 BioTech, Inc kurucuları ve sahipleri
Teşekkürler
Bu araştırma çabaları Kimya, Biyomühendislik, Çevre ve ödül numaraları CBET-0853780 ve CBET-1159344 ve Ulusal Sağlık Enstitüleri, Çevre Sağlığı Bilimleri Ulusal Enstitüsü (NIEHS) altında Transport (CBET) Sistemleri, Ulusal Bilim Vakfı Bölümü tarafından desteklenmiştir ödül sayısı 1R43ES022567-01 ve Ulusal Kanser Enstitüsü, ödül sayısı CA127745-01 altında Kanser Görüntüleme Programı kapsamında. Bu çalışmada kullanılan IVIS Lumina aracı ABD Ordusu Savunma Üniversitesi Araştırma Araçları Program elde edilmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| IVIS Lumina | PerkinElmer | Diğer IVIS modelleri ve PMT tabanlı plaka okuyucular da kullanılabilir | |
| Living Imaging 2.0 | PerkinElmer | Bu yazılımın daha yeni güncellemeleri mevcuttur | |
| 75 cm2 hücre kültürü ile muamele edilmiş şişeler | Corning | 430641 | |
| 6 oyuklu doku kültürü ile tedavi edilmiş plakalar | Costar | 07-200-83 | |
| Siyah 24 oyuklu plaka | Greiner Bio-One | 662174 | 96 veya 384 oyuklu plakalar daha yüksek verimli uygulamalar için kullanılabilir |
| Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) | |||
| Fetal sığır serumu | Hyclone | SH3091003 | |
| 100x | Yaşam Teknolojileri | 11140050 | |
| Antibiyotik-Antimikotik, 100x | Yaşam Teknolojileri | 15240062 | |
| Sodyum piruvat, 100mM | Yaşam Teknolojileri | 11360070 | |
| Zeosin, 100 mg/ml | Yaşam Teknolojileri | R25001 | |
| Tripsin, %0.05Yaşam Teknolojileri | 25300062 |
Kaynaklar
- U.S. Food and Drug Administration. Is it really FDA approved? FDA Consumer Health Information. 2, (2009).
- Hartung, T. Toxicology for the twenty-first century. Nature. 460, 208-212 (2009).
- Olson, H., et al. Concordance of the toxicity of pharmaceuticals in humans and in animals. Regul. Toxicol. Pharmacol. 32, 56-67 (2000).
- Stacey, G. Current developments in cell culture technology. Adv. Exp. Med. Biol. 745, 1-13 (2012).
- Li, A. P. Screening for human ADME/Tox drug properties in drug discovery. Drug Discov. Today. 6, 357-366 (2001).
- Li, A. P. In vitro approaches to evaluate ADMET drug properties. Curr. Top. Med. Chem. 4, 701-706 (2004).
- Tannous, B. A. Gaussia luciferase reporter assay for monitoring biological processes in culture and in vivo. Nat. Protoc. 4, 582-591 (2009).
- Thompson, E. M., Nagata, S., Tsuji, F. I. Cloning and expression of cDNA for the luciferase from the marine ostracod Vargula hilgendorfii. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 6567-6571 (1989).
- Lupold, S. E., Johnson, T., Chowdhury, W. H., Rodriguez, R. A real time Metridia luciferase based non-invasive reporter assay of mammalian cell viability and cytotoxicity via the beta-actin promoter and enhancer. PLoS ONE. 7, (2012).
- Meighen, E. A. Molecular biology of bacterial bioluminescence. Microbiol. Rev. 55, 123-142 (1991).
- Close, D. M., et al. Autonomous bioluminescent expression of the bacterial luciferase gene cassette (lux) in a mammalian cell line. PLoS ONE. 5, e12441(2010).
- Determining toxicant bioavailability using a constitutively bioluminescent human cell line. Close, D. M., Hahn, R. E., Ripp, S. A., Sayler, G. S. Biomedical Sciences and Engineering Conference (BSEC), Mar 15-17, Knoxville, TN, , 1-4 (2011).
- Oliva-Trastoy, M., Defais, M., Larminat, F. Resistance to the antibiotic Zeocin by stable expression of the Sh ble gene does not fully suppress Zeocin-induced DNA cleavage in human cells. Mutagenesis. 20, 111-114 (2005).
- Close, D. M., Webb, J. D., Ripp, S. A., Patterson, S. S., Sayler, G. S. Remote detection of human toxicants in real time using a human optimized bioluminescent bacterial luciferase gene cassette bioreporter. Proc. SPIE 8371, Sensing Technologies for Global Health, Military Medicine, Disaster Response, and Environmental Monitoring II; and Biometric Technology for Human Identification IX. 837117, (2012).
- Close, D. M., Hahn, R. E., Patterson, S. S., Ripp, S. A., Sayler, G. S. Comparison of human optimized bacterial luciferase, firefly luciferase, and green fluorescent protein for continuous imaging of cell culture and animal models. J. Biomed. Opt. 16, e12441(2011).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
