Exosome Kantifikasyon ve Boyut Ölçüm Yenilikçi Yöntem

Özet

Bu makalede eksozomların tam kandan izolasyonu ve yarı otomatik bir alet kullanılarak nanopartikül izleme ile daha fazla analiz için bir yöntem sunulmaktadır. Sunulan teknoloji, sıvı süspansiyondaki partikülleri görselleştirmek ve analiz etmek için son derece hassas bir yöntem sağlar.

Özet

Eksozomların biyolojik önemi son zamanlarda giderek artan miktarda bilimsel ve klinik ilgi kazanmış olsa da, karmaşık yolakları, biyoyararlanımları ve sağlık ve hastalıktaki çeşitli işlevleri hakkında hala çok şey bilinmemektedir. Mevcut çalışma, özellikle onkoloji, jinekoloji ve kardiyoloji alanlarında, farklı insan bozuklukları bağlamında eksozomların (in vitro ve in vivo) varlığına ve davranışına odaklanmaktadır.

Ne yazık ki, ne eksozom izolasyonu için altın standart konusunda bir fikir birliği var, ne de kantitatif analizleri için böyle bir yöntem üzerinde bir anlaşma var. Eksozomların saflaştırılması için birçok yöntem ve ayrıca kantitatif ve kalitatif analizleri için birçok olasılık olduğundan, ideal yaklaşım için bir yöntem kombinasyonu belirlemek zordur.

Burada, ultrasantrifüjleme ile insan plazmasından izole edildikten sonra eksozomların karakterizasyonu için yarı otomatik bir yöntem olan nanopartikül izleme analizini (NTA) gösteriyoruz. Sunulan sonuçlar, izolasyon için bu yaklaşımın yanı sıra eksozomların ortalama sayısının ve boyutunun belirlenmesinin, taramalı elektron mikroskobu (SEM) gibi diğer yöntemlerle onaylandığı gibi tekrarlanabilir ve geçerli veriler sağladığını göstermektedir.

Giriş

dolaşımdaki eksozom tam işlevi uzun bir süre için bilinmemektedir. Şimdi bile eksozom tam yolu mekanizması tam olarak anlaşılmış değildir. Eksozomlar taşımak beri antijenler, proteinler ve menşe ebeveyn hücrenin, hücre-hücre sinyal vericiler olarak işlev onları ilgilidir RNA (mRNA ve miRNA) esas öncelik verilmiştir.

Pek çok farklı yöntem izolasyonu ve eksozom ^1,2 nicel tespiti için literatürde tarif edilmiştir. Ancak, 'altın standart' üzerinde görüş birliği ulaşıldı. Bu arada exosome araştırma alanında aktif bilim adamlarının çoğunluğu izolasyonu tutarlı bir yöntem oldukça farklı raporlar ve çalışmalar arasında karşılaştırılabilirlik daha yüksek bir derece elde etmek garanti olduğunu kabul ediyorsunuz.

Floresan aktive hücre sıralama (FACS) eksozom analizi ³ için en yaygın ve yaygın bir araçtır. FACS Ben'i varflüoresan işaretleme ile, farklı kökenlerden gelen hücreler bir aşamada karşılaştırılabilir Efit. FACS önemli dezavantajlar daha az bunların boyutunu ölçmek için, eksozomlar çapı ⁵ 30-120 nm arasında değişir ise, bu yöntem, parçacıkların daha küçük 0,5 ila ⁴ um, tespit için yeterince duyarlı değildir bulunmaktadır.

Taramalı elektron mikroskopisi (SEM) ve transmisyon elektron mikroskobu (TEM) partikül boyutu ve eksozom morfoloji analizi için başka araçlar. Ancak, SEM ve TEM hem de numunelerin hazırlanması zaman alıcı, her iki yöntem emek-yoğun adımları dahil olduğunu dezavantajı var ve her buluntu nesil bazı riskler vardır. Her iki yöntem, yüksek numune ve bir numunenin bir parçacık binlerce karakterizasyonu için uygundur. Ayrıca, örnekler çoğu zaman bilgisi, klinik günlük rutin için bir nicel analiz çok kısa bir süre içinde eş zamanlı olarak ya da en azından analiz edilecekgerçekleştirmek zor. Yeni nesil teknikleri artık bize öncesinde yoğun hazırlık çalışmaları (örn, çevresel SEM) olmadan eksozomlar analiz sağlar. Bu modern teknikler hala ortalama sayısı ve boyut dağılımını ⁶ belirlemek için eksozomlar içeren büyük hacimli süspansiyonları analiz için oldukça sakıncalı.

Görselleştirme ve eksozom analizi için diğer bir yüksek ölçüde hassas bir yöntem nanopartikül izleme analizi (NTA) 'dir. Bu yöntem, fizik iki prensip yararlanır. İlk olarak, parçacıklar, bir lazer ışını ile ışımaya zaman dağınık ışık ile tespit edilir. İkinci bir fenomen olduğu için uygun bir sıvı süspansiyon içinde farklı parçacıkların difüzyon büyüklükleriyle ters orantılıdır, Brown hareketi olarak da bilinir. Bu durumda hareket, aynı zamanda, sıcaklık ve sıvının viskozitesine bağlıdır. Bununla birlikte, bu oran, doğrudan parçacık büyüklüğü ile ilgilidir ve NTA kullanılır. Yumuşak kullanmaware-tabanlı analiz, tek parçacıklardan saçılan ışığın dijital görüntüler kaydedilir. Dağınık ışık noktalar Arsalar ve hareket onların hızı, toplam partikül sayısı ve büyüklüğü dağılımının belirlenmesini kolaylaştırmak verileri sağlamak. Bu teknik en az 100 nm bir ortalama çapa sahip parçacıkların analiz edilmesi için güçlü bir araçtır.

boyutu ve konsantrasyon ölçümleri ZetaView Brown ve Elektroforez Hareket Video Analizi Mikroskop ile yapılmaktadır. Bu (bundan sonra partikül izleme aracı olarak anılacaktır), sıvı örnekleri için yarı-otomatik masa üstü nanoparçacık analiz cihazıdır. Bu parçacık izleme analizörü yanı sıra veri analizi için kullanılan yazılım ile bir dizüstü bilgisayar oluşur. Heterojen biyolojik örnekler, inorganik parçacıkların en çok homojen süspansiyonlar gibi bu yöntem için de uygundur. Bir video kamera ile bir lazer kırılmalı mikroskop parçacıkların tespiti için ve Obse için kullanılanonların hareket rvation. Mikroskop ekseni yatay ve eksozomlar ihtiva eden bir süspansiyon ile doldurulabilir hücre kanalının içine odaklanmış olsa da, lazer ışını dikey yönlendirilmiştir. mikroskop (Şekil 1) üzerinden bir dijital video kamera ile 90 ° altında kaydedilir lazer ışığı yayılımı ile ışınlanmış parçacıklar. saçılan ışığın yoğunluğu, daha büyük partiküller 60 nm çapında gözlenmesini sağlar. Böyle bir ortamda, bir parçacığın parlaklık parçacık büyüklüğü tek göstergesi değildir. Herhangi bir elektrik alanı uygulandığında, parçacık hareketinin Brownian hareketi takip eder ve parçacık boyutuna hesaplamak için bir gösterge olarak kullanılabilir. Bununla birlikte, cihaz, aynı zamanda, hücre kanalı boyunca bir elektrik alanı uygulamak yeteneğine sahiptir. Bu alana maruz kaldığında, potansiyel, polarizasyon ve süspansiyon eksozom iyonik yük seviyesi, kendi hareket yönünde, daha belirleyici olmaktadır. Bir elektroforetik mo Hız ve yön sonucubility histogramı.

Izole eksozomlar analiz için en uygun yöntem bulma bir sorun olsa da, başka bir tür kan, asit, idrar, süt, amniyotik sıvı veya hücre medya gibi farklı medya, gelen eksozom etkili izolasyon yatıyor. Farklı yöntemler Ultrasantrifügasyon ¹ dayandığı, şimdiye kadar tarif edilmiştir (örneğin Exoquick gibi) endüstriyel ayırma reaktifleri ^{7, 8} veya ayrılık ultrafiltrasyon istihdam antijen için manyetik boncuk ⁹ adımları.

Bu protokolde Ultrasantrifügasyon yoluyla eksozom izolasyon tüm süreci göstermek ve partikül izleme aracı vasıtasıyla süspansiyon içeren ortaya çıkan exosome analiz nasıl gösterir. Insan plazması ya da hücre kültür ortamı türetilmiş eksozom analizi için özel hususlar sağlanır.

Protokol

NOT: Bu çalışmada sunulan deneyler Düsseldorf Üniversitesi'nin kurumsal etik kurulu tarafından onaylanmıştır.

1. Exosome Hazırlık

1. (9 ml toplam) venipunktür yoluyla 3 sitrat tüpleri içerisine tam kan toplamak. Bir 15 ml Falcon tüpü içine kan dökün.
2. Plazmadan hücrelerinin ayrılmasını başlatmak için 4 ° C'de 20 dakika boyunca 1500 x g'de santrifüjleyin. Yeni 15 ml şahin tüp süpernatant aktarın.
3. Plazmadan (; CFP hücre içermeyen plazma) tüm hücreleri çıkarmak için 4 ° C'de 20 dakika boyunca 2,800 x g'de santrifüjleyin. Ultrasantrifügasyon tüpler, tüp başına 1 ml CFP aktarın.
4. 4 ° C'de 90 dakika boyunca 100,000 x g'de santrifüje eksozomlar tüketmek için. Üstte kalan sıvı kısmın 900 ul çıkarın. Ultrasantrifügasyon tüp içinde kalan 100 ul pelet yeniden askıya. 900 ul PBS ekleyin.
5. Tekrar santrifüj 4 ° C'de 30 dakika boyunca 100,000 x g'de. Su 900 ul kaldırpernatant. Kalan 100 ul pelet yeniden askıya.
6. Aktarım damıtılmış su, 40 ml yeniden süspansiyon 5-20 ul. Daha büyük parçacıklar eksozomlar ayrılması için bir 450 nm filtre ile süspansiyon filtre. Parçacık ölçümü için bu son süspansiyon kullanın.

Parçacık Takip Aracı 2. Başlangıç ​​Prosedürü

1. Yazılım simgesine çift tıklayarak programı başlatın. Çeşitli yazılım sekmeleri tıklayın ("Hücre Kontrolü", "Ölçme", "Analiz") protokol boyunca aralarında geçiş yapabilirsiniz.
2. Başlangıç ​​prosedürünün otomatik uygulanması için ekrandaki yönergeleri izleyin. Hücre kalite kontrol ve otomatik hizalama hem kutularını seçin.
   NOT: Bu adımların Ya "hücre kontrolü" sekmesine düğmesini (A) veya (B) tuşuna basarak ayrı gerekirse tekrar edilebilir.
3. NTA enstrüman giriş ve çıkış noktasını açın ve 10 m enjekteL giriş deliğinden hücre kanalının içine şırınga ile damıtılmış su. Su son miktarı enjekte ediliyor olarak çıkış deliği kapatın. Atık çözümü toplamak için çıkış portu altında bir behere koyun. Ölçüm hücresi hava kabarcıkları serbest olduğundan emin olun ve sisteme hava kabarcıkları şırınga yok. Hemen giriş deliğini kapatın.
4. "Tamam" butonuna tıklayarak hücre kalite kontrolünü gerçekleştirin. Yazılım birkaç saniye sonra hücre kaliteli sonuçlar gösterecektir.
5. Herhangi parçacıklar hala yazılım canlı görünümü ekranda görsel veya kalite kontrol sonucu sadece iyi ya da kötü olması durumunda, kalan parçacıklar kadar adımı tekrarlayın 2.3 ölçüm hücresinden çıkarılırsa. Ayrıca partiküllerin birikmesini önlemek için her ölçüm aşamasından sonra 2.3 tekrarlayın. Distile su enjeksiyon yinelenen ve hücre kontrolü "iyi" sonuç vermezse, 2.9 geçin.
6. Üniforma 200 nm büyüklüğünde pol içeren bir kontrol süspansiyon hazırlayın; polisitren parçacıklar lazer ve mikroskop odakları hizalamak için kullanılacak. 600 ± 100 parçacıkları canlı görünümünde bir ekranda görüntülenir, öyle ki gerekli konsantrasyon elde etmek üzere damıtılmış su 500 ml, cihaz üreticisi tarafından sağlanan süspansiyon konsantresi bir damla ekleyin.
7. Adım 2.3 açıklandığı gibi NTA aracı haline hizalama süspansiyon enjekte edilir. "OK" tuşuna oto uyum, sistem otomatik olarak iki odaklarının optimum pozisyonunu bulacaksınız hangi aracılığıyla otomatik rutin başlatmak için.
8. Bir istemi sistemi belirten göründüğünde ölçümü başlatmak için OK üzerine tıklayın, şimdi deneyler için hazır.
9. Zaman zaman, bir etanol% 30 çözeltisi ile hücre yıkama ile deneyler arasında el hücre kanalı temizleyin. Yazılım otomatik hata raporu görüntüler her kanalı temizleyin.

Örnek 3. Ölçümü

1. Ea önce distile su ile kanal yıkayın(adım 2.3 de tarif edildiği gibi) kanal numune ölçümü.
2. Aşama 2.3 de tarif edildiği gibi, kanal içinde (bölüm 1 'de hazırlandı) eksozom süspansiyon enjekte edilir.
3. Gerektiğinde yazılım şu ana parametreleri ayarlayın:
   1. Duyarlılık. Optimum hassasiyet aralığını bulmak için, farklı hassasiyet seviyeleri için ekran başına ölçülen parçacıklar için bir eğri görüntülemek için düğmeye "Duyarlılık vs Parçacıkların sayısı" üzerine tıklayın. Eğrisinin maksimum eğimi önce hassasiyet seviyesini seçti. Daha yüksek hassasiyet seviyesi daha küçük parçacıkların görselleştirme sağlar, aynı zamanda arka plan gürültü ile ilgili sorunlar artar.
   2. Asgari Parlaklık. Exosome ölçümü bir filtre olarak bu işlevi kullanmak için 20 bir başlangıç ​​parlaklığını seçti. Dışarı boş güçlü ışık saçılım parçacıklar kadar bu parametreyi düzenler. Eserler saçılma zayıf yükseltmek için aşağı düzenler. Deney boyunca gerektiği gibi parlaklığını Vary.
      NOT: ışık ParçacıklarÇok güçlü bir örtüşme dağılım ve yanlışlıkla analize dahil edilebilir.
   3. Min ve Max boyutu. Minimum ve maksimum boyutu düzenleyerek boy parçacıklar piksel gürültü ve istenmeyen dağılım ortadan kaldırmak için bir dijital filtre ayarlayın. Eksozom ölçümü için 10-500 piksel aralığı kullanın.
   4. Shutter. Kamera 1/300 sn açık süreyi ayarlayın.
4. Okunan parametreleri Canlı:
   1. "Canlı görüntü" butonuna tıklayarak herhangi bir noktada bir dijital ve analog görünümü modus arasında geçiş.
   2. Deney boyunca bir renk kodlu göstergesi olarak örnek doyma durumunu gösterir saçılma yoğunluğu bar, monitör. Saçılma çubuğu kırmızı ise eksozomlar analiz etmeyin. Böyle bir durumda, daha fazla bu olguyu önlemek için örnek seyreltin. Deneysel durum numune süspansiyonu bir manipülasyon yasaklar varsa, duyarlılık aşağı-regüle veya yazılım-s parlaklığını düzenleyenyarlar ölçüm sonuçlarını iyileştirmek için.
      NOT: parçacıkların son derece yüksek konsantrasyon ile örnekler incelendiğinde dağılım, bireysel parçacıkları sigorta ve onlar tek parçacık olarak sayılır.
   3. Ekrandan görme alanında sayılır parçacıkların sayısı not edin.
5. "Ölçme" sekmesine tıklayın.
6. "Run seçenekler" dizisindeki ayarları seçin.
   1. Her satın alma öncesinde, bir tekrarlanan çek parçacık sürüklenme testi için "onay hareketi 'seçin. Bütün analiz başlamadan önce en az bir kez testi yapın. Sürüklenme daha yüksek 20 mm / sn ise, numune akan durdurur, böylece ölçüm devam etmeden önce bekleyin.
   2. Deney sayısını (5) ve aralarındaki zaman gecikmesini (0) seçin.
   3. Bir "örnek çek 'Gerekirse gerçekleştirin. Bu test başlangıç ​​prosedürü otomatik hizalama parçasıdır ve gerektiği gibi sonradan tekrar edilebilir.
7. Sonunda "run Video kazanım" butonuna tıklayın. Yeni pencerede, döngü sayısını (15) ve ölçüm pozisyonların sayısı (11) tanımlar.
   NOT: Lazer kafası ve mikroskop 11 farklı pozisyonlarda parçacık numarasını analiz taşınmış olabilir. Deneysel talebe bağlı olarak, deney tek pozisyona veya farklı pozisyonlarda yapılmalıdır karar.
   1. Bir parçacık video çözünürlüğü (düşük) ayarlayarak bir bireysel parçacık olarak sayılacak takip edilecek olan minimum süreyi onaylayın. Kısa izleme süresi düşük bir çözünürlükte sonuçları.
   2. Bir dosya adı seçin ve Ölçümü başlatmak için "Tamam" tıklayın.

Sonuçların Yorumlanması 4.

1. "Sonuçlar" sekmesinde ölçümden sonra görüntülenen aşağıdaki sonuçları ve parametreleri görüntüle: takip parçacıkların (1) toplam sayısı, parçanın (2) ortalama sayısıpozisyonda, ve (3) parçacık konsantrasyon başına icles.
   1. Parçacık numaralarının yüzdesine partikül boyutu (çapı, yüzey ve hacim) sayısal oranı sonucu ortalama tablosunu görüntüleme yanı sıra ortalama ve standart farklılaşma değerleri.
   2. Birden fazla pik grafik analizinde varsa zirve analizi tablosunu kullanın. Bu tablo, birinci veya ikinci tepe daha küçük olan parçacıkların dağılımını göstermektedir.
2. Büyüklüklerine göre parçacıkların bir dağılımını görmek için ölçümden sonra hesaplanan grafiği görüntüleyin. Ayarlarını değiştirmek için ekran modunda ve grafiğin üstünde simgeleri kullanınız.

Sonuçlar

Bu gösteri için kullanılan örnek% 85 duyarlılık, hassasiyet eğrisinin maksimum eğimi önce (Şekil 2) ile ölçümü için optimum ayarı gösterir. protokol önerildiği gibi parlaklık, min / max değerleri seçildi. 5.3 parçacıkların bir konsantrasyon / ml x parçacıklarının ortalama boyutu, çoğu 0.137 um idi, 0.149 mikron idi ise 10 ^6, ölçülmüştür.

Ölçme işleminden sonra alınan değerler .pdf bir dosya biçimi veya bir veritabanına ihracat için bir .txt olarak raporda kaydedilebilir. tercih edildiği protokolü (bölüm 4) 'de tarif edildiği gibi grafik ayarlanabilir. video dizisi de kaydedilir ve daha sonra hat-dışı yeniden analiz için kullanılabilir. Bununla birlikte, bu tür bir off-line analiz, kameranın ön alıcı ayarları geriye dönük olarak değiştirilemez.

Bir ölçüm için en uygun parametre ayarlarını bulmak için, biz burada th açıklamak100 nm polistiren boyutu standart örnek gösterge ayarları e optimizasyonu. iki parametre, video görüntüsü ve parçacık büyüklüğü dağılımına duyarlılık ve / üst büyüklüğünün etkisinin altında ayrıntılı olarak ele alınmıştır. Diğer bütün parametreler Tablo 1 'de özetlenmiştir.

Analog ve dijital görüntüler üzerinde (50-94 arasında) duyarlılık etkisinin bir görsel izlenim Şekil 3'te görüntülenmiştir. Görüntülerden elde edilen nicel bilgiler Tablo 1'de ayarlara dayalı, Şekil 4'te sunulmuştur Min Boyutu = 5 ve en büyük boyutu = 200 hassasiyet genel tespit parçacıkların sayısı tipik bir ilişki Şekil 4A'da gösterilmiştir. 50 ve 90 yılları arasında, tespit edilen parçacıkların sayısı duyarlılığı artmış ve 90> hassasiyetleri dramatik olarak artmıştır. Duyarlılık optimum aralığı 66 ve 86 (A) arasında bulunmuştur. Parçacık boyutu dağılımları dif ile elde edilenferent duyarlılığı ayarları Şekil 4B'de gösterilmektedir. Parçacık boyutu dağılımları, üç ayrı ölçümün ortalamasını temsil etmektedir. Oldukça kötü istatistik sonuçlanan sadece birkaç parçacıklar analiz edildi çok düşük bir hassasiyet (duyarlılık = 62, kırmızı eğri) için. analiz parçacıkların sayısı duyarlılığı artmış ve 70 (sarı eğri) ve 86 (tan eğri) arasındaki bir optimum ulaştı. Daha küçük boyutlarda (duyarlılık = 94, mavi eğri) doğru kayması bırakarak parçacıklar ve boyut dağılımının sayısı ile parçacık boyutu dağılımı bir bozulmaya duyarlılık öne artar. Şekil 4C sayısı göre x50 çapının eğilimi (% 50 göstermektedir parçacıklar duyarlılık bir fonksiyonu olarak) bu çapından daha küçüktür. Kırmızı bölge kötü istatistiği (hassasiyet çok düşük) ya da geniş bir dağılım göstermesi sonucunda>% 8 MSB göstermektedir bej aralığı içinde, partikül büyüklüğü MSB% 8'den az ve A'da uygun aralığına tekabülDaha küçük boyutlarda (hassasiyet çok yüksek) kayma ile rı payı.

Min Boyutu ve Max Boyutu ayarları Min Boyutu daha küçük ve Max Boyutu daha büyük nokta boyutları ile parçacıkları kaldırmak için dijital görüntülere uygulanan filtreler vardır. Işığı dağıtır yeteneği nedeniyle, bir tanecik, bir dijital görüntü ile ilgili belirli bir büyüklükte bir nokta oluşturur. nokta boyutu piksel sayısı (piksel) olarak ölçülür. Bir parçacık çok iyi (örn, parçacıklar> 200 nm veya agrega) ışık saçar zaman, nokta boyutu, örneğin,> 500 px, oldukça büyüktür. spot büyüklüğü parçacık malzemeye bağlı olarak küçük parçacıklar (örneğin, <20 nm) için (örneğin, <10 px) oldukça küçük. Aynı değillerdir ve bu iki değişken arasında doğrudan bir ilişki olduğu gibi spot büyüklüğü (px) partikül boyutu (nm) ile değiştirilebilir olmayabilir. Min ve Max Boyutu bir optimizasyon kullanıcı gibi aglomeralar (Maks Boyu) ya da küçük olarak istenmeyen nesneleri filtrelemek için izin verirarka plan gürültüsü (Min Boyutu) olarak nesneler. 100 nm boyutlu standart parçacık boyutu dağılımına Min / Maks Boyutu etkisi Şekil 4D (duyarlılık = 82) 'de gösterilmiştir. Aralık küçük nokta boyutları ayarlandığında (örneğin, min = 1, max = 52; turuncu eğrisi), analiz parçacıkların sayısı azalır ve sayı tabanlı x50 çapı biraz daha küçük boyutlarda doğru kaydırılır. Büyük noktalar için bir ayar (min = 40, max = 1,000; kırmızı eğri) geniş bir parçacık boyut dağılımının sonuçları büyük boyutlarda doğru kaymıştır. Parçacıkların eşit toplam sayıları elde etmek için, turuncu ve kırmızı hem dağılımlarının aralığı sınırları 80 parçacıkları maç ayarlandı. en uygun ayarlarla dağılımı (dk = 5, max = 200; ten rengi eğrisi) 360 parçacıklardan oluşur.

Başarılı bir seri deney eksozom ultra-santrifüj ile izole edildi ve sunulan sistem kullanılarak NTA ile ölçülen ile yapıldı. Elde edilen veriler son derece vardıve tutarlı yeniden üretilebilirlik yüksek düzeyde doğruladı. Diğer izolasyon yöntemleri benzer sonuçlar göstermelidir. Fakat bu seyreltme adımı özellikle kritik bir aşama olarak tespit edilmiştir ve parçacıkların hesaplanan toplam sayısı üzerindeki etkisi yeniden değerlendirilmelidir.

NTA kurulumu Şekil 1. şematik. mikroskop / görüntü ekseni ve lazer ışını hücre kanal kesiti kapısını birbirine dik yönlendirilir. Parçacıkların tarafından saçılan ışık yazılımı "canlı görünüm" penceresinde görüntülenir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Canlı görünümü ekranda parçacıkların analog ve dijital görüntü. Görselleştirme üzerine duyarlılığı Şekil 3. Etki hem analog (üst satır) An 50 ve 94 arasında hassasiyetleri için görüntülenird dijital (alt sıra) bakıldı. Hassasiyet çok düşük olduğunda, sadece bir kaç partiküller (sol) tespit edilir. Optimum hassasiyet at parçacıklar birbirlerini iyi (orta) izole olarak tek noktalar görünür. Nispeten yüksek hassasiyet parçacıkları bir arada kötü görüntü kalitesi (sağda) yol açan birleştirme at. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Bir kontrol 100 nm polistiren partikül örnek için duyarlılık minimum ve maksimum boyutu ayarları Şekil 4. Etkisi (A) parçacıkların tespit sayıda karşı duyarlılık Arsa.; optimum aralığı, 66-86 eğrisinin azami eğimiyle önce gelir. (B) Partikül büyüklüğü dağılımları birkaç hassasiyet ayarları (62-94 elde); (62), çok düşük ya da çok yüksek için grafikler (94) karşı, 100 nm polistiren kontrol örneği için parçacık boyutu dağılımı toplanmamaktadır. (C) duyarlılık karşı Sayısı tabanlı x50 çapı; bej aralığında x50 hata% 8'den az, uygun aralık 66'dan parçacık boyutu dağılımına Min ve Maks Boyutu 86. (D) etkisi için olduğu; Optimal parametreler (min = 5 ve max = 200), kontrol numunesi için doğru dağıtım yakalamak. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Ön-satın alma parametreleri
Duyarlılık	değişken
Panjur	40
Kare hızı	30 fps
Çözüm	Selamgh
Bisikletler	10
Çoklu Devralmalar	3
Pozisyon	1
Post-satın alma parametreleri
Min Parlaklık	30
Max Boyut	değişken
Min Boyutu	değişken

Parçacık izleme aracının ayarı için öncesi ve sonrası satın alma parametreleri Tablo 1. Özeti.

Tartışma

Bir biyolojik sıvıda eksozom boyutu ve yoğunluğunu ölçmek için bir yeni ve yenilikçi bir yöntem olarak kan ve bu nanoparçacık takip eksozom izolasyonu için detaylı bir protokol göstermektedir. Gösterilen deneylerde, insan periferik kan eksozom kaynağı olarak kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu gibi idrar, balgam, hücre kültürü üstte kalan sıvı, diğer kaynakları, ayrıca test materyali olarak kullanılabilir.

İnsanlarda eksozom konsantrasyonunun biyolojik değişkenlik göre farklı bireylerden deneyler, eksozom derece değişen konsantrasyon özelliği olabilir. Ancak, biyolojik test denemesinde parçacıkların konsantrasyonu sonuçları üzerinde bir etkiye sahip olabilir. Bu nedenle, prob seyreltme için güvenilir ve standart bir yaklaşım gereklidir. Sunulan yöntem eksozom ihtiva eden plazma periferik tam kan, 9 ml elde edilmiştir. Diferansiyel santrifüj kullanılarak bir eksozom pelet izole edilmiştir adım1 ml plazma ve süspansiyona eksozom çalışma örneği meydana getirmek üzere damıtık su 5 ml yeniden süspansiyon haline. Bu ön-tanımlı ayar parçacıkların uygun bir konsantrasyon, NTA sırasında, yani uygun dağılım yoğunluğu ile bize sağladı. Hacmi ve seyreltme açıdan yanında, kullanılan çözeltilerin bir bileşim de büyük önem taşımaktadır. Biz eksozom son yeniden süspansiyon için distile su kullandık. Tabii ki, nihai seyreltme adımı için farklı medya da deney düzeneği gereklerine göre kullanılabilir. Ancak, tamponlama kapasitesi ile test, özellikle iyonik çözeltiler zeta potansiyel ölçümleri durumunda, türbülans bağımsız koşullarda ihtiyatlı bir seyreltme yararlıdır. Birden örneklerin doğrudan karşılaştırma için biz tüm örnekler için aynı seyreltme seviyesini tutmanızı öneririz. Hassasiyet ve video çözünürlüğü hariç tüm ayarlar ZetaView Analizi yazılımı kullanılarak sonradan değiştirilebilir.

, sadece mevcut NTA sistem değildir. Daha önceki raporlarda bir dizi aynı NTA ilkelerini uygulamak, ancak bazı farklı özelliklere ¹⁰ ile birlikte gider başka enstrüman tasarımı sağlayan diğer sistemleri istihdam var. Biz sonuçların örnek işleme ve tekrarlanabilirlik ile ilgili pratik yönleri eksozom değerlendirme için metodolojik dizisi seçiminde merkezi öneme sahip olduğuna inanıyoruz. Biz de ideal bir algılama sistemi ölçümleri sonuçları ile etkileşime girebilir kullanıcı bağlı faktörleri ortadan kaldırmak gerektiğine inanıyoruz. Burada sunulan eksozom analiz yaklaşımı yüksek derecede kolay kullanım kriterlerini yerine getirmektedir. İlave bir avantaj olarak, numune, yarı-otomatik bir analiz, kısa sürede sonuç üreten, hızlı bir şekilde gerçekleşmektedir. Eksozom bir çevrimiçi görselleştirme ga için analizörü yardımcılarıeksozom özellikleri, örneğin, brüt konsantrasyon bir anlık fikir.

Burada sunulan ölçüm tekniği çok basit ama şık bir ek antikor etiketli eksozomlann kullanımı ve dedektör önünde bir önceki filtre kullanarak dağınık lazer ışınının yakalama. Bu şekilde, eksozom alt-popülasyonları bulunduğunu seçici floresan boyama teknik erişilebilir yüzey antijenleri ve diğer biyolojik olarak ilgili özelliklerine göre ayırt edilebilir.

Bizim parçacık izleme aracının güncel sürümü bir dezavantajı çok yüksek hassasiyet seviyelerinde arka plan gürültüsü gibi eserler hücre kanalı duvarına dayanan, mevcut olabilir olmasıdır. Mevcut sisteme bir teknik çözüm ve iyileştirme yakın gelecekte kullanılabilir hale gelebilir. Kanal duvarına lazer dağılım ışık bu yöntem yansımaları ile bu şekilde artan azalacaktır Ölçülen sinyaller ve elde edilen verilerin ve algılama sınırı düşürücü doğruluğu.

Exosome izolasyonu için şu anda kullanılan protokol köklü ve uygulamalı parçacık izleme aracı, 30 nm düşük boyut dağılımı ile son derece hassas çözünürlüğe sahip olmasına rağmen, tespit edilen parçacıklar aslında tamamen doğru eksozomlar olduğuna dair hiçbir garanti yoktur. Bu gibi ölü hücre fragmanları ya da daha büyük bir protein kompleksleri gibi diğer parçacıklar da eksozom süspansiyon içinde mevcut olabilir ve yanlış pozitif sinyallere neden olabilir. Örneğin "kirlilik" elektron mikroskobu (EM), iletim EM ya da tarama EM da olabilir dışı bırakılabilir hangi biri güvenilir bir yöntem. Daha önce önerilen yüzey markerlerinin bir dizi tetraspanin (Tspan), CD81, C63, CD9, vb ¹¹ de dahil olmak üzere dikkat artan bir miktarını, kazanmıştır, ancak ne yazık ki, eksozom için genel ve spesifik bir işaretleyici, şimdiye kadar tanımlanmış edilmiştir.

"> Bağımsız olarak eksozom biyoloji, özellikle de eksozom özel işaretleyiciler ile ilgili araştırma, gelecekteki ilerleme, burada sunulan protokol izolasyonu ve eksozom tespiti için güçlü bir yöntem sağlar. Konsantrasyon ve büyüklüğü de kolayca bir yazılım destekli tespit edilebilir basit moda. selektif floresan belirteçler ya da fluoroforun birleştiğinde antikorların eklenmesi muhtemel daha NTA sunulmuştur yaklaşımın olası uygulamalarını geliştirmek olacaktır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Sitrat tüpü	BD	364305	BD Vacutainer
Damıtılmış su	Braun	3880087	Aqua ad iniektabililia
Falcon tüpü	Greiner Bio One	188271	PP Tüp, Steril 15 ml
Ultrasantrifüj tüpü	Beckman	357448	Mikrofüj Tüpü Poliallomer 1.5 ml
Polybead	Polysciences, Inc.	07304	%2,6 Katılar-Lateks Hizalama Solüsyonu
Şırınga (Filtre)	Braun	4617053V	5 ml
Şırınga (ZetaView)	Braun	4606051V	5 ml
İğne	BD	305180	BD Künt Dolum İğneli
Filtre	Sartorius Stedim	16555	Şırınga filtresi, hidrofilik, 450 &mikro; m
Ultrasantrifüj	Beckman	L8-M	Rotor: 70Ti Ser. No E21078
ZetaView	Parçacık Metrix	PMX 100, Tip 101
Santrifüj	Eppendorf	5804R	Rotor: A-4-44