Yöntem makalesi

Kemirgen Yenidoğan itibaren Korunan immunfenotipine ve İşlevselliği ile Kortikal mikrogliya İzolasyonu

DOI:

10.3791/51005

⸱

30 Ocak 2014

 ,  , 
1Department of Neuroscience, Georgetown University Medical Center

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrogliyal biyoloji başarılı bir soruşturma için bir anahtar CNS dokudan izolasyonu sırasında ex vivo mikroglialardan immunofunction korunmasıdır. Flüoresan görüntüleme, bağışıklık kimyası ve proenflamatuar stimuli lipopolisakarit (LPS) ile Pam 3 CSK 4 (PAM) ile ELISA aşağıda mikroglia aktivasyonu ile değerlendirilen gibi son derece saf ve immunofunctional hücre kültürlerinde döner çalkalama sonuçları ile mikroglia izole edilmesi.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CNS dokusundan mikrogliya İzolasyonu ex vivo mikrogliyal biyolojisi okumak için kullanılan güçlü bir araştırma aracıdır. Mevcut yöntem, döner bir karıştırıcı, mekanik çalkalama ile neonatal murin kortekslerinden mikroglia izolasyonu için bir prosedürü göstermektedir. Bu yöntem, mikroglia izolasyon verimi canlı içinde normal ve patolojik olmayan koşullarda sakin mikroglia göstergesidir morfolojik ve fonksiyonel özelliklerini gösteren yüksek ölçüde saf bir kortikal mikroglia. Morfolojik değişiklikler, NF-KB (p65) bir p65 alt birimi nükleer translokasyonu ve ayırt edici özelliği pro-enflamatuar sitokin salgılanması, tümör nekroz faktörü-α (TNF-α endüksiyonu ile gösterildiği gibi, bu prosedür, aynı zamanda mikroglial immünfenotip ve biyokimyasal özelliğe korur ), lipopolisakarid'e (LPS) ve Pam 3 CSK 4 (Pam) zorluklar üzerine. Bu yüzden, bu izolasyon prosedürü ve hareketsiz acti hem de immünfenotip korurex vivo koşullarda mikrogliya biyolojiyi araştıran deneysel bir yöntem sağlayan çıkartılır mikrogliya.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroglial hücreleri, CNS parankima gözetim makrofajlar, erişkin memeli beyin, toplam hücre popülasyonunun yaklaşık olarak% 12 ihtiva eder. Mikroglia yolk kesesi miyeloid öncü hücrelerinden türetilen ve yetişkin CNS 1-5 içinde farklı bölgelerde cytoarchitectural hücre yoğunluğu ve morfolojik olarak değişmektedir. Sağlıklı bir yetişkin beyninde, mikrogliya ince, dinamik süreçleri ile, küçük dallanmış veya polar hücrelerdir. Bununla birlikte, in vivo görüntüleme çalışmaları mikroglial işlemleri dinamik "andıran bir şekilde uzanır ve mikro izlemek için geri göstermektedir; çevresel makrofaj morfolojisi aksine, mikroglia hücresel işlem olarak görünebilir sağlıklı beyinlerinde bir hareketsiz, düşük profilli bir fenotip göstermektedir örnekleme ve "6,7 ölçme.

Mikroglia geçiş, yüksek ve diferansiyel olarak beyinde çevresel ve patofizyolojik değişikliklere duyarlısırasıyla bir efektör devlet-genellikle kendi dinlenme olarak kabul ve aktif devletler, bir surveillant dan. Aktivasyonuna Bu anahtar, bu patojenle ilişkili moleküler kalıpları yanıt toll benzeri reseptörler (TLR), (PAMPs), yani bakteri ve viral türevli lipoproteinler olarak membrana bağlı görüntü tanıma reseptörleri (PRR) arasında takılma ile aracılık edilebilir , nükleik asitler, karbonhidratlar ve 8-11. PAMPs ek olarak, PRR'ler, aynı zamanda, hücre hasarı 12-16 gibi CNS homeostatisinde sarsımına temsil tehlike / hasar ile bağlantılı moleküler kalıpları (DAMPS) olarak bilinen steril, patojenik olmayan moleküllere karşı, mikroglial aktivasyonunu teşvik ettiği gösterilmiştir. Bir kez yerleştikten sonra PRR mikroglial hücre morfolojisi ve gen ekspresyonunda değişiklikler ile sonuçlanır bir hücre içi sinyalleme kaskadını başlatabilir, özel olarak ise, aktive edilmiş mikroglia bir amoeboid benzeri fenotip adapte hücre çekirdeğine NF-KB p65 alt ünitesi (p65) yerini değiştirmek ve upregüle süredenşeklinde gösterilmektedir ve bu reaktif oksijen türleri (ROS) 16-24 ile birlikte, tümör nekroz faktörü-α (TNF-α), interlökin-1 β (IL-1β) gibi proenflamatuar sitokinlerin salgılanması. CNS'nin doğuştan gelen immün yanıt olarak tamamlayıcı olsa da, bu salgılanan moleküller de bu şekilde, Parkinson ve Alzheimer hastalığı gibi hastalık durumlarının 25-29 nörodejenerasyonu neden olan ve arttıran, nöronal oksidatif stres geliştirmek için bulunmuştur.

Bununla birlikte, patolojik durumların mikrogliyal aktivasyonun mekanizması tam olarak anlaşılmış değildir. Mikroglial aktivasyonun vivo özellikleri birçok kültür değinmeyecek olabilir Bu nedenle, mikroglia izolasyonu, bu biyolojik süreçlere güçlü bir araştırma aracıdır. Çeşitli yöntemler CNS doku 30,31 enzimatik sindirimi takip eden bir Percoll gradyanı ile izolasyon dahil olmak üzere, mikroglia, izole edilmesi için kullanılabilir. Bununla birlikte, enzimatik sindirim değiştirebilirAntijen ekspresyonu 32 hücre yüzeyi azaltılması ve burada tarif edilen yönteme göre, hayvan başına daha düşük hücre verimle sonuçlar ile hücrelerin immünofenotipi. Daha önce bir Percoll verim 3-5 x 10 5 hücre 30,33,34 yoluyla tüm CNS izolasyon yöntemleri rapor ederken Özellikle, biz, 7,5 x 10 5 hücre yavru korteksinde başına ortalama mikrogliya verim rapor. Bu prosedür, bu şekilde mikroglial immünfenotip ve işlevselliğini korumak, düşük-yapışma özelliklerine göre mikroglia izole edilmesi ile sindirim enzimlerinin aşılmaktadır.

Döner bir karıştırıcı, daha önce bir uzantısına mekanik ajitasyon ile, ve C57BL / 6 faregiller korteks - Bu çalışmada, neonatal heterozigot CX3CR1-GFP (CX3CR1-GFP + /) türetilmiş karışık glial kültürlerinden mikroglial hücreleri izole edilmesini tarif 24,35 yayınlanan yöntem. Biz mikrogliya kolay görsellik için eski fare zorlanma kullanmak gibibir monosit spesifik promoter 36-38 - Bu farenin endojen CX3CR1 mahalinin kontrolü altında GFP ifade eder. Bu yöntem, bir korunmuş immünofenotipi ex vivo bakteriyel lipopolisakkarid (LPS) veya Pam 3 CSK 4 ile meydan morfolojik değişiklikler, p65 nükleer translokasyonu ve TNF-α salgılanması ile gösterildiği gibi, TLR4 ve TLR1 / 2 agonistleri ile son derece saf bir kültür Mikroglial üretir sırasıyla.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Önce bu protokolü başlayan, doğum sonrası günlerde yenidoğan farelerin toplamak 1-3 koruma ve sıcaklık için özgün kafes yatak ile iç içe bir steril kap içinde (P1-3). Bu mikrogliyal verimi optimize etmek, bu protokol sayesinde hızlı ve verimli bir şekilde çalışmak önemlidir. Tam reaktif listesi için Tablo 1'e bakınız lütfen.

1.. Aletleri, Kültür, Medya ve Yemekleri hazırlanması

  1. 10 ml / pup Mikroglia tam ortam maddesi (MCM hazırlanması; 1x Minimal Essential ile desteklenmiş Medium Earle [MEM]: 1 mM L-glutamin, 1 mM sodyum piruvat,% 0.6 v / v D-(+)-glukoz, 100 ug / ml Penisilin / Streptomisin (P / S),% 4 h / h cenin sığır serumu (FBS), 6 v / v% at serumu) ve her bir T-75 balonuna (1 şişe / yavru) eklemek, kapak ve yeri yatay olarak bir inkübatör (37 ° C,% 5 CO2), 1 saat boyunca dengelenmeye. O diseksiyon başlamadan önce bir şişe (ler) de bu ortamı dengeye için gereklidir.
  2. Prepare, kısım ve sıcak diseksiyon (6 ml / pup) için 37 ° C su banyosu MCM ve hücre yeniden süspansiyon (2 mi / yavru) için ayrı bir konik tüp MCM halinde. Ve Kesme Media (DM; MEM 100 ug / ml ile takviye edilmiş P /: buz Kıyma Media (,, 100 ug / ml P / S, 0.01 M HEPES 3 ml / pup HBSS ile takviye MM) hakkında Hazırlama, kısım ve soğuk S, 2 ml / pup).
  3. 10 dakika boyunca% 70 etanol içinde boğulma yolu ile aşağıdaki cerrahi aletleri sterilize: makas # 1 (1; başını kesmek için), # 1 forcep (2; burun güvenli ve korteks kaldırmak için), makas # 2 (1; nonangled; açmak için kafa derisi ,) makas # 3 (1 meninksler kaldırmak için,), forcep # 2 (1;,) kafatası kaldırmak için forcep # 4 (2; # 3 (1 forcep) derisini çıkarmak için beyin dokusunu inceltmek için). Steril bir pad üzerinde kurumaya bırakın.
  4. % 70 etanol ile yatay hava akımı iş istasyonu ve diseksiyon mikroskop aşağı silin.
  5. Başını yakalamak için 2 steril, 100 mm Petri kapları içine DM dağıtın (3 ml, 1/3 yavrular çanak) ve diseksiyonu (1 ml;Diseksiyon önce buz üzerinde soğutulmuş); / yavru 1 tabak. Beyin dokusu (; 1 tabak / yavru 1 ml) kıyma için 1 steril, 100 mm Petri kabı içine MM dağıtın.

2. Beyin Dokusu Diseksiyon

  1. Ötenazi öncesinde, hafifçe bir laboratuar dokusu kullanılarak% 70 etanol ile boyun ve yavru başını sterilize. Makas # 1, hızla başını kaldırarak yavru euthanize; yakalama kafasını önce hazırlanan Petri kabındaki. Euthanize ve sonraki hayvana geçmeden önce bir yavru diseksiyon tamamlayın.
  2. Soğutulmuş diseksiyon çanak kafa transferi, açık kafa derisi bir oluşturarak makas # 2 kullanarak; diseksiyon mikroskobu altında # 1 (alternatif olarak, kafa göz soket aracılığıyla forseps piercing tarafından güvence altına alınabilir) forcep kullanarak burun sıkarak başını sağlamlaştırmak Y-cut: kafa tabanından ve gözleri doğru bir açıyla başlar. Yavaşça kafatası açığa yanal soyulması ile kafa derisi kaldırmak için 3. forcep kullanın.
  3. Forcep 3. kullanarak, yavaşça tabanının en bağ dokusu kaldırmakkafa. Kavrama,, kafatası tabanı (interhemisferik fissür aşağıdaki) beyin ve kafatası arasında forcep bir kolunu dizilerek, dikkatli, açık kafatası maruz kaldığında yavaşça açık gözyaşı yukarı kafatası çekin.
  4. Forcep # 1 kullanarak beynin ventral tarafında küçük bağ dokusu bozabilir ve daha sonra aynı aracı kullanarak beyin kaldırmak. Beynin ventral tarafında altında yukarı doğru bir kuvvet kullanılarak kafatası dışına beyin kaldırın.
  5. Anatomik pozisyonda beyin tutun: sırt tarafında diseksiyon mikroskop altında korteks görselleştirmek için yukarı bakacak, orta beyinde ve korteks kesiştiği forseps ipuçlarını takarak yerine beyin sağlamak için; tamamen forcep # 4 ile kortikal meninksler kaldırmak, sonra ventral meninksler kaldırmak için devam edin. Zarları tamamen çıkarıldıktan sonra, forcep # 4 ile beyin kalan kısmından ayırmak korteks. Tamamen mikroglia saflık ve yiel üst düzeye çıkarmak için zarı doku kaldırmak için gereklidird.

3. Beyin Dokusu Kıyma

  1. Transferi Korteksler önce yemek kıyma hazırlanmış; Sınıf II Biyolojik Güvenlik Kabinesi steril tekniği kullanarak adımı kıyma devam ediyor.
  2. Makas # 3 kullanılarak kıyma beyin dokusu, bir 15 ml konik tüp transfer kıyılmış doku,., Makas ve MM her 1 ml ile kıyma çanak durulayın toplamak ve kıyılmış doku içeren 15 ml konik tüp içine durulama dağıtmak Bu durulama adım maksimize edecek Tüm kalıntı doku konik tüpe aktarılır sağlayarak mikroglia verimi. Kıyılmış doku tüpün dibinde yerleşmek için izin, 1-2 dakika boyunca rahatsız doku süspansiyonu bırakın. MM gerekli besinleri içermez gibi 2 dk aşmayın.
  3. Dikkatlice çıkarın ve yerleşmiş kıyılmış doku bozmak için değil bazı yapım, standart bir pipet ile jenerik 1.000 ul mikropipetöre ile 2ml'si atın.
  4. Kıyılmış-dokuya MCM 3 ml ekleyin, standart bir pipet ile bir jenerik 1.000 ul micropipettor kullanarak tam güçle doku çiğnemek trituration tamamlandığında hiçbir discernable katı doku kalmalıdır.. Pipet ucu kalıntı toz haline numune alınması, aynı pipet ucu ile MCM bir 3 ml ilave edilir.

4. Büyüyen Kortikal Hücreler

  1. Santrifüj hücreleri (215 xg, 5 dk; RT; sallanan bir kova rotor ile klinik santrifüj) pelet için kıyılmış doku. Biyolojik güvenlik kabini için pelet hücreleri dönün, kaldırmak ve süpernatant atılır; yavaşça hücre pelet (; MCM 2 ml / tüp); tekrar süspansiyon önceden hazırlanmış T-75 balona hücre tabanda ekleyin; şişesi kapağı ve içine yatay olarak yerleştirin , nemlendirilmiş, standart bir doku kültürü kuluçka makinesi (37 ° C,% 5 CO2). Hücreler, 24 saat boyunca inkübasyona izin verin.
  2. 24 saat sonra, yavaşça bozmaya avucunuzda karşı şişeyi dokunundoku enkaz. Öncesi ve enkaz tümüyle kaldırılmasını sağlamak için dokunarak sonra hücrelerin kontrol edin. Set Şişe dikey, kaldırma ve ortam atılır; şişenin dibine yeni MCM ekle (12 mi, 37 ° C), kapağı ve yatay olarak geri inkübatör içine yerleştirin.
  3. Kontaminasyon için günlük hücreleri kontrol ve büyümesini izlemek için.
  4. In vitro (DIV) içinde yaklaşık 17-21 gün, Mikroglial hücreleri karışık glial kültür hasat için hazır olacak. Hücreler hazır olup olmadığını belirlemek için, bir ters faz-kontrast mikroskop altında hücrelerini inceleyen. Mikroglia hasat için hazır olduğunuzda% 40 confluency ~ at. Başka glia üstünde bir tek tabaka olarak büyüyen küçük, parlak, küresel hücreler olarak görünür.

5. Karışık Glial Kültür gelen mikrogliya İzolasyonu

  1. Mikroglianın ayırmak için, kuvvetli bir laboratuvar tezgah karşı şişesi dokunun. Bu ajitasyon mikroglia düşük yapışma özellikleri nedeniyle diğer glial hücrelerden ayrı mikroglia yardımcı olur.
    2. ile Seal T-75 şişe kapakları sıcaklık kontrollü, nonhumidified döner karıştırıcı kullanılarak hücreler 5 saat daha uzun süre sallamak izin vermeyin gözle kontrol. bu mikroglia ters bir faz kontrast mikroskop kullanılarak, 5 saat sonra şişe yüzeyden kaldırdı. Mikroglia serbest yüzen hücreler, küre şeklinde, parlak. Astrositler ve şişenin dibine oligodendrosit yapışan bir kalıntı tabakası olacaktır.
  2. Pellet mikroglia (215 x g,, 5 dak; kepçe rotor sallanan) süpernatantı steril bir konik santrifüj tüpüne mikroglia ihtiva eden ortam toplayın.
  3. ~ 2,% 0.6 v / vglucose, 1 mM L-glutamin, 100 ug / ml P / S,% 5 v / v FBS 1 mM sodyum piruvat:; sıcak Mikroglial Büyüme Ortamı (MGM olarak mikroglial pelletini ile takviye edilmiş MEM ml / şişe), bir hemositometre kullanılarak, hücre konsantrasyonunu saptamak ve plaka 1 x 10, 24 oyuklu bir plaka biçiminde 5 hücre / gözplastik veya (500 ul / kuyu; MGM) steril cam kapak fişleri., bu prosedürü kullanarak ortalama mikrogliya verimi 7.5 x 10 5 hücre / yavru korteks.
  4. 24-saat post-kaplama, yüzen hücreleri ve enkaz kaldırmak için taze MGM (37 ° C) ile medya ve tekrar çember yükleme hücreleri kaldırmak. Bu adım, hücrenin yaşamını ve sakin mikroglianın korumak için önemlidir. Hücreler hemen sonra refeeding deney için kullanılabilir.

6. Örnek Tedaviler

  1. Pam 3 CSK 4 (PAM) / ml, 10 ng / ml lipopolysaccharide (LPS) ve araç kontrolü 10 ng hücreleri açığa, nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 2 ya da 24 saat süreyle inkübe edin (37 ° C,% 5 CO2).

7. İşlevsellik Ex vivo yoluyla Immunofluorescent Görüntüleme ve İmmünositokimya için mikrogliya Analizi

  1. Mikrofüj tüplerine (1.5 ml) ve centr tedavisi, hücre kültür ortamı hasat sonrasındamedyayı temizlemek için; ifuge bir masa mıkro (900 xg 2 dak) kullanarak. Temiz bir mikrofüj tüpüne süpernatant aktarın, tahlil derhal veya mağaza -20 ° C'de kullanmaya hazır olana kadar. Ticari olarak temin edilebilen, fare TNF-α ELISA kiti ile hücre kültür tortusu içinde TNF-α konsantrasyonu analiz edin.
  2. Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) hücreleri yıkayın ve% 4, hücreler (ağ / hac) paraformaldehit /% 4 (ağ / hac) sakroz / PBS pH 7.4 (% 4 PFA, 15 dakika, RT). Tespit sonra, yumuşak bir orbital çalkalayıcı üzerinde çalkalayarak 5 dakika boyunca PBS ile yıkama hücreleri.
    1. İmmünofloresan / İmmünositokimya. Sabitleme ve PBS immünsitokimya için, süreç mikroglianın yıkayın. Nazik sallayarak ile yürütülen tüm adımlar. PBS/0.1% triton X-100 hücreleri geçirgenleştirmek, bir saat boyunca PBS/10% normal keçi serumu içinde blok hücreler. Ya da bloke edici tampon içinde tavşan anti-Gözler-1 antikoru (1/750), tavşan anti-NF-KB antikoru (1/1, 250 p65 alt ünite) ile 4 ° C'de hücreler O / N inkübe edin. Görselantijen ize: floresan konjüge keçi anti-tavşan IgG ikincil antikor (1 saat, 1/1, 000) ile, inkübasyonu takiben antikor kompleksi. PBS/0.1% Triton X-100 (3 x 5 dk) ile yıkanarak bağlanmamış ikinci antikor çıkarın.
    2. 4 ',6-diamidino-2-fenilindol / PBS (DAPI; 0.1 ug / mL) ile leke hücreleri. Hücre çekirdeği görselleştirmek için CX3CR1-GFP + / türetilmiş tüm mikroglia - farenin GFP ifade eder. DAPI görselleştirmek için bir 350 nm dalga boyu filtre kullanmak; GFP görselleştirmek için bir 488 nm dalga boyu filtre ve 594 nm dalga boyu filtre p65 ve İba-1 immünokompleksler görselleştirmek için.
  3. Dağı kapak sulu montaj solüsyonu ve floresan mikroskop kullanarak mikroglianın görselleştirmek kayıyor.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Izolasyonu sırasında mikroglia ex vivo immunfenotipine ve işlevselliğini İstinat mikrogliyal biyoloji için bir soruşturma model olarak bu hücreleri kullanmak edebilmek için önemlidir. (- Ve C57BL / 6 CX3CR1-GFP + /) ve LPS veya Pam ya ile tedavi edilen kültürler, bu yöntem kullanılarak mikroglia immunofunctionality başarılı bir şekilde korunması göstermek amacıyla, P3 yenidoğanlardan kortikal mikroglia izole edilmiştir.

Şekil 1A'da gösterildiği...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu prosedür, neonatal farelerde kortikal mikroglia izolasyonu için etkili bir yöntem sunmaktadır. Bu prosedür, flüoresan görüntüleme, bağışıklık kimyası ve ELISA ile tespit edildiği üzere, 1) koruyucu mikroglia immunfenotipik ve işlevsellik iki kat yararı vardır, ve 2) mikroglia önce diğer glial hücreleri (astrositler ve oligodentrocytes) varlığında, olgun izin glial kültür olgunlaşma döneminde önemli hücre-hücre etkileşimleri kolaylaştırabilir izolasyon. Önemlisi, izole hücreler korunmuş işlevsellik ve immünofenotipi <...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar araştırma ilgi potansiyel bir çatışma şeklinde olabilir herhangi bir ticari veya finansal ilişkilerin yokluğunda yapılmış olduğunu beyan ederim.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma NIEHS R01ES014470 (KMZ) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
GlikozSigmaG8270MilliQ su ile% 20 Stok Çözeltisi Yapın; filtre sterilize etmek; 4 derecede saklayın; C; Raf ömrü: 3-6 ay. MCM ve MGM yapmak için kullanılır.
Sodyum piruvat 100 mM (100x)HiklonSH30239.014 ° C'de saklayın. MCM ve MGM yapmak için kullanılır.
Penisilin / Streptomisin 10.000 birim / ml (100x)Gibco15140-122-20 ° C'de saklayın MCM, MGM, MM ve DM yapmak için kullanılır.
L-Glutamin 200 mM (100x)Gibco25030-081-20 ° C'de saklayın. MCM ve MGM yapmak için kullanılır.
Fetal Sığır Serumu (Tanımlı)HycloneSH30070.03Filtre sterilize eder; -20 ° C'de saklayın. MCM ve MGM yapmak için kullanılır.
Minimum Esansiyel Orta Earle's (MEM)Cellgro15-010-CVL-glutamin içermez. Earle tuzları içerir. MCM, MGM ve DM yapmak için kullanılır.
At SerumuGibco16050Filtre sterilize eder; -20 ° C'de saklayın. MCM ve MGM yapmak için kullanılır.
Hanks'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS)Cellgro21-021-CVKalsiyum ve magnezyum içermez. 4 ° C'de saklayın. MM yapmak için kullanılır.
HEPES 1 MGibco15630-0314 &� C'de saklayın. MM yapmak için kullanılır.
T-75 FlaskCorning430641
4 ', 6-Diamidino-2-fenilindol, dilaktat (DAPI)İnvitrojenD3571Hücre çekirdeğini boyamak için kullanılır.
Tavşan anti-Iba1Wako019-19741Iba1'in ICC boyaması için 1/750 seyreltmede kullanılır.
Tavşan anti-NF ve kappa; B (p65)Abcam7970P65 için ICC boyaması için 1/1.250 seyreltmede kullanılır.
Alexa Fluor 594 Keçi anti-Tavşan IgG (H + L)InvitrogenA11012ICC'de antijen: antikor kompleksinin görselleştirilmesi için 1 / 1.000 seyreltmede kullanılır.
10 ml Tek Kullanımlık Serolojik PipetFisher Scientific13-678-11E
50 ml Tek Kullanımlık Santrifüj TüpüFisher Scientific05-539-8
15 ml Tek Kullanımlık Santrifüj TüpüFisher Scientific05-539-12
Steril Polistiren PetriKabı Fisher Scientific875713100 mm x 15 mm
Makas: Düz Metzembaum (makas #1)Roboz CerrahiRS-60101; 5 inç; kafa çıkarmak için kullanılır
Makas: Vannas
(makas #2)		Güzel Bilim Araçları15000-081; açılı; 2,5 mm kesme kenarı; kafa derisini açmak için kullanılır
Makas: Öğrenci Vannas (makas #3)Güzel Bilim Araçları91501-091; kavisli; beyin dokusunu kıymak için kullanılır
Forseps: Dumont #7
(forsep #1)		Güzel Bilim Araçları91197-002; burnu sabitlemek ve korteksleri çıkarmak için kullanılır 
Forseps: Dumont #2
(forsep #2)		Güzel Bilim Araçları11223-201; kafa derisini çıkarmak için kullanılır
Forseps: Dumont #3
(forsep #3)		Güzel Bilim Araçları11231-301; kafatasını çıkarmak için kullanılır
Forseps: Dumont #5a
(forsep #4)		Güzel Bilim Araçları11253-211; meninksleri çıkarmak için kullanılır
Özel Ekipman Tablosu
Zoom Stereo Diseksiyon Mikroskobu OlympusSZ4060Mikroskop, Laminer-Yatay Akış Kabini içine yerleştirilmiştir
Laminer-Yatay Akış KabiniNuaireNU-201-330
Biyolojik Güvenlik KabiniLabconco3440001Sınıf II
Su Ceketli CO2 İnkübatörVWR97025-83637 &°C'ye ayarlayın; C, %5 CO2
> Açılır kovalarFisher Scientific75006441Açılır rotor ile kullanılmak üzere
Açılır RotorFisher Scientific75006445Maksimum Yarıçap: 19,2 (cm)
Sorvall Legend RT+ Santrifüj
(klinik santrifüj)		Fisher Scientific75-004-377Açılır rotorlu
AccuSpin Micro 17 mikrosantrifüj
( masa üstü mikrosantrifüj)		Fisher ScientificS98645Mikrolitre rotorlu (24 x 1,5/2,0 ml; Kedi #: 75003524)   

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ranshoff, R. M. P. V. H. Microglia Physiology: Unique Stimuli, Specialized Responses. Annu. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).
  2. Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain. Neuroscience. 39, 151-170 (1990).
  3. Gomez Perdiguero, E., Schulz, C., Geissmann, F. Development and homeostasis of "resident" myeloid cells: The case of the microglia. Glia. 61, 112-120 (2013).
  4. Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways. Nat. Neurosci. 16, 273-280 (2013).
  5. Saijo, K., Glass, C. K. Microglial cell origin and phenotypes in health and disease. Nature reviews. Immunology. , 11-775 (2011).
  6. Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat. Neurosci. 8, 752-758 (2005).
  7. Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308, 1314-1318 (2005).
  8. Hu, S., et al. Cytokine and free radical production by porcine microglia. Clin. Immunol. Immunopathol. 78, 93-96 (1996).
  9. Muzio, M., Polentarutti, N., Bosisio, D., Prahladan, M. K., Mantovani, A. Toll-like receptors: a growing family of immune receptors that are differentially expressed and regulated by different leukocytes. J. Leukocyte Biol. 67, 450-456 (2000).
  10. Lee, S. J., Lee, S. Toll-like receptors and inflammation in the CNS. Curr. Drug Targets. Inflamm. Allergy. 1, 181-191 (2002).
  11. Block, M. L., Zecca, L., Hong, J. S. Microglia-mediated neurotoxicity: uncovering the molecular mechanisms. Nat. Rev. Neurosci. 8, 57-69 (2007).
  12. Halle, A., et al. The NALP3 inflammasome is involved in the innate immune response to amyloid-beta. Nat. Immunol. 9, 857-865 (2008).
  13. Chen, G. Y., Nunez, G. Sterile inflammation: sensing and reacting to damage. Nat. Rev. Immunol. 10, 826-837 (2010).
  14. Duewell, P., et al. NLRP3 inflammasomes are required for atherogenesis and activated by cholesterol crystals. Nature. 464, 1357-1361 (2010).
  15. Stewart, C. R., et al. CD36 ligands promote sterile inflammation through assembly of a Toll-like receptor 4. 11, 155-161 (2010).
  16. Beraud, D., et al. alpha-Synuclein Alters Toll-Like Receptor Expression. Front. Neurosci. 5, 80 (2011).
  17. Banati, R. B., Gehrmann, J., Schubert, P., Kreutzberg, G. W. Cytotoxicity of microglia. Glia. 7, 111-118 (1993).
  18. Combs, C. K., Karlo, J. C., Kao, S. C., Landreth, G. E. beta-Amyloid stimulation of microglia and monocytes results in TNF alpha-dependent expression of induciblenitric oxide synthase and neuronal apoptosis. J. Neurosci. 21, 1179-1188 (2001).
  19. Kim, Y. S., Joh, T. H. Microglia, major player in the brain inflammation: their roles in the pathogenesis of Parkinson's disease. Exp. Mol. Med. 38, 333-347 (2006).
  20. Colton, C., Wilcock, D. M. Assessing activation states in microglia. CNS Neurol. Disord. Drug Targets. 9, 174-191 (2010).
  21. Nakajima, K., Tohyama, Y., Kohsaka, S., Kurihara, T. Ceramide activates microglia to enhance the production/secretion of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) without induction of deleterious factors in vitro. J. Neurochem. 80, 697-705 (2002).
  22. Uesugi, M., Nakajima, K., Tohyama, Y., Kohsaka, S., Kurihara, T. Nonparticipation of nuclear factor kappa B (NFkappaB) in the signaling cascade of c-JunN-terminal kinase (JNK)- and p38 mitogen-activated protein kinase (p38MAPK)-dependent tumor necrosis factor alpha (TNFalpha) induction in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated microglia. Brain Res. , 1073-1074 (2006).
  23. Beraud, D., et al. Microglial Activation and Antioxidant Responses Induced by the Parkinson's Disease Protein alpha-Synuclein. J. Neuroimmun. Pharmacol. 8, 94-117 (2013).
  24. Su, X., et al. Synuclein activates microglia in a model of Parkinson's disease. Neurobiol. Aging. 29, 1690-1701 (2008).
  25. Minghetti, L., Levi, G. Microglia as effector cells in brain damage and repair: focus on prostanoids and nitric oxide. Prog. Neurobiol. 54, 99-125 (1998).
  26. Hirsch, E. C. Glial cells and Parkinson's disease. J. Neurol.. 247 (2), 58-62 (2000).
  27. Liu, B., et al. Role of nitric oxide in inflammation-mediated neurodegeneration. Ann. NY Acad. Sci. 962, 318-331 (2002).
  28. Shie, F. S., Nivison, M., Hsu, P. C., Montine, T. J. Modulation of microglialinnate immunity in Alzheimer's disease by activation of peroxisome proliferator-activated receptor gamma. Curr. Med. Chem. 16, 643-651 (2009).
  29. Rogers, J., Mastroeni, D., Leonard, B., Joyce, J., Grover, A. Neuroinflammation in Alzheimer's disease and Parkinson's disease: are microglia pathogenic in either disorder. Int. Rev. Neurobiol. 82, 235-246 (2007).
  30. Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. Isolation of murinemicroglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat. Protoc. 1, 1947-1951 (2006).
  31. Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigenpresentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared. J. Immunol. 154, 4309-4321 (1995).
  32. Ford, A. L., Foulcher, E., Goodsall, A. L., Sedgwick, J. D. Tissue digestion with dispase substantially reduces lymphocyte and macrophage cell-surface antigen expression. J. Immunol. Methods. 194, 71-75 (1996).
  33. Pino, P. A., Cardona, A. E. Isolation of brain and spinal cord mononuclear cells using percoll gradients. J. Vis. Exp. , (2011).
  34. Veremeyko, T., Starossom, S. C., Weiner, H. L., Ponomarev, E. D. Detection of microRNAs in microglia by real-time PCR in normal CNS and during neuroinflammation. J. Vis. Exp. , (2012).
  35. Su, X., Federoff, H. J., Maguire-Zeiss, K. A. Mutant alpha-synuclein overexpression mediates early proinflammatory activity. Neurotox. Res. 16, 238-254 (2009).
  36. Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptorCX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol. Cell. Biol. 20, 4106-4114 (2000).
  37. Imai, T., et al. Identification and molecular characterization of fractalkine receptor CX3CR1, which mediates both leukocyte migration and adhesion. Cell. 91, 521-530 (1997).
  38. Cardona, A. E., et al. Control of microglial neurotoxicity by the fractalkine receptor. Nat. Neurosci. 9, 917-924 (2006).
  39. Streit, W. J., Walter, S. A., Pennell, N. A. Reactive microgliosis. Prog. Neurobiol. 57, 563-581 (1999).
  40. Frank, M. G., Wieseler-Frank, J. L., Watkins, L. R., Maier, S. F. Rapid isolation of highly enriched and quiescent microglia from adult rat hippocampus:immunophenotypic and functional characteristics. J. Neurosci. Methods. 151, 121-130 (2006).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Cortical Microglia IsolationMicroglia ImmunophenotypeMurine NeonatesMechanical AgitationMixed Glial CulturesImmunofluorescence MicroscopyELISAMeningeal Tissue RemovalRotary ShakerCell Culture Plates

İlgili makaleler