Yöntem makalesi

Fareler ve Reeves 'munçağı Deer için Süt Toplama Yöntemleri

20.1K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/51007

⸱

19 Temmuz 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Immunology, and Pathology, Prion Research Center, Colorado State University

Bu makalede

Özet

Hayvan modellerinden süt toplanması çeşitli araştırma yollarını kolaylaştırır: pasif bağışıklığı anlamak, dikey bulaşmadan sorumlu patojenleri tanımlamak ve hatta transgenik farelerin kullanımı yoluyla insan anne sütünde bulunan proteinlerin ticari üretimi. Burada farelerde ve Reeves'in munçak geyiğinde süt toplama için basit bir yöntem gösteriyoruz.

Özet

Hayvan modelleri, bir patojenin doğal konakçısında normalde pratik olmadığı düşünülen şeyleri gerçekleştirmek için araştırma laboratuvarlarında yaygın olarak kullanılır. Hayvanlardan süt toplama, bilim insanlarına dikey iletim, pasif bağışıklık, meme bezi biyolojisi ve emzirme dahil olmak üzere üremenin birçok yönünü inceleme fırsatı verir. Bu çalışmalar için yeterli miktarda süt elde etmek, özellikle küçük hayvan modellerinden zorlu bir iştir. Burada, farelerde ve Reeves'in munçak geyiğinde süt toplama için özel ekipman veya kapsamlı eğitim gerektirmeyen ucuz ve kolay bir yöntemi gösteriyoruz. Bu özel yöntem iki araştırmacı gerektirir: biri sütü sağmak ve hayvanı stabilize etmek, diğeri ise sütü bir Muntjac veya fare modelinden uygun bir kapta toplamak. Fare modeli ayrıca bir P-200 pipetleyici ve ilgili pipet uçlarının kullanılmasını gerektirir. Bu yöntem düşük maliyetli ve gerçekleştirilmesi nispeten kolay olsa da, araştırmacılara optimal süt toplanması için hayvanın uyuşturulmasının gerekli olduğu konusunda bilgilendirilmelidir.

Giriş

Hayvan modelleri in vitro analizi ile elde edilemez hastalığı patolojisi içgörü sağlayabilir. En etkili sonuçlar elde etmek için, yakından hastalığın ve ilgili türler ile ilgili bir hayvan modeli kullanmak önemlidir. Örneğin, Reeves 'muntjac (Muntiacus reevesi), cervid prion proteini (CerTgPrP) 3 eksprese eden bir küçük Asya geyik 1,2, ve transjenik farenin cervid türleri için yararlı hayvan modelleridir. Her iki tür de yıl boyunca üreme izin polyestrous ve bu nedenle gebelikle ilgili dokular ve sıvılar için tutarlı bir kaynak cervid biyolojide belirli mekanizmaları incelemek için. Süt çalışmalar insanlarda daha hayvan modellerinde gerçekleştirilebilir daha basit (ve pahalı olmayan) olan uygulamaların geniş bir dizi vardır. Araştırmacılar 1) bulaşıcı hastalık bulaşma potansiyel bir kaynağı olarak süt ve kolostrum araştırmak olabilir, develo yavrular anneden aktarılan 2) immünglobülinlerpasif bağışıklık 4 ve 3) laktoferrinin pment, araştırmacılar şu anda çalışıyorsunuz pasif bağışıklık yer anne sütünde bulunan bir protein ticari 5 üretirler.

Küçük hayvanlardan süt önemli bir miktarı toplamak zor bir görev olarak kanıtlamak olabilir. Rogers daha sonra farelerde kullanılan sıçanlarda 6, süt toplamak için bir yaklaşım önerdi. DePeters Hovey ve daha sonra bir vakum kaynağına bağlı bir sağma birimi (yapımını gerektiren süt toplama, bir Pasteur pipetine bağlı bir lastik pipet ampul tarafından üretilen bir el ile oluşturulan vakum kullanılarak bir ve ikinci için iki yöntem önerilen bu fare süt 7 hasat bir musluk) olarak. Burada fareler ve sadece hazır laboratuvar ekipmanı ve temel teknik beceri gerektirir Reeves 'munçağı geyik, hem süt toplamak için basit, düşük maliyetli bir yöntem öneriyoruz. Bizim yöntem çeşitli süt, yeterli miktarda veriruygulamaları.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1.. Fare Süt Sağım Protokol

Bu protokol açıklanan yöntemler IACUC tarafından onaylanmıştır.

Offspring gelen Barajı'nın 1. Ayırma

  1. Sağılan edilecek baraj seçin. 8-12 gün toplama 21 gün için herhangi bir zaman noktası sonrası doğum kadar mümkün olan maksimal süt toplama-olsa sağlamak için doğumu yayınlamak 4 veya daha fazla yavru bir çöp ile bir baraj seçin.
  2. Sağımdan önce onu çöp en az 2 saat mesafede baraj ayırın.
    Not: Belirli bir zaman diliminde birden fazla baraj süt için tek arzusu Should, yeterli yiyecek ve su kaynağı ile aynı kafeste ayrı baraj evine kabul edilebilir.

Oksitosin, Anestezi ve Göz Lubricant 2. İdaresi

  1. Intraperitoneal oksitosin 2 IU / kg (IP) yönetmek. Oksitosin süt salgılanmasını uyarmak üzere emziren kadınlar arasında meme bezleri üzerinde etki eden bir hormondur. Oksitosin fr elde edilebilirom bir veteriner.
  2. 5-10 mg / kg xylazine IP ile birlikte 80-100 mg / kg ketamin içeren bir anestezik karışımı uygulayın. Örneğin, bir 10 ml stok anestezi Karışım yaklaşık 30 g ağırlığındaki fareler için önceden hazırlanmış olabilir ve 0.1 ml ketamin hidroklorid ve 8.9 ml 2 H, O, ve 1.0 ml ketamin içerir. 0.25 ml toplam anestezik süt toplanması için yeterli zaman vermek gerektiğini, hangi yaklaşık 20-30 dakika boyunca bu büyüklükte bir fare uyutacak.
    Notlar: hayvan başarıyla anestezi olduğunu belirlemek için, hafifçe bir katı bir yüzey üzerine midesine onu yerleştirmek; o ayakları hareketli ya da o tamamen anestezi ise onu ayağa teşebbüs edilmemelidir. Tamamen özgün doz ile anestezi edilmelerinden bir fare durumunda, araştırmacı bir verebilme ¼ veya anestetik karışım fare elde etmiş, fare ve / veya sedasyon seviyesinin boyutuna bağlı olarak orijinal dozun ½ . Ancak, bu i olabiliranesteziye bir advers reaksiyon şansı şekilde arttırın ve aynı zamanda fare daha derin anestezi uygulandı ve / veya daha uzun bir süre boyunca anestezi olması ile sonuçlanabilir.
    Not: Birden fazla baraj sağma ise, oksitosin ve ketamin ve ksilazin oksitosin için ve sedasyon kez kısa yarılanma ömrü nedeniyle anestezi enjeksiyonları sersemleme için gereklidir.
  3. Her gözün köşesine göz yağlayıcı küçük bir miktar uygulayın ve anestezi altında iken kurumasını fare gözleri önlemek için yayıldı.

3.. Süt Toplama

Manuel (R1 olarak anılacaktır) süt ve bir araştırmacı süt (R2) toplamak için ifade ederken anestezi fare tutmak için bir araştırmacı: süt toplama en kolay iki araştırmacı ile yapılır. Fare zarar vermemek için, düz bir yüzeye sabitlenmiştir, bu yöntem, aynı zamanda, tek bir kişi ile yapılabilir.

  1. R2, bir P-200 Pip, steril alkol hazırlık yastıkları ile donatılmış olmalıdırEtman, her bir fare için temiz bir pipet ucu ve bir 1.5 mi Eppendorf tüpüne ya da 1.2 ml cryovial olarak süt, (Malzemelerin bkz. Tablo) tutmak için bir kap.
  2. Oksitosin etkisi başlar gibi, süt boşaltma (Şekil 1A bakınız) fare meme alanında görünür hale gelecektir. R1: Steril alkol hazırlık takımını açınız ve yavaşça önce sağıma alanını temizlemek için fare meme alanını silin. Elle süt görünür bir boncuk emziğin dibinde oluşmaya başlar kadar hafifçe yukarıya doğru bir hareketle meme doku masajı ve sıkmak için başparmak ve işaret parmağı ile meme başı süt ifade.
  3. Pipet havayı serbest bırakmak ve süt toplama hazırlamak için ilk durağı P-200 pipetman pistonu basın.
  4. Süt damla üstündeki pipet yerleştirin, yavaşça yavaşça pistonu basıncı tahliye ederek pipet içine süt çekin. (Bkz: meme başı ya da deriye çok yakın ucu koymak için özenŞekil 1B). Bu tüm yol pipet ucunun üstüne süt çeker ve zor tutma kabı içine, genellikle yapışkan bir süt çıkarmak için yapacak şekilde tamamen pistonu serbest bırakmak için gerekli değildir.
  5. (Şekil 1C bakınız) ilk durağı geçen pistonu için başparmak ile kabın içine süt boşaltınız. Herhangi bir sıvı kaybolur, böylece küçük hacimli atılmasını kolaylaştırmak için, borunun karşı tarafı pipet basın.
  6. Herhangi emzikleri atlamak için değil şekilde elle saat yönünde ya da saat yönünün tersine ya hareket, her emzik süt sağmaya devam. Bu geri gelmek ve diğerinden daha fazla süt üretmesi gerektiğini sürekli aynı emzik süt ifade etmek kabul edilebilir ve kullanışlı hem de.

Barajı 4. Anestezi iptali

  1. Çoğu durumda, bu baraj sağım işlemi sırasında uyanmaya başlar başlamak için yaygındır. Bu durumda değilse, bir cag olarak baraj koyune dolaylı, ısıtmalı dolaşan battaniye gibi bir ısı kaynağı, altında o uyanmak başlayana kadar.
    Not: baraj, uyanmak o onu kendi kafesine hakkında yürümek mümkün olduğu kadar onun aktivite yakın gözlem tutmaya başlar gibi.
  2. Baraj mücadele olmadan kafes hakkında hareketli sonra, onun çöp ile kendi orijinal kafesin içine onu geri yerleştirin. Hiçbir kötü etkisi süt toplama sonra beslemek için pups 'yeteneğine göre not edilmiştir.

2.. Munçağı Sağım Protokol

Bu protokol açıklanan yöntemler IACUC tarafından onaylanmıştır.

Offspring gelen Doe 1. Ayırma

  1. Sağılan gereken parayı seçin. Reeves 'munçağı geyik genellikle bir geyik yavrusu 2 doğurur. Kolostrum 8 gerekli besinlerin erişmek için kahverengi fırsatı izin DOE birthing gün sonra süt.
    Not: kahverengi genellikle gizler ve proc sırasında yeniden gelmezedure; anne-çocuk çiftinin ayrılması gerekli değildir.

Oksitosin, Anestezi ve Göz Lubricant 2. İdaresi

  1. Kas içi Oksitosin 10 IU / kg (IM) yönetmek. Oksitosin süt salmayı teşvik etmek emziren kadınlarda meme bezleri üzerinde hareket eden bir hormondur. Oksitosin bir veteriner elde edilebilir.
  2. BAM Anestezik IM 11 Yönetici butorfanol 0.45 mg / kg, azaperone 0.25 mg / kg, medetomadine 0.07 mg / kg ihtiva etmektedir. BAM anestezik karışımı bir doz tam süt toplanması için yeterli zaman sağlar, yaklaşık 20-30 dakika, bir munçağı uyutacak. Anestezi için başka bir seçenek, yaklaşık 10-15 dakika boyunca, bir sakinleştirici munçağı doyurmaya 1-2 mg / kg, en midazolam olan. Bu süt toplama için yeterli zaman sağlar iken BAM ve hayvan kısa sürenin sonunda kaçmaya teşebbüs olabilir daha, bu anestezi daha hızlı metabolize edilir.
    Not: ağrı Minimal yanıt, Mücadele olmadan MJ tutmak için R1 yeteneği takip kulakları dokunmadan üzerine küçük refleksleri, hayvan başarıyla anestezi olduğunu gösterir.
    Not: tamamen özgün doz ile anestezi edilmelerinden bir Muntjac durumunda, araştırmacı bir verebilme ¼ veya önceden olmuştur sedasyon hayvan ve / veya seviyesi boyutuna bağlı olarak anestezi karışımın orijinal dozun ½ elde etti. Ancak, bu anesteziye ters tepki şansını artırabilir ve aynı zamanda munçağı daha derin anestezi ve / veya daha uzun bir süre için anestezi olmak neden olabilir.
  3. Anestezi altında iken kurumasını munçağı gözleri önlemek için her gözün ve yayılma köşesine yağlayıcı küçük bir miktar uygulayın.

3.. Süt Toplama

Süt toplama en kolay iki araştırmacı ile yapılır; in anestezi munçağı tutmak için bir araştırmacıkucak manuel (R1 olarak anılacaktır) süt ve bir rahat ve güvenli pozisyonda munçağı kafasını tutmak ve süt (R2) toplamak için ikinci bir araştırmacı ifade ederken.

  1. Kullanılan anestezik bağlı olarak, sağım onlar (midazolam kaynaklı) ya da 2) bir yatak ücretsiz Hol temizlik korumak için (BAM-işlem sırasında uyanmak gerekir onlar için güvenli bir yer sağlamak için onların kalem ya 1) yapılmalıdır ) neden oldu.
  2. R1 ve R2, süt tutmak için etanol ile ıslatılmış gazlı bez ve çok sayıda 15 ml konik polipropilen tüpleri ile donatılmış olmalıdır.
  3. Oksitosin etkisi başlar gibi, süt boşaltma munçağı adlı meme alanında görünür hale gelecektir. R1: eldivenli el ve parmak, hem de tüm meme ve etanol-ıslatılmış gazlı bez ile hayvanın her bir emzik sterilize. R2: solunum kolaylığı sağlayan ve işkembe yetersizliğini önlemek için güvenli ve rahat bir konumda munçağı kafasını tutun. Toplama tüpü cl tutun emzik için OSE potansiyel kontaminasyonu önlemek için dokunmadan sağıldığı.
  4. Meme süt ile tıkanmış kadar hafifçe yukarıya doğru bir hareketle meme dokusu sıkmak için başparmak ve işaret parmağı ile bir emzik süt ifade ve yavaşça bakınız Şekil 2 (emzik dışında ve R2 tutan tüp içine sütü rulo .)
  5. Not: R2 hiç süt az israf olacak, böylece toplama tüpü yerleştirilmiş olması için önemlidir bu yüzden süt, bir dere içinde çıkar.
  6. Munçağı adlı meme kadran ayrılmıştır. R1: Süt artık kolayca akar kadar her çeyrekte süt sağma işlemine devam. Süt bir emzik ifade edilemezse, ilk dönmeden önce diğer tüm başlıkları sağmaya. Bu geri gelmek ve diğerinden daha fazla süt üretmesi gerektiğini sürekli aynı emzik süt ifade etmek kabul edilebilir ve kullanışlı hem de.

Doe 4. Anestezi iptali

t "> Bu. Çoğu durumda, doe tüm süt ifade edilmiştir önce kaçmayı dener sağım işlemi sırasında uyanmaya başlar midazolam kaynaklı zevki için yaygındır. Minor emniyet sütü artırmak amacıyla kullanılır verim, ancak araştırmacılar ve geyik hem de güvenlik ve konfor aynı derecede önemlidir.

  1. BAM hızlı iptali için / mg medetomadine deri altına 2.5 mg atipamezol yönetmek doe anestezi.
    Not: anestezik iki tip ile, o tökezleyerek veya düşmeden kendi başına yürümek mümkün olduğu kadar geyik yakın gözlem korumak için gerekli olduğunu ve aspirasyon korku veya boğulma olmadan yemek ve içmek mümkündür. Hiçbir kötü etkisi süt toplama sonra hemşire buzağının yeteneğine göre not edilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Fare

Deneylerde, biz birkaç değişkenlere bağlı bir laboratuvar faresi süt yaklaşık 100-400 ul toplamak mümkün olduğunu tespit ettik. Bu değişkenler) toplanması için ayrılan süreyi, 2) oksitosin dozu, 1 içerir 3) baraj şu anda bakım ve zaman sonrası doğumun 4) miktarı kaç yavrular. Çalışmalarımız barajlar, en az 2 saat boyunca yavrularına ayrılır, en yüksek verimi elde edildiğini göstermiştir ve bir saat için en az 45 dakika sağma için, fare başına bir kenara ayrılmaktadır. E...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Fare

1 dahil olmak üzere bir fare süt toplama dikkate alınması gereken çeşitli faktörler,) toplanması için ayrılan süreyi, oksitosin 2) doz, 3) baraj şu anda hemşirelik ve 4) miktarı kaç yavrular vardır toplama sırasında doğumdan bu yana geçen zaman. Kurallar olarak önceki çalışmaları kullanarak, süt verimi için koşulları optimize etmek için yola çıktı.

Önceki araştırmalar, doğrudan çöp boyutu 8 ile süt verimi korelasyon vardır. Ne yaz...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Bu deneyler NIH hibe #RAI093634A tarafından finanse edildi. Munçak sağımındaki yardımları için DVM, PhD'den Jenny Powers'a büyük şükranlarımızı sunarız.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Malzemeler— Fare
Ketamini (KetaVed 100 mg / ml) (doz: 80-100 mg / kg)MWI / Vedco011075
Ksilazin (TranquiVed 100 mg / ml) (doz: 5-10 mg / kg) MWI/ VedcoNADA 139236
Göz kayganlaştırıcıMWI / Apexa701013
Oksitosin (2 IU / kg)Vet One501013
Malzemeler— Muntjac
Midazolam (1-2 mg / kg)Amerisource Bergen Drug Corp924326İsteğe bağlı: araştırmacı Midazolam'ı kendi başına veya anestezik olarak BAM kombinasyonunu kullanabilir
Butorphanol tartrat (Torbugesic) (0.45 mg / kg)Fort Dodge Hayvan SağlığıNADA 135-780
Azaperone tartrat (0.25 mg / kg)ZooPharm
Medetomadine HCl (0.07 mg / kg)ZooPharm
Antipamezol hidroklorür (Antisedan) (doz: 0.25 mg / kg)Orion CorporationNADA 141-033
Oksitosin (10 IU / kg)Vet One501013
Ekipman— Fare
P-200 Pipet AdamGilsonF123601
200 & mu; l pipet uçlarıLight LabsB-2004-SH
1 ml şırıngaMWI005427
27 G iğnelerMWI002031
Ekipman— Muntjac
15 ml konik tüplerVWR21008-918
22 G iğnelerMWI873
3 ml luer kilitli şırıngalarMWI001377

Kaynaklar

  1. Dueling, S. Muntiacus reevesi. Animal Diversity Web. , Available from: http://animaldiversity.ummz.umich.edu/accounts/Muntiacus_reevesi (2004).
  2. Pei, K., Taber, R., O'Gara, B., Wang, Y. Breeding cycle of the Formosan Reeves muntjac (Muntiacus reevesi micrurus) in northern Taiwan, Republic of China. Mammalia. 59 (2), 223-228 (1995).
  3. Browning, S. R. Transmission of prions from mule deer and elk with chronic wasting disease to transgenic mice expressing cervid PrP. J. Virol. 78 (23), 13345-13350 (2004).
  4. Van de perre, P. Transfer of antibody via mother's milk. Vaccine. 21 (24), 3374-3376 (2003).
  5. Maden, C. Genetically modified mice produce human milk protein. BioNews. , (2009).
  6. Rodgers, C. T. Practical aspects of milk collection in the rat. Lab. Anim. 29 (4), 450-455 (1995).
  7. Depeters, E. J., Hovey, R. C. Methods for collecting milk from mice. J. Mammary Gland Biol. Neoplasia. 14 (4), 397-400 (2009).
  8. Knight, C. H., Maltz, E., Docherty, A. H. Milk yield and composition in mice: effects of litter size and lactation. 84 (1), 127-133 (1986).
  9. Hedrich, H. J., Bullock, G. R. The laboratory mouse. , 735-736 (2004).
  10. Nishimori, K., Young, L. J., Guo, Q., Wang, Z., Insel, T. R., Matzuk, M. M. Oxytocin is required for nursing but is not essential for parturition or reproductive behavior. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93 (21), 11699-11704 (1996).
  11. Miller, B. F., Osborn, D. A., Lance, W. R., Howze, M. M., Warren, R. J., Miller, K. V. Butorphanol-azaperone-medetomidine for immobilization of captive white-tailed deer. 45 (2), 457-467 (2009).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Fare ModeliOksitosin UygulamasAnestezi Prosed rManuel Sa mP 200 PipetSteril Toplama T pleriMeme Dokusu MasajHayvan G venli i ve yile me

İlgili makaleler