Ökaryotlar için görülenden farklı olarak, esas olarak, küçük boyutu olarak bakterilerde ayrıntılı membran depolarizasyon ve iyon konsantrasyonu değişiklikleri, ölçüm zor geleneksel yöntemler yapan çok az çalışma vardır. Burada, biz floresan teknikleri kullanılarak anlamlı Gram-pozitif bir patojen Streptococcus pneumoniae tür olayları izlemek için detay protokolleri.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Membran Kutup, Membran Dürüstlük ve Hücre içi İyon Konsantrasyonlarında İzleme değişiklikler
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Membran depolarizasyon ve iyon tozları nedeniyle derinden enerjilerine ve sinyal iletiminin gibi hücresel fonksiyonları, darbe yetenekleri biyolojik sistemlerde yaygın olarak incelenmiştir olaylardır. Elektrot kullanımı ve patch-sıkma de dahil olmak üzere hem fluoresan hem de elektrofizyolojik yöntemler, iyi ökaryotik hücrelerde bu olayları ölçmek için geliştirilmiş olmasına rağmen, mikroorganizmalar içindeki etkinlik ölçümü için yöntem daha kompleksi ile bir arada, küçük boyutu göz önüne alındığında geliştirmek için daha zor olduğu kanıtlanmıştır membran koruyucu bakterilerin dış yüzeyi. Streptococcus pneumoniae (pnömokok) ölüm-inisiyasyon çalışmalar sırasında, kutupluluk değişiklikler, bütünlük, ve hücre içi iyon konsantrasyonları dahil membran olayların rolünü aydınlatmak istedim. Literatür taraması, biz çok az çalışma var olduğunu buldu. Diğer araştırmacılar iyon grip ölçmek için radyoizotop alımını ya da denge takip ettixes ve membran potansiyeli ve çoğunlukla Gram-negatif organizmaların çalışmaları, sınırlı sayıda, membran potansiyelini ölçmek için karbosiyanin veya oksonol floresan boyalar kullanılarak, ya da (AM) ester versiyonlarının hücre permeant asetoksimetil bakterileri yüklenirken bazı başarılar görmüştü iyon duyarlı floresan göstergesi boyalar. Bu nedenle Gram-pozitif organizma S. membran potansiyeli, rüptürü ve iyon taşıma ölçmek için protokoller kurulmuş ve optimize pneumoniae. Biz yöntem en iyi şekilde rasyometrik boyaların AM esterleri ile pnömokok yüklemek için, sırasıyla, membran depolarizasyonunu ve kopma ölçmek için hem de bis-oksonol boya DiBAC 4 (3) ve hücre-geçirgen olmayan boya propidyum iyodür kullanılarak protokolleri geliştirilmiştir Fura-2, PBFI ve BCECF bir floresans algılama plaka okuyucusu kullanılarak, Ca2 +, K +, H +, sırasıyla, hücre içi konsantrasyonlarında değişiklikleri tespit etmek. Bu protokoller pnömokok için kendi türünün ilk olarakve bu boyaların büyük çoğunluğu başka bakteri türleri kullanılmıştır edilmemiştir. Bizim protokoller S. için optimize edilmiş olsa pneumoniae, bu yaklaşımlar, diğer bakteri türleri içindeki çalışmaları için mükemmel bir başlangıç noktası oluşturan inanıyoruz.
Giriş
Bizim laboratuvar tümör hücrelerinde apoptoza neden (Tümör hücreleri için öldürücü yapılan insan alfa-laktalbümin için) HAMLET adlandırılan insan sütünden bir protein-lipid kompleksi tespit değil, aynı zamanda bakteri türlerinin 1,2 çeşitli öldürmek mümkün olduğunu sahiptir. Özellikle duyarlı olduğu bulunmuştur Bu tür büyük hassasiyet ve ölüm 2,3 bir apoptoz gibi bir fenotip gösteren Streptococcus pneumoniae (pnömokok) ile, solunum yolu hedef olanlar olmuştur. Membran depolarizasyon ve spesifik iyon taşıma etkinlikleri de tarif edilen ve radyoaktif TPP + iyonları ve JC-1 ve TMRE flüoresan boyalar da dahil olmak üzere, mitokon....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1.. Bakteriyel Kültürler hazırlanması
- Deneylerinde kullanılmak üzere kültür yetiştirilmesi
- 37 ° C ısıtma bloğu, S. dondurulmuş bir stok-şişeyi çözülme pneumoniae ve taze 9 ml de içerik, bir kültür cam tüp içinde 10 ml toplam hacim için% 0.5 maya ekstraktı (THY) olan Todd-Hewitt lapasının önceden ısıtılmış.
- Kültür orta log fazı (Abs 600 nm ≈ 0,5-0,6) ulaşana kadar 37 ° C'de statik inkübe edin.
2. Membran depolarizasyon ve ACL algılama
- Hazırlama reaktifler
- DiBAC 4 bir 50 uM stok (3)% 100 DMSO içinde....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bütün deneyler için, bir numune ve her bir mevcut koşulları kümesi vardır. Bu nedenle, her bir izleme zaman içinde bakterilerin bütün bir nüfusun floresan yoğunluğu temsil etmektedir. Sonuçlar, muamele edilmiş numuneler ve muamele edilmemiş kontrollere flüoresansı arasında açık bir ayrım ile, iyi biçimde olmalıdır. Floresansta bir görülen değişim kinetiği ve lisans izlenen olay olası mekanizma ve kapsamı ile ilgili bilgi sağlayabilir.
Membran polarizasyonu keşfetmek, bakteriler teda.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Boyutu kutupluluk ve membran bakteri ve içinde iyon konsantrasyonlarında değişiklikler bütünlük değişiklikleri tespit etmek için klasik elektrofizyoloji yöntemler kullanılarak sunulur sınırlamaya rağmen, biz S. bu olayları ölçmek için bir yol tarif ettiğim pneumoniae floresan boyalar kullanılmıştır. Bizim protokolleri ve genel olarak pnömokok bakteri türleri için tarif edilen az biri için tarif edilen kendi türünün ilk vardır. Bir floresans saptama plaka okuyucusu kullanılarak, bu olaylar zamanla bakte.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar bildirmek için hiçbir rakip mali çıkarları var.
Teşekkürler
Bu çalışma Bill ve Melinda Gates Vakfı (Grant 53085), JR Oishei Vakfı ve Amerikan Akciğer Derneği (Hibe RG-123721-N) APH için, ve EAC NIH (NIDCD) burs F31DC011218 tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Todd-Hewitt et suyu | Bacto, BD Diagnostics | 249240 | |
| Maya Özü | Bacto, BD Diagnostics | 212750 | |
| Fosfat Tamponlu Salin (PBS; pH 7.2) | İnvitrojen (GIBCO) | ||
| Dimetil sülfoksit | Sigma-Aldrich | D5879 | DMSO |
| DiBAC4(3) (bis-(1,3-dibutilbarbitürik asit) Trimetin Oksonol) | Moleküler Problar | B-438 | |
| Propidium İyodür | Sigma-Aldrich | P4170 | Deiyonize suda makyaj |
| D-(+)-Glikoz | Sigma-Aldrich | ||
| PowerLoad | Moleküler Problar | P10020 | 100x konsantre |
| Probenecid | Moleküler Problar | P36400 | Bir 77 mg |
| şişeye 1 ml PBS ekleyerek 100x stok yapınFura-2/ | Moleküler Problar | F1221 | Özel ambalaj (50 & mikro; g alikotlar) |
| PBFI/ | Moleküler Problar | P1267 | Özel ambalaj (50 &mikro; g aliquots) |
| Nijerin | Sigma-Aldrich | N7143 | |
| KH2< / sub>PO4< / sub> | JT Baker | 3246-01 | monobazik |
| NaOH | JT Baker | 5565-01 | |
| K2< / sub>HPO4< / sub> | JT Baker | 4012-01 | dibazik |
| BCECF / | Moleküler Problar | B1170 | Özel ambalaj (50 & mikro; g alikotları) |
| CCCP | Sigma-Aldrich | Protonoforu, sitoplazmaya H+ akışına neden olarak elektrik potansiyelini ve H+ gradyanını dağıtır. | |
| Kültür tüpü | VWR | 53283-802 | Spectronic spektrofotometreye uyar; borosilikat cam |
| Spektrofotometre | Thermo Scientific | Spectronic 20D + | |
| 15 ml Plastik konik boru | Corning | 430790 | |
| Şeffaf 96 kuyulu polistiren mikrotitre plakası | Fisher Scientific | 12-565-501 | |
| Plaka okuyucu | BioTek | Synergy 2 Çok Modlu | |
| Gen5 yazılımı | BioTek | Gen5 ve ticaret; Yazılım |
Kaynaklar
- Hakansson, A., Zhivotovsky, B., Orrenius, S., Sabharwal, H., Svanborg, C. Apoptosis induced by a human milk protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (17), 8064-8068 (1995).
- Hakansson, A., et al. A folding variant of alpha-lactalbumin with bactericida....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
Daha fazla makale keşfet
