Mechanotransduction Cues Etkileri Ayırma için Hidroksi-PAAm Hidrojeller hazırlanması

Özet

Biz minimum maliyetle veya uzmanlık ECM proteinlerinin doğrudan bağlanma sağlar hidroksi-PAAm adında yeni bir poliakrilamid hidrojel, sunuyoruz. Microcontact baskı hücresel mechanostransduction eğitim için doğal hücre mikroçevresinin birçok ipuçlarının bağımsız kontrolünü kolaylaştırır ile hidroksi-PAAm kombinasyonu hidrojellerinin.

Özet

Şimdi de, hücresel işlevleri, hücre dışı matris (ECM), çevre fizikokimyasal ve mekanik hissi veren hücre etkileşimleri düzenlenir olduğu saptanmıştır. Ökaryotik hücreler sürekli biyokimyasal sinyallerin içine ECM fiziksel değişiklikler transdüksivonu için yüzey mechanosensors yoluyla kendi yerel mikroortam duygusu ve gen ifadesi belirli değişiklikleri gerçekleştirmek için bu sinyalleri entegre. İlginç bir şekilde, birbirleriyle ECM kutu çift fizikokimyasal ve mekanik belirleyici değerleri saptanmış, hücre kaderine düzenler. Bu nedenle, mekanotransdüksiyonu anlamak için bir anahtar hücresel fonksiyonları ECM ipuçlarının göreceli katkısını decouple etmektir.

Burada hızlı ve kolay bir in vitro mekanotransdüksiyon ipuçlarının bağımsız ayarlama için biyolojik ilgili hidrojeller oluşturmak için detaylı bir deneysel protokol mevcut. Biz kimyasal olarak modifiye poliakrilamid hidrojeller (PAAm) kendi özünde olmayan ADHES aşmak içinPolimerizasyon sırasında Hidroksil-fonksiyonu akrilamid monomerleri içeren göre özellikleri ive. Bu ECM proteinleri arzu edilen herhangi bir doğada hareketsizleştirilmesine olanak hidroksi-PAAm olarak adlandırılan yeni bir PAAm hidrojel, elde edilmiştir. Microcontact baskı bağımsız olarak, tek-hücre morfolojisi, matris sertlik, doğası ve ECM proteinlerinin yoğunluğunu kontrol etmek için kullanılmasına olanak hidroksi-PAAM kombinasyonu hidrojellerinin. Bu in vitro hücre mekanotransdüksiyon işlemlerinde incelemek için her biyoloji laboratuarda ayarlanabilir basit ve hızlı bir yöntem sağlar. Biz ECM sertlik ve çekirdeği arasındaki mekanik bir bağlantıya göstermek endotel hücreleri üzerinde deneyler yaparak bu romanına iki boyutlu bir platform doğrulamak.

Giriş

Yerel mikro-hücresel birçok yönü (örneğin, sertlik, gözenek boyutu, protein yapısı, ya da hücre-ligand yoğunluğu) böyle bir motilite, hücre proliferasyonu, farklılaşması ve gen sentezlemesi gibi hücresel işlemleri kontrol eden düzenleyici ipuçlarının çalışmalarının oluşturulması sağlar. Hücre dışı ortama fizikokimyasal özelliklerine modifikasyonları, hücreler tarafından algılanan ve hücresel polarizasyon, göç ve farklılaşma dahil olmak üzere farklı deformasyonu fizyolojik sonuçlar, sebep olabilir. Bu hücreleri hücresel biyokimyasal sinyallerin içine ECM değişiklikleri tercüme Ancak, ne kadar belirsizliğini koruyor. Bu nedenle, büyük öneme mekanotransdüksiyon yollarını incelemek için hücreler ile bunların mikro çevreleri arasındaki etkileşimleri üretebileceği in vitro mikro çevrelerinde kontrol Mühendisi etmektir. Bu sorunu çözmek için, biz son zamanlarda kolayca iki kuruş oluşturmak için, hidroksi-PAAm hidrojeller denilen yeni bir yöntem ^1, girmiştikburadakilerin yumuşak bağımsız önemli mekanotransdüksiyon ipuçlarını kontrol etmek izin matrisler: matris sertlik, hücre geometrisi ve lohusalık, protein ve hücre-ligand yoğunluğunun doğası.

ECM morphogens -degradeler aracılığıyla hücresel süreçleri (kemotaksisini), yapışkan proteinleri (haptotaxis) ve sertlik (durotaxis) yönlendirir. Son birkaç yıldır, in vitro platformlarda ileri hücreler fizyolojik süreçlere ^2-5 içine biyokimyasal ve biyofizik özellikleri çeviremez nasıl didiklemek için bu hücre dışı ipuçlarını izole etmek için geliştirilmiştir. Elektron ışın ^{6, 7} fotolitografi, fotokimyasal hareketsizlik ^8, ya da plazma destekli teknikleri ⁹ micropatterned substratlar üzerinde yaşayan hücrelerin büyümesini yönlendirmek için geliştirilmiştir. Bu teknikler önemli sonuçlar vermiştir rağmen, çoğu hücre davranışı farklı ipuçlarının bireysel etkisi arasındaki ayrımcılığa izin vermezve onlar birkaç laboratuvarları gelemez teknik olanaklar gerektirir. Bu teknikler arasında, microcontact baskı (μCP), hücre-yapışkan mikro-adalar ¹⁰ oluşturmak için sağlam ve erişilebilir bir yöntem olarak ortaya çıkmıştır. Daha yakın zamanda, bu alanda harcanan çabaların ^11-14 canlı dokularda gözlenen katılıklarının geniş yeniden üretilmesi için ayarlanabilir bükülmezliklerde hidrojel μCP geliştirilmesi için girişimlerde bulunulmuştur. Bu yapıtlar arasında, poliakrilamid (PAAm) ¹⁵ popüler hale zaten hücre biyomekanik analizleri için en yaygın olarak kullanılan polimer esaslı matrisler biridir.

PAAm yüzeylerinin, N-sülfosükinimidil-6-[4'-azido-2'-nitrophenylamido] (sülfo-SANPAH) ve ECM proteinlerinin sülfo-SANPAH nitrofenil UV aktivasyonu ile yüzeye bağlı olan heterobifonksiyonel çapraz bağlayıcı ile işlevselleştirilen azid gruplarının ^16. Bir başka teknik, ciddi bir şekilde okside edilmiş proteinlere bağlanma hidrazin oluşurperiodat ile ^17. Hynd ve arkadaşları bir acroyl-streptavidin monomer ¹⁸ varlığında fotopolimerizasyonu gerektirir protein ve peptitler ile biomimetic hidrojel yüzeyleri desenlendirme için bir tekniği tanıttı. Daha yakın zamanda, Tseng ve ark. 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil] karbodiimid hidroklorür ile aktif hale Pensilvanya jeller inkübe gerektiren bir optik kuvars maske aracılığıyla PAAM derin, UV'ye maruz dayalı yeni bir yöntem micropatterning ¹⁹ (EDC) bildirmişlerdir ve N-hidroksisukinimid (NHS) su solüsyonları, önceki protein ekleyin. Uzun sentez yöntemleri (örneğin, diyaliz, liyofilizasyon, vb), pahalı kimyasal bileşikleri (örneğin, hiyaluronik asit, sülfo-SANPAH) ya da derin UV: homojen ve yeniden üretilebilir bir proteinler micropatterns oluşturmak için bu tekniklerin yeteneği rağmen, çoğu büyük sınırlamaları acı ışınlama. Buna ek olarak, bu teknikler, alt-tabaka sertliği mikrodesenlerle bağımsız modülasyonuna izin vermezGeometri, ECM protein yapısı ve hücre-ligand yoğunluğu.

Dikkate bu sınırlamaları alırsak, biz yumuşak hidrojel proteinlerin ve biyomoleküllerin çeşitli immobilizasyon sağlar ve hücresel fonksiyonlarda rollerini deşifre etmek için mekanotransdüksiyon ipuçlarının bağımsız ayar veren bir roman ve basit akrilamid-temelli bir yaklaşım geliştirdik. Bunun yerine sert kimyasal bileşikler ile tedavi edilmesi için PAAm hidrojeller, biz PAAm polimerizasyon sırasında hidroksil grupları ile ticari bir akrilamid getirmektedir. Bu basit işlem herhangi diğer teknik gereksinimleri olmadan PAAm hidrojellerin içsel anti-yapışkan özelliği üstesinden gelir.

Hidroksil gruplarının varlığı hidrojen bağı etkileşimlerini oluşturan proteinler ve biyomoleküllerin hidroksi-PAAm hidrojellerin yüksek afinite yol açar. ΜCP ile birlikte, hidroksi-PAAm hidrojeller bağımsız kontrolü olan iki boyutlu bir kültür platformunun hızlı bir üretimini mümkün kılmakmekanotransdüksiyonu eğitimi için güçlü bir platform olması öngörülen matriks katılık, ECM proteinleri türü, hücre-ligand yoğunluğu ve sınırlı yapışabilmede, üzerinde.

Bu protokolün amacı, kolaylıkla malzeme bilimleri herhangi uzmanlığı olmadan hidroksi-PAAm hidrojeller yapmak için gerekli bilgileri sağlamaktır. Araştırmacılar patofizyolojik mekanizmaları içinde yer mekanotransdüksiyon yollarının daha iyi anlaşılmasına yol açabilir hücresel ve doku düzeyinde fizyolojik ilgili soru sormak için nihai hedefi bir araç sağlamaktır.

Protokol

1. Cam lameller Yüzey etkinleştirme

1. Bir Petri kabı ve smear (önerilen kimyasal davlumbaz) 5 dakika için üzerine 0,1 M NaOH çözeltisi koyun cam dairesel lamelleri (25 mm çap).
2. NaOH çözüm çıkarın ve yavaşça steril bir kültürü kaputu bir sallanan plaka üzerinde sallanan ise tam 20 dakika boyunca steril GKD ₂ O ile lamelleri batırmayın.
3. Steril GKD ₂ O boşaltın ve adımı 1.2 tekrarlayın.
4. Steril bir cımbız ile lamelleri çıkarın ve aktif yüzü yukarıya yeni bir Petri tabağına yerleştirin.
5. Yüksek saflıkta bir azot gazı akışı altında sabit bir kuru lamelleri.
6. Bir steril kültür kaput, 1 saat boyunca lamel aktive tarafında 3-(trimetoksisilil) propil akrilat (% 92) ince bir tabaka sürün.
7. Yaygın steril GKD ₂ O 3 yıkar cam lamelleri yıkayın ve yeni bir Petri kabındaki steril GKD ₂ O bunları bırakın.
8. Petri kabı dokununParafilm ile ve 10 dakika için hafif ajitasyon altında olan bir kavrama plakası üzerine yerleştirin.
9. Ince ipuçları ile steril bir cımbız ile GKD ₂ O gelen lamelleri çıkarın ve aktif yüzü yukarıya yeni bir Petri tabağına yerleştirin.
10. Lamelleri yapışmasını toz önlemek için alüminyum folyo ile kuru bir yerde oda sıcaklığında saklayın.

Hidroksi-PAAm hidrojellerin 2. Hazırlık

1. , 1.5 ml'lik Eppendorf tüpü içinde N-hidroksietil akrilamid (HEA) 65 mg ağırlığında hazırlayın. Bu taze HEA solüsyonu hazırlamak için önemlidir.
2. HEA kadar 50 mM HEPES tamponunun 1 ml ilave edilir ve tam çözünme gerçekleşene kadar HEA bir vorteks cihazı kullanılarak karıştırın.
3. İstenen hidrojel sertliği ulaşmak w / HEPES akrilamid çözeltisi ve / hepes-bis-akrilamid çözeltisi içinde ağırlık (Tablo 1 e bakınız) ağırlık oranı% 2 olan gerekli hacimde% 40 ağırlık 400 ul ilave edin. 5 ml'lik bir nihai hacme, 50 mM HEPES ile ayarlayın.
4. Bir vorteks ve Degas kullanarak çözüm karıştırınhidroksi-PAAm polimerizasyonunu önleyen solüsyonu içindeki oksijen konsantrasyonunu azaltmak için 20 dakika boyunca vakum odasındaki.
5. , Steril bir başlık altında, sterilize etmek için bir 0.2 um gözenek boyutlu filtre içinden filtre ile degased çözelti filtre.
6. 7 dakika boyunca UV / ozon temizleyici dairesel cam lamelleri (22 mm çap) etkinleştirin.
7. % 10 amonyum persülfat (APS) çözüm 100 ul hazırlayın, bu 100 ul GKD ₂ O. 10 mg APS Bu taze APS-eriyiğinin hazırlanması önemlidir.
8. Polimerizasyonun başlatılması için tetrametilendiamin 2.5 ul (TEMED) ile sterilize hidroksi-PAAm çözeltisi (adım 2.5) APS çözeltisi 25 ul ekle. , Steril koşullar altında, kabarcıkların giriş olmadan 3 ardışık pipettings çözeltiyi karıştırın.
9. , Steril bir başlık altında, 22 mm yer gl hemen (adım 1.9 temin edilebilir) ve 25 mm örtücü kısım üzerine hidroksi-PAAm çözeltisi 25 ul damla yerleştirmekdamlasının üstüne eşek lamel (adım 2.5 ile elde edilmiş) çözeltisi hidroksi-PAAm sıkmak. Steril bir cımbız ile 22 mm cam lamel merkezi ve kabarcıkları yumuşatır.
10. Hidroksi-PAAm hidrojeller, 15 dakika boyunca oda sıcaklığında polimerize olmaya bırakın. Polimerizasyon işleminin tamamlanmasını takip Eppendorf tüpü içinde el ile geriye kalan hidroksi-PAAm çözeltisi ters çevirin.
11. Tam steril GKD ₂ O lamelleri sokmak ve dikkatli bir şekilde 22 mm 'lik cam lamelleri ve hidroksi-PAAm hidrojel tabakası arasında bir traş makinesi bıçak kenarına tanıtarak 22 mm ebadındaki bir cam lamelleri ayırın.
12. Steril PBS ile hidroksi-PAAm hidrojeller yıkayın (PBS 3 borsalar) ve tam hidrasyon korumak için steril PBS dalmış jeller edelim.
13. 3 güne kadar, 4 ° C'de steril PBS hidroksi-PAAm hidrojeller saklayın.

3. Polidimetilsiloksan (PDMS) Microstamp imalatı

NOT: Bir silikon usta imalat sta önce gerekliPDMS microstamp imalat rt. Bir silikon ustanın Bu mikroimalat özel ekipman ve eğitim gerektirir taşbaskı teknikleri ile yapılabilir. Bir Nanofabrikasyona tesisi ile işbirliği silikon ana imal teşvik edilmektedir. Alternatif olarak, talep üzerine ısmarlama mikrostrüktürlü silikon ustaları fabricates bir şirkete başvurun. Bu silikon master fabrikasyon tek ihtiyacı bir kez yapılması dikkat etmek önemlidir. Gerçekten de, mikrostrüktürlü silikon ustaları elastomerik pulları elde etmek için süresiz kullanılabilir.

1. Karışım PDMS ve bir 10 sertleştirme ajanı: plastik bir şişeye 1 oranında 10 dakika boyunca, bir pipet kullanılarak iyice karıştırın.
2. Aşama 3.1 sırasında oluşmuş hava kabarcıklarını çıkarmak için vakum altında PDMS karışım gaz çıkışına.
3. Bir Petri kabındaki mikrostrüktürlü silikon ustası yerleştirin ve kabarcıklar oluşturan olmadan bunun üzerine gazdan arındırılmış PDMS karışımı bir 10 mm kalınlığında bir tabaka döküm.
4. Bir 60 ° C 'de 2 saat boyunca PDMS tedavi sağlarfırın.
5. Bir neşter ile tozsuz bir ortamda, soyulan PDMS katman ve tüketim 1 cm ² microstamps.
6. Forseps kullanarak, yer PDMS bir Petri kabındaki desen-up microstamps.

4. micropatterning Hidroksi-PAAm hidrojeller

1. 15 dakika boyunca, bir etanol / su içinde yer PDMS microstamps (50/50) çözeltisi ve sonikasyon.
2. Nitrojen akışı akımı ile pul kurutun ve onları, 7 dakika boyunca UV / ozon süpürge (λ <200 nm) model-up yerleştirin.
3. , Steril bir başlık altında, bir 1 cm'lik ² PDMS damga mikroyapılı yüzeyi üzerine arzu edilen bir protein çözeltisi (örneğin, 100 ug / ml PBS içinde laminin veya 25 ug / ml PBS içinde fibronektin) bir 150-ul damla yerleştirin.
4. İsteğe bağlı: hücre yoğunluğu ligand modüle protein çözeltisinin konsantrasyonu değiştirin.
5. Her bir köşesine doğru bir pipetle steril bir ucu ile taşıyarak damga yüzeyi boyunca protein çözeltisi yayılırdamga.
6. , Steril bir başlık altında 60 dakika boyunca PDMS damga adsorbe etmek için protein çözeltisi bırakın. Protein zarar görmesini önlemek için lambalarını kapatın.
7. , Steril bir başlık altında, bir Petri kutusu içine (adım 2.13 den temin edilebilir), hidroksi-PAAm kaplı lamelleri aktarın.
8. Steril koşullar altında düşük bir azot akımı ile hidroksi-PAAm alt tabakaların yüzeyine aşırı PBS çıkarın. Kısa jel yüzeyde duran su olduğuna dair bir kanıt olarak görülmektedir işlemi durdurun. Jel, bu aşamada iyice kurutulmuştur olmamalıdır.
9. Kuru dikkatle PDMS yapılandırılmış yüzey, yüksek saflıkta bir azot gazı akımı ile sürekli bir damga.
10. Pansuman doku forseps ile, protein kaplı damgası tutun ve kurutuldu hidrojel yüzeyi ile temas edecek şekilde yapılandırılmış yüzey yerleştirin. Pul microfeatures ve hidrojel yüzeyi arasında iyi bir temas sağlamak için PDMS damga üstündeki cımbız ucu ile kısa bir basınç noktaları uygulanır.
11. Th PDMS damga bırakınoda sıcaklığında 1 saat e hidrojel yüzeyi.
12. Yavaşça soyunma doku forseps ile hidroksi-PAAm hidrojellerin PDMS pulları kaldırmak ve damga temizlemek için adım 4.1 izleyin.
13. Değişimi başına 10 dakika boyunca PBS içerisinde, steril koşullar 3 değişimi (pH = 7.4) ile yoğun bir şekilde hidroksi-damgalı PAAm hidrojeller yıkayın.
14. İsteğe Bağlı Diğer ECM proteinlerinin ek Micropatterns adımlarını 4,5-4,11 izleyerek hidroksi-PAAm yüzeye eklenebilir.
15. Sallanan plaka üzerinde hafif ajitasyon altında 4 ° C de bir gece boyunca PBS içinde 5 mg / ml BSA içinde steril bir çözelti ile Pasif yapma basılı olmayan bölgeleri.
16. Değişimi başına 10 dakika boyunca PBS içerisinde, steril koşullar 3 değişimi (pH = 7.4) ile iyice yıkayın. Bu aşamada, damgalı hidroksi-PAAm hidrojeller bir haftaya kadar 4 ° C 'de muhafaza edilebilir.

Micropatterned hidroksi-PAAm Hidrojeller 5. Hücre Birikimi

1. Önce kaplama c 30-45 dakika boyunca hücre ortamındaki hücre lamelleri inkübearşın.
2. 37 ° C'de steril PBS ile 75 cm ² kültürü şişesi içinde kültürlenmiş yapışmayan hücreler yıkanır ve 10 dakika boyunca tripsin-EDTA 3 ml ya da Accutase ile çıkarınız.
3. G müstakil hücreleri ihtiva eden şişe içine cep hattı için önceden ısıtılmış tam büyüme ortamı uygun istenen miktarda aktarın ve x, 650 ° C'de 3 dakika boyunca bir hücre süspansiyonu santrifüj.
4. Mikropipet ile süpernatantı ve 15-20,000 hücre / ml komple kültür ortamında tekrar süspansiyon hücreleri.
5. 1-2 saat için nem (Kademe 5.1 de elde edilmiş), bir lamel micropatterned hücre çözeltisi 4 ml ilave edilir ve hücre yer kaplı bir lamel kültürü inkübatöründe 37 ° C'de ve% 5.
6. Aspire hafifçe bekâr hücreleri ve kültür ortamı değiştirin. Inkübatör bağlı hücreleri dönün ve onları (hücre tipine bağlı olarak, 3-6 saat) tam olarak yayılmasına izin.

Sonuçlar

Şekil 1A ile akrilamidin kopolimerleştirme (akrilamid) ve bisakrilamid (bis-akrilamid), N-sunulur hydroxyethylacrylamide gömülü hidroksil grupları ile rastgele radikal polimerizasyonu ile poliakrilamid, su-teşekkül eden bir primer hidroksil ihtiva eden (HEA) monomerler, (hidroksi-PAAm) . Bu protokol, HEA bir ağırlık 65 mg HEPES 1 ml'lik bir hacim içinde seyreltilmelidir. HEA yoğunluğu birine kabaca eşit olduğunu bilerek, biz 1.065 ul (HEA + HEPES) bir çalışma hacmi elde varsayalım. Tablo 1 'de

Tartışma

Modern hücre biyolojisi, in vitro gözlemler çoğu, çoğunlukla ECM proteinleri veya RGD sekansı ihtiva eden sentetik peptitler, ince bir tabaka ile kaplanmış katı bir cam lameller üzerinde gerçekleştirilmiştir. Bununla birlikte, bu temel kültür alt-tabakalar hücresel süreçler üzerinde çalışılması için mekanotransdüksiyon doğru bir model sağlamaz ve böylece ECM'nin bütün fizikokimyasal ve karmaşıklığını büyük ölçüde özetleyebildiğini yoktur. Bu sorunu çözmek için, biz istenilen miktarda ve ECM proteinleri doğa...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
UV/Ozon Fotoreaktör	Ultraviyole Ürünler	Model PR-100
Sallanan plaka	IKAcWerke	Model KS 130 Temel
Vortexer	Bilimsel Endüstriler	Modeli Vortex Genie2
Vakumlu gaz giderme odası	Uygulamalı Vakum Mühendisliği	DP- 8-KIT
Parafilm	Sigma-Aldrich	P7793-1EA
İnce uçlu paslanmaz çelik forseps	Sigma-Aldrich	Z225304-1EA
Pansuman doku forseps	Sigma-Aldrich	F4392-1EA
Polistirende Petri kapları	Sigma-Aldrich	P5731-500EA
Alüminyum folyo, kalınlık 0.5  mm	Sigma-Aldrich	266574-3.4G
İzogor membran filtre (0.2 & mikro; m gözenek boyutu)	Millipore	GTTP Filtre kodu
Yuvarlak cam lamel (22 mm çap)	Neuvitro	GG-22
Yuvarlak cam lamel (25 mm çap)	Neuvitro	GG-25
Değişken hacimli mikropipet	Sigma-Aldrich	Z114820
Protein mikrosantrifüj tüpleri	Sigma-Aldrich	Z666505-100EA
Neşter kolları	Sigma-Aldrich	S2896-1EA
Neşter bıçakları	Sigma-Aldrich	S2771-100EA
Hücre kültürü şişeleri (75 cm2)	Sigma-Aldrich	CLS430641
Ultrasonik banyo tepsisi, katı (paslanmaz çelik)	Sigma-Aldrich	Z613983-1EA
Polidimetilsiloksan	Dow Corning	Sylgard 184 silikon elastomer kiti
Akrilamid (toz)	Sigma-Aldrich	A3553
N, N'-Metilenbis (akrilamid)	Sigma-Aldrich	146072
N-Hidroksietilaklamid	Sigma-Aldrich	697931
N, N, N', N'-Tetrametiletilendiamin	Sigma-Aldrich	T9281
Amonyum PerSülfat (APS)	Sigma-Aldrich	A3678
3- (Trimetoksisilil) propilen akrilat	Sigma-Aldrich	1805
İnsan Plazma Fibronektin	Millipore	FC010
EHS'den Laminin	Sigma-Aldrich	L2020
Sodyum hidroksit	Sigma-Aldrich	221465-25G
Çift damıtılmış su (ddH2O)
Endotel hücre büyüme ortamı	Hücre Uygulamaları	211K-500
İnsan Göbek Veni Endotel Hücreleri (HUVEC)	Invitrogen	C-003-5C
Accutase	PAA laboratuvarları	L11-007
HEPES tampon çözeltisi 1 M H2O	Sigma-Aldrich	83264-500ML-F
Antibiyotikler-antimikotikler	PAA laboratuvarları	P11-002
Fosfat Tampon Tuzlu su çözeltisi	PAA laboratuvarları	H15-002
Alexa Fluor 488 Phaloidin	Moleküler Problar	A12379
Farede üretilen anti-vinculin antikoru	Sigma-Aldrich	V9131
Keçi anti-fare antikor-tetrametilrodamin	Moleküler Problar	T-2762
Anti-Fibronektin (tavşan)	Sigma-Aldrich	F3648
Streptavidin ve nbsp;	Sigma-Aldrich	41469
Anti-Laminin antikoru (tavşan)	Sigma-Aldrich	L9393
Anti-tavşan IgG-FITC	Sigma-Aldrich	F7512
Tripsin-EDTA çözeltisi	Sigma-Aldrich	T3924-100ML
Mutlak etanol	Sigma-Aldrich	459844-2.5L