Görüntüleme ve İmmünhistokimyanın için Retina Wholemount Hazırlık için optimize edilmiş Protokolü

Hassas sağlam dokularda immünohistokimya yapmak, taşıma ve transfer sırasında hasar riski taşır. Bu, beyin dilimlerinde veya dejenere retina gibi diğer ince dokularda ortaya çıkabilir. Ek olarak, nöronal yapıların immün boyalanması için avantajlı olabilecek, ancak kullanımlarını engelleyerek yapısal stabilitenin bozulmasına neden olan belirli doku fiksasyon yöntemleri vardır. Bunun özel bir örneği, reseptörlerin ve^{hormonların 1-7} boyanması için üstün olan, ancak sabit dokunun instabilitesi nedeniyle yaygın olarak kaçınılan karbodiimid bazlı fiksasyondur.

Burada, çeşitli boyama teknikleri için sabit veya sabitlenmemiş hassas dokuyu yapısal olarak desteklemek için hidrofilize bir PTFE membran kullanan bir prosedürü açıklıyoruz. Destek membranı, fiksasyondan önce ve sonra hassas dokunun manipülasyonuna izin vererek, doku hasarı riskini en aza indirirken birkaç işlem adımına izin verir. Genel olarak, doku bütünlüğünü korumak için bu basit yöntem, aksi takdirde kaçınılabilecek teknikleri kullanma fırsatı sağlar. Bu nedenle, bu yaklaşım, dilimleme prosedürlerini takiben kırılgan hale gelen beyin dilimleri gibi çok çeşitli dokuların hazırlanması için de başarıyla kullanılabilir.

Tüm deneysel prosedürlerde hayvanlar, Oftalmik ve Görme Araştırmalarında Hayvanların Kullanımına İlişkin ARVO Bildirisi'ndeki düzenlemelere göre ve Weill Cornell Tıp Koleji tarafından onaylanan protokollere uygun olarak tedavi edildi. Hayvanlara karbondioksit ve ardından servikal çıkık ile ötenazi yapıldı.

1. Wholemount Retina Diseksiyonu

1. Fare ötenazi yapıldıktan sonra, gözlerini enüklee edin ve oksijenli HEPES tamponlu Ringer çözeltisine yerleştirin (Tablo 1).
2. Ora serrata boyunca küçük bir makasla dairesel bir yol keserek, gözü forseps ile limbusta tutarak korneayı çıkarın. Lensi forseps ile dışarı çekin.
3. Künt kenarlı forseps kullanarak mümkün olduğunca fazla vitreus çıkarın. Bu adım bolus enjeksiyonları ve elektrofizyolojik kayıtlar için önemlidir; Tek başına immünohistokimya yapılırken gerekli değildir.
4. Forsepsleri retina ve vizör lastiği arasına yerleştirerek retinayı göz kabından ayırın ve forsepsleri çevre boyunca yavaşça hareket ettirin. Sklerayı ikinci bir forseps seti ile sıkıca tutarak göz kabını stabilize edin. Retinanın göz kabından ayrılmasını kolaylaştırmak için retina ile göz kapağı arasındaki yerde optik siniri kesin.
5. Retina parçalara ayrılabilir (örn. çeyrekler) veya bir bütün olarak kullanılabilir. Parçalara ayırmak için, retina çevresinden optik sinire kadar kesiler yapmak için makas kullanın. Alternatif olarak, tüm retinayı kullanmak için, çevreden optik sinirin yarısına kadar kesiler yapın. Kesiler düz bir hazırlık yapılmasına yardımcı olacaktır.

2. Hidrofilize PTFE Membran Ek Parçasına Montaj

1. Membranı aşağıda anlatıldığı gibi hazırlayın. Fizyolojik kayıtlar veya boya enjeksiyon deneyleri yapıldığında, kalan halkanın yüksekliği 1 mm olacak şekilde bir torna tezgahı veya el testeresi kullanarak tutucuyu kısaltın.
   Not: Kültür plakası ekleri değiştirilmemiş veya modifiye edilmiş olabilir (Şekil 1A). Konfigürasyonun seçimi, deneyin amacına göre belirlenir. İmmün boyama için, değiştirilmemiş bir uç uygundur.
2. Pürüzlü yüzeyleri ince (300 kum veya daha yüksek) zımpara kağıdı ile cilalayın.
3. (İsteğe bağlı) Halkanın altındaki ayakları makasla çıkarın.
4. Herhangi bir kalıntıyı temizlemek için, zarı damıtılmış suda 2-3 dakika durulayın veya sonikleştirin.
5. Dokuyu zarın üzerine monte edin (Şekil 1A). Dokuyu bir miktar solüsyonla plastik bir transfer pipeti ile zarın üzerine yerleştirin. Aktarım sırasında doku örneğinin pipete yapışmasını önlemek için gerekirse pipetin dar ucunu kesin.
6. Retinayı ganglion hücreleri (GC'ler) yukarı gelecek şekilde takın: zar üzerinde, retinayı yayarken ve kıvrımları forseps ile açarken çözeltiyi yavaş yavaş çıkarın.
7. Zarın karşı tarafında, doğrudan dokunun altına boş bir şırınga (1 ml) yerleştirin. Pistonu 0.2-0.3 ml'lik bir hacme geri çekerek emme uygulayın. Kullanmadan önce şırınganın tutma ucunu keserek emme yüzey alanını artırın. Doku, fiziksel olarak zarın içine yerleştirildiği için yapışma için daha fazla tedavi gerektirmez.

3. İzolektin Alexa 488'in Bolus Enjeksiyonu

1. Yama pipetleri ve boyama solüsyonu hazırlayın. Yama pipetlerini borosilikat kılcal camdan ~1 MΩ dirençli Alevli/Kahverengi çektirme ile çekin. Pipetin ucunu yavaşça kırın.
2. Adım 1.2'de açıklanan HEPES tamponlu Ringer çözeltisinin 10 μl'sine 0.3 μl izolektin Alexa 488 stok çözeltisi ekleyerek boyama çözeltisi yapın.
3. Numuneyi enjeksiyon için yama kelepçesi kurulumuna aktarın (Şekil 1C). Membranı, bağlı doku ile birlikte, ısıtılmış (37 ° C) ve oksijenli HEPES tamponlu Ringer çözeltisi ile perfüze edilmiş kayıt odasına yerleştirin.
4. Boya içeren pipeti iç sınırlayıcı zara yerleştirin (ILM, Şekil 2A). Mikromanipülatör kullanarak, pipeti ILM'ye nüfuz edene kadar ILM'ye karşı daha da ilerletin. Boyama solüsyonunu bir picospritzer kullanarak 1 saniye boyunca 10-20 psi'lik bir basınçla enjekte edin. Enjeksiyon için tekli veya çoklu yerler hedeflenebilir (Şekil 2B). Bir picospritzer mevcut değilse, enjeksiyon için pozitif bir hava basıncı sağlamak için 10 ml'lik bir şırınga kullanılabilir.
5. Enjekte edilen dokuyu 10 dakika inkübe edin. İnkübasyon sırasında, enjekte edilen doku epifloresan aydınlatması altında görüntülenebilir.
6. Etiketlemeden sonra, preparat görüntüleme için bir mikroskoba alınabilir. Inserti, retina tarafı aşağı bakacak şekilde cam tabanlı bir kültür kabına aktarın (Şekil 1C).
7. Numuneyi nemli tutmak için bir damla HEPES solüsyonu ekleyin.
8. Ek parçayı kültür kabının dibine sıkıca sabitlemek için plastik halkanın çevresine 2-3 nokta vakumlu gres yerleştirin.
9. Çanağı mikroskop aşamasına aktarın.

4. Paraformaldehit ve Karbodiimid Fiksasyonu

1. Ek parçayı 15 dakika boyunca fiksatife aktararak numuneyi sabitleyin. Uygulamaya bağlı olarak daha uzun veya daha kısa fiksasyon süreleri kullanılabilir. Her iki fiksatif de GFP, izolektin veya floresan Alexa hidrazidlerini (örneğin, yama kelepçe kayıtlarında hücreleri doldurmak için kullanılır) sabitlemek için etkili bir şekilde kullanılabilir.
   Not: Fiksasyon için %4 karbodiimid veya %4 paraformaldehit çözeltileri kullanılabilir. Yapışmayı sürdürmek için, doku zara zaten bağlandıktan sonra fiksasyon yapılmalıdır. Doku, montajdan hemen sonra veya fizyolojik kayıt ve / veya bolus enjeksiyonundan sonra sabitlenebilir.
2. Dokuyu fosfat tamponunda (PB) 30 dakika durulayın. Bundan sonra, doku ya bir bütün montaj olarak işlenebilir (adım 5) ya da dikey bölümler halinde kesilebilir ve daha sonra işlenebilir (adım 6 ve 7).

5. Retinal Wholemounts'un İmmün Boyanması

1. 24 oyuklu bir tabakta (Şekil 1D), bir boyama solüsyonunda 1 saat boyunca zar üzerindeki retina parçalarını bloke edin.
2. Fare anti-PSD-95 primer antikorlarını boyama solüsyonunda 1:300 oranında seyreltin ve karanlıkta oda sıcaklığında 48 saat boyunca uygulayın. Doku ile her oyuğa ~ 100-150 μl antikor çözeltisi ekleyin. Kurumasını önlemek için, kullanılmayan kuyuları damıtılmış suyla doldurun.
3. PB, 3x'te 20 dakika durulayın.
4. Boyama solüsyonunda 1:500 oranında çözülmüş eşek anti-fare Alexa 568 ikincil antikorunda 24 saat inkübe edin.
5. PB, 3x'te 20 dakika durulayın.
6. Lekeli dokuyla birlikte eki PB solüsyonu ile doldurulmuş standart 3 cm'lik bir Petri kabına yerleştirin. Küçük bir makasla, retinayı içeren zarın bir kısmını halkadan kesin.
7. Zar üzerindeki retinayı yukarı doğru kayan bir retina üzerine aktarın. PB'yi çıkarın, montaj ortamı ekleyin. Retinanın aşırı sıkışmasını ve hasar görmesini önlemek için sürgü ile lamel camları arasına kırık bir kapak kayma camından küçük parçalar yerleştirin. Lameli yerleştirin.
8. Lameli oje ile yerine kapatın. Slaytları karanlıkta, buzdolabında saklayın.

6. Membrana Monte Dokunun Dikey Kesiti

1. Fiksasyondan sonra, zar üzerindeki dokuyu 30 dakika, 1 saat ve gece boyunca sırasıyla% 10,% 20 ve% 30 sükroz gradyan çözeltilerine daldırın. Gece adımı buzdolabında 4 °C'de, diğer tüm adımlar oda sıcaklığında gerçekleştirilir.
2. Makas kullanarak, dokuyla birlikte zarı plastik ekleme halkasından çıkarın.
3. Kesilen zarı retina yukarı bakacak şekilde Parafilm üzerine yerleştirin ve Kimwipes ile mümkün olduğunca fazla solüsyonu çıkarın.
4. Parafilmi doku ile birlikte kriyostat odasına koyun ve bir damla OCT ortamı ekleyin. Donmayı hızlandırmak için hızlı dondurucu cihazını kullanın.
5. Dondurulmuş numuneyi ayırın ve ters çevirin.
6. Fazla donmuş OCT'yi kesin. Numunenin etrafında üç taraftan yaklaşık 2 mm bırakın ve tutucuya takılacak taraftan 5-6 mm bırakın.
7. Açıkta kalan retina tarafını (zar tarafı) bir damla OCT ile örtün. Takma alanını boş bırakın.
8. Membranı retina dokusu ile dondurun. Artık numune bir kesme tutucusuna yerleştirilmeye hazırdır.
9. Soğuk bir tutucu halkaya bir damla OCT koyun. Dondurulmuş numuneyi hemen damlanın içine yerleştirin.
10. Kriyostat sıcaklığını -19 °C'ye ayarlayarak 10-20 μm kalınlığında kesitler kesin. Sıcak (oda sıcaklığında) polisin yapışma slaytları kullanın. Bölümlerin sıkı bir şekilde yapışmasını sağlamak için slaytları ekli bölümlerle birlikte karanlıkta ~2-3 dakika (41 °C) bir ısıtma platformuna bırakın.
11. Slaytları bir saklama kutusuna koyun ve kullanana kadar -20 °C'de tutun.

7. Retina Bölümlerinin İmmün Boyanması

1. Slaytları bölümleri olan dondurucudan çıkarın. Yoğuşmayı gidermek için 1 dakika oda sıcaklığında kalmalarına izin verin.
2. Daha fazla inkübasyon için bir bariyer oluşturmak için bölümleri bir sıvı engelleyici ile çevreleyin.
3. Slaytları inkübasyon kutusuna yerleştirin. Antikor çözeltisinin buharlaşmasını önlemek için kutunun altını suyla örtün.
4. PB ile 5 dakika durulayın.
5. Aynı boyama solüsyonlarını hazırlayın ve 5. adımdaki adımları izleyin. Birincil antikor ile inkübasyon gece boyunca ve ikincil antikor ile 1 saattir. Lamel ile sürgü arasında kırık cam kullanmayın.

Burada, boyama prosedürleri sırasında tam retinayı desteklemek için hidrofilize PTFE membranın kullanılmasından yararlanan iki temsili deney gösterilmiştir. İlk deney, birden fazla retina tabakası boyunca uzanan ayrıntılı bir kan damarı ağı olan retina damar sisteminin hızlı ve basit karakterizasyonu için yöntemi göstermektedir (Şekil 2). Bu yaklaşım, izolektinin bolus yüklemesini SRH ile daldırma etiketleme ile birleştirir. Bu, neredeyse anında görselleştirilebilen ve taranabilen canlı dokuyu etiketlemek için etkili bir yöntemdir. Retinada, kan damarları yüzeysel tabakadan derin tabakaya kadar etiketlenebilir (Şekil 2E). Nispeten iyi yayılabilir SRH'nin aksine, izolektin iç sınırlayıcı zar (ILM) boyunca iyi nüfuz etmez. Bu sınırlama, izolektin içeren çözeltinin ILM'nin altına bir cam pipet ile enjekte edilmesiyle aşılır. SRH kan damarları etiketlemesi için, ek parçaya monte etmeden önce dokuyu boyamak daha iyidir. SRH sadece canlı dokuyu lekeler ve paraformaldehit veya karbodiimid ile fiksasyondan sonra etiketleme kaybolur.

İkinci deney (Şekil 3), sinaptik proteinleri etiketlerken paraformaldehit ile konvansiyonel fiksasyona göre karbodiimid ile fiksasyonun avantajlarını göstermektedir. Genel olarak, karbodiimid fiksatifinin kullanımından kaçınılır, çünkü nispeten kırılgan doku ile sonuçlanır. Bununla birlikte, dokunun bir zar üzerine monte edilmesi, bu sorunu hafifleterek yeterli yapısal destek sağlar. Karbodiimid ile kısa bir fiksasyon periyodu ve ardından sinaptik belirteç PSD-95 için boyama ile IPL'deki immünofloresan parlak bir punktat görünüme sahipti, bu da bireysel sinapsların ayırt edildiğini düşündürdü (Şekil 3B). Buna karşılık, konvansiyonel paraformaldehit fiksatifi kullanıldığında, sinaptik bileşenlerin tanımlanması daha az açıktır (Şekil 3E). Retinal kriyostat kesitlerinde de benzer sonuçlar elde edildi (Şekil 3C ve F).

Şekil 1. Hidrofilize PTFE membranların çok yönlü kullanımı. (A) Değiştirilmemiş 12 mm'lik bir membran ekine (solda) bağlı canlı retinal tam montaj ve tutucu kısmı çıkarılmış bir ek parçaya bağlı dörtte bir retina. Montaj prosedürünü gösteren videoya bakın. (B) Bir yama kelepçesi kurulumu içinde dik bir mikroskop sahnesinde yaşayan retina. (C) Ters konfokal mikroskop aşamasında yaşayan retina. (D) Serbest yüzen retina dokusu (ok) ve zar ekine monte edilmiş doku (ok ucu). Resmi daha büyük görmek için buraya tıklayın.

Şekil 2. Alexa 488 izolektin enjeksiyonundan sonra canlı retinal bütünlükteki vaskülatüre fokal ve global etiketleme. (A) Enjeksiyondan önce iç sınırlayıcı zarın (ILM) üzerinde izolektin ile doldurulmuş bir pipet ile retinanın DIC görüntüsü. (B) Pipetin ILM'nin altına nüfuz etmesinden ve pipet çözeltisinin basınçlı enjeksiyonundan sonra A'dakiyle aynı alan. Açıkça görülebilen ganglion hücrelerinin bulunduğu nokta, çözeltinin ILM ile ganglion hücre tabakası arasına enjekte edildiğini gösterir. (C-H) Sülforhodamin (SRH, kırmızı) ve izolektin (yeşil) ile etiketlenmiş canlı bir retinal bütünün konfokal görüntüleri. (C) Çoklu bolus enjeksiyonları (yıldızlar) ile uygulanan izolektin. Etiketlenen alanın büyüklüğü enjeksiyonun basıncına göre değişir. SRH tüm damar sistemini etiketler. (D) Yüksek büyütme altında bir z-yığınının projeksiyonu, tüm vaskülatür katmanlarını ve parlak bir şekilde etiketlenmiş mikroglia'yı (ok) gösterir. (E) D ile vurgulanan alandan Z yığını 90° döndürülmüş. (F-H) E'deki etiketlere karşılık gelen tek tek kan damarı katmanlarının bir görünümü. OPL-dış pleksiform tabaka, INL-iç nükleer tabaka, GCL-ganglion hücre tabakası. Ölçek çubukları: AB ve DH için 50 μm, C için 1 mm. Resmi daha büyük görmek için buraya tıklayın.

Şekil 3. Sinaptik yapıların antikor etiketlemesinde fiksatifin rolü. Karbodiimid (AC) veya paraformaldehit (DF) ile sabitlenmiş retinal bütünlükler. (A,D) B6'da yeşil floresan proteini eksprese eden ganglion hücreleri. Cg-Tg(Thy1-YFPH)2Jrs/J fareler (Jackson Lab. Stok #0033548). Kareler, B ve E'de gösterilen yüksek büyütme alanlarını gösterir. (B,E) Sinaptik işaretleyici PSD-95 (kırmızı) için boyama. Projeksiyonlar dar bir odak düzlemi içindedir (0,3 μm aralıklı iki konfokal görüntü). (C,F) PSD-95 için boyanmış dikey bölümün tek konfokal görüntüsü. OPL içindeki fotoreseptörlerin akson terminallerinin, IPL'deki (sol paneller) sinapslar için daha zayıf lekelenme göstermek üzere aşırı maruz kaldığına dikkat edin. Ekler (sağ paneller), sol panellerde vurgulanan alanların yüksek büyütme oranlarını gösterir. OPL-dış pleksiform tabaka, INL-iç nükleer tabaka, IPL-iç pleksiform tabaka, GCL-ganglion hücre tabakası. Ölçek çubukları = A ve D'de 50 μm; B, C, E ve F'de 10 μm. Resmi daha büyük görmek için buraya tıklayın.

Yazarların birbiriyle rekabet eden hiçbir mali çıkarı yoktur.