Embriyonik ön beyin gelen Endotel Hücreleri İzolasyon ve Kültürü

Özet

Bu video 10-12 gün içinde embriyonik ön beyin endotel hücreleri saf kültürlerin hazırlanması için kolay ve güvenilir bir strateji gösterir ve serebral damar birçok açıdan odaklanmış araştırma için yararlı olacaktır.

Özet

Embriyonik beyin endotel hücreleri anjiyogenez ve nörovasküler gelişim ve etkileşim çalışmasında önemli bir araç olarak hizmet edebilir. Embriyonik ön beyin, PIAL ve periventriküler iki damar ağları, mekansal farklı ve farklı kökenleri ve büyüme desenler var. Pial ve periventriküler damar ağlarından endotel hücreleri benzersiz gen ekspresyon profillerini ve işlevleri vardır. Burada embriyonik ön beyin (telencephalon) periventriküler damar ağı (PVECs) endotel hücrelerinin saf popülasyonlarının izolasyonu, kültür ve doğrulama için bir adım adım protokol mevcut. Bu yaklaşımda, embriyonik gün 15 farenin elde pial membran yoksun telencephalon, doğrandı kolajenaz / dispaz ile sindirilir ve tek bir hücre süspansiyonu içine mekanik olarak dağıtılabilir. PVECs güçlü bir manyetik kullanılarak mikro, konjüge anti-CD-31/PECAM-1 antikoru ile pozitif seçim kullanılarak hücre süspansiyonundan saflaştınlırayırma yöntemi. Bunlar birbirine karıştırılmış ve bundan başka, alt-kültürlenmiş olana kadar saflaştırılmış hücreler, endotelyal hücre kültür ortamı içinde 1 kollajen kaplı kültür tabakları üzerinde kültürlenmiştir. Faz-kontrast ışık mikroskobu ve floresan mikroskobu ile görüntülenmiştir gibi PVECs, bu protokol sergi parkelerde ve iğ biçimli fenotipleri ile elde. PVEC kültürlerin saflığı endotel hücre belirleyicileri ile kurulmuştur. Bizim ellerde, bu yöntem güvenilir ve tutarlı PVECs saf popülasyonları verir. Bu protokol, ön beyin anjiyojenezde içine mekanik bakış açısı kazanıyor PVEC etkileşimleri ve nöronal hücre tipleri ile çapraz görüşmeleri anlayış ve terapötik anjiyogenez için muazzam bir potansiyele sahiptir hedefleyen çalışmaları yararlanacaktır.

Giriş

Anjiyogenezis, nöron ve nöronal göç merkezi sinir sistemi (MSS) geliştirme, onarım ve rejenerasyon kritik olaylar. Çeşitli çalışmalar, zarif, endotel hücreleri, çözünebilir faktörleri serbest bırakılması yoluyla ve doğrudan temas ile nöronal proliferasyonu ve tersi uyardığını göstermiştir. Biz meraklı nöronal progenitorlar / nöral kök hücre, embriyonik beyninden izole ise bu çalışmaların çoğunda ^1-3, bunlar yetişkin beyin, diğer yetişkin doku kaynakları, veya endotelyal hücre hatları ile endotel hücreleri ile kültürlenmiş olduğu bulundu. Bu kısmen embriyonik beyin endotel hücreleri popülasyonları saf izole edilmesi ve kültür ile ilgili teknik zorluklar nedeniyle olabilir. Ancak, anjiyogenez, nöron oluşumu, ve nöronal migrasyon, normal erişkin beyinde daha embriyonik beyinde daha sağlam büyüklükte emir meydana gelen eşzamanlı olaylardır. Embryoni ait periventriküler damar ağıc ön beyin (telencephalon) bazal ganglia primordiumunun içinde yer alan bir kaptan kaynaklanan ve embriyonik gün 11 (E11) ^4,5 ile telencephalon dorsal ventral gelen düzenli bir gradyan şeklinde gelişir. Periventriküler damar ağı damarlarının Bu pleksus kökenleri, anatomik konumu, büyüme modelleri ve gelişim düzenlemesi ^4,5 dayalı Pial gemiler farklıdır. Periventriküler anjiyogenez degrade yayılma yönü telencephalic enine nörogenetik degrade eşleşir. Telencephalon içinde, periventriküler anjiyogenez degrade ve göç GABA nöron degrade teğet yanı sıra mekansal ⁶ çakışıyor. Zamanlama ile ilgili olarak, anjiyojenez gradyan yaklaşık bir gün ile nörogenetik gradyanı ve GABA nöron gradyanı önceden olduğu. Böylece, periventriküler endotel hücreleri mekansal ve zamansal iyi telencephalic nörogenezi desteklemek için kritik ipuçları sağlamak için konumlandırılmış venöronal migrasyon ^4,6. Bu nedenle, nöronal soylarının ve / veya nöronlarla kokültürü deneylerde embriyonik periventriküler endotel hücrelerinin kullanımı nörovasküler etkileşimlerin incelenmesinde ve nörodejeneratif hastalık veya iskemik / travmatik beyin hasarı tedavisi için yeni yollar geliştirmek için daha uygun bir modeli sağlayacaktır.

Biz, epitel hücre bulaşma sınırlamak için değil, aynı zamanda moleküler ve periventriküler damar ağı ^4,6 (Pial EC'ler ayırmak adlandırılır PVECs) endotel hücrelerinden fonksiyonel olarak farklı olan Pial endotel hücreleri ayırmak için değil, sadece Pial membran kaldırma önemini vurgulamaktadır . Burada, biz rutin PVECs zengin ve saf verim elde etmek bizim laboratuvarımızda kullandığımız yöntem tarif. Bu endotel hücreleri, tek bir zaman ayarlı gebe fare izole edilmiş embriyonik forebrains hazırlanır. Onlar ileride kullanmak için başarılı bir şekilde, genişletilmiş alt kültürleri ve aşağı donmuş olabilir.

Protokol

1.. Reaktifler ve Çözümleri hazırlanması

1. 35 mm kültür çanağı Kaplama: Kolajen Tip 1 çözeltisi, 20 mM asetik asit (~ 100 mg protein / şişe) içinde bir sulu çözelti olarak temin edilir. Steril doku kültürü dereceli su kullanarak,% 0.01 'lik bir konsantrasyona kadar çalışma kollajen çözeltisinin uygun bir hacmi ile seyreltilir. 1, oda sıcaklığında (RT) 3-4 saat boyunca kollajen çözeltisinin ml ya da 37 ° C arasında veya bir gece boyunca 2-8 ° C'de kaplayın yemekler Kaplı çanak aşırı çözüm çıkarın ve bir gecede kurumasını bekleyin. Medya eklemeden önce doku kültürü dereceli su veya PBS ile çanak durulayın. Kaplı yemekler bir ay boyunca 4 ° C'de saklanabilir.
2. Tam Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı (DMEM) hazırlayın. (, 1 ml/100 ml konsantrasyonu 1x),% 10 FBS ve antibiyotik-antimikotik çözelti ile DMEM (500 mi) Ek. Tam DMEM iki ay boyunca 4 ° C'de saklanabilir.
3. Bir kısım DNase I (0.001 mg / ml) ile birlikte DMEM (50 mi) Hazırlama, (D olarak anılacaktırMEM-DNase I).
4. Kolajenaz ve dispaz (DMEM-collagenase/dispase olarak anılacaktır) (1 mg / ml) ile birlikte DMEM bir kısım (10 ml) hazırlayın.
5. EGF (5 ug) ile takviye edilmiş endotel hücre kültür ortamı (ECCM, 500 mi), hazırlama, ECGS (100 mg) ve antibiyotik-antimikotik çözelti 5 ul. ECCM iki ay boyunca 4 ° C'de saklanabilir.
6. Kullanmadan önce tüm medya Prewarm.
7. % 0.5 BSA ve 2 mM EDTA ile PBS, pH 7.2 Saflaştırma tamponu hazırlayın. Soğuk tampon Ol (2-8 ° C).

2. Telencephalon Embriyolar Dissekan Kaldırma

Laboratuvar hayvanları kullanan tüm deneyler McLean Hastanesi hayvan bakım ve kullanım komiteleri tarafından onaylanan ve laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için NIH yönergelere uygun edilmektedir.

1. Zamanlanmış hamile CD1 fareleri (embriyonik gün 15) kullanın. Vajinal fiş keşif günü embriyonik gün 0 (E0) olarak kabul edilir. CD1 barajlar genellikle büyük ibrelerin üretmek, yani 10-12 embriyos hamile baraj bekleniyor.
2. Histerotomi için, Ketamin (100 mg / kg) / ksilazin (5 mg / kg) intraperitonal enjeksiyonu ile anestezi hamile farelere. Farenin yaklaşık 20-30 g, bir 10 ml / kg Ketamin / Ksilazin anestetik çözeltisi 0,3 ml sunmak ve bu ağrı sağlar ve tehlikeli anestezik intraperitoneal enjeksiyonu sırasında az. Enjeksiyonlar için el kısıtlama kullanın.
3. Ayak tutam ile derin anestezi edin. Derin anestezi farelerden embriyolar çıkarın. Hemen anneden uzaklaştırılması üzerine her embriyo başını kesmek. Buz soğukluğunda PBS içinde steril Petri kaplarında embriyonik kafaları yerleştirin.
4. 2013 Sürümü: anestezik aşırı doz (130 mg / kg pentobarbital, ip), Hayvanların ötanazi AVMA Yönergeleri ile tutarlıdır ötenazi için bir yöntem ile hemen ötenazi histerektomi izleyin.
5. Stereo mikroskop altında, ince mikrotip makas ve ince forseps ile baş beyin kaldırmak. Not: Yüksek kaliteli bir teşrihiyon başarıyla embriyonik beyinden Pial membran kaldırmak için gereklidir. Bu uygulama ile elde edilir. Ince forseps ve mikrotip makas aynı zamanda iyi bir diseksiyon almak için önemli araçlardır.
6. Pial zardan soymak için beyin ve mikrotip makas bir tutuş elde etmek için forseps kullanabilir. Mesencephalon ve metencephalon çıkarın ve telencephalon izole. Buz içinde 2 ml PBS ile bir 35 mm kültür çanağı için her embriyolardan Pial içermeyen telencephalon aktarın.

3. Hücre İzolasyonu

1. Bir neşter ile 1-2 mm parçalar halinde telencephalon kıyma ve tam DMEM 2 ml ihtiva eden bir 15 ml Falcon tüpüne doku toplamak.
2. Kümeleri kaybolur ve sütsü süspansiyon elde edilene kadar, 1 ml'lik bir pipet ile yavaşça ancak iyice doku ayrıştırmaları.
3. Santrifüj, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 800-1.000 xg'de hücreleri ayrışmış.
4. Dikkatli ce ayırmak yavaşça DMEM-DNase I süpernatant ve tekrar süspansiyon pelet çıkarınLLS tekrar oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 800-1.000 xg'de 1 ml pipet ve santrifüj kullanılarak.
5. Sıcak tam DMEM'de pelletini. Steril bir 70 um naylon elekle filtre hücreleri. Süzülür hücreleri toplamak ve buz tutmak.
6. Meşin üzerinde tutulan hücreye bölümlerini toplamak ve oda sıcaklığında 1-2 dakika boyunca DMEM-collagenase/dispase (2 mi) ile daha da kolaylaştırırlar. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 800-1.000 xg santrifüj yoluyla DMEM-DNase I hücreler 3 kez yıkayın. Adım 3.5, toplanan süzülmüş hücrelerle, bu hücreleri havuzda toplayın. Bitmiş DMEM ile bir kez toplam hücrelerin yıkayın. Hücre sayısı ve manyetik etiketleme adımları belirlemek için devam edin. Not: Bu manyetik etiketleme önce, tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için önemlidir.

4. Manyetik Etiketleme

1. Bu protokol, 10 ⁷ hücrelerinin manyetik etiketleme göstermektedir. Hücre sayıları 10'dan az ^7, aynı reaktif hacmi kullanımı ve hücre sayıları 10'dan büyük ^7, tüm reaktif hacimlerini ve toplam birimler büyütmekbuna göre (örneğin 2 x 10 ⁷ toplam hücre için, gösterilen tüm reaktiflerin iki hacmi kullanın). Buz içinde tüm reaktifler ve hücreler tutun.
2. Bir hemositometreyle ile hücre sayısını belirlemek.
3. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin hücre süspansiyonu. Aspire tamamen yüzer.
4. CD31 mikro, 10 ul ve ardından hücre pelletine arıtma tamponu 90 μl/10 ⁷ hücreleri ekleyin. Üretici tarafından sağlanan mikro-anti-fare CD31 monoklonal antikoru konjuge edilir.
5. İyice karıştırın ve buzdolabında 15 dakika boyunca inkübe edin. Not: Manyetik etiketleme sırasında yüksek sıcaklıklar ve / veya daha uzun bir enkübasyon süresi spesifik olmayan bağlanma ile sonuçlanabilir.
6. 10 dakika boyunca 300 xg'de arıtma tampon ve santrifüj 1-2 ml/10 ⁷ hücreleri eklenerek hücreler yıkayın. Arıtma tampon 500 ul süpernatan ve hücreler tekrar süspansiyon çıkarın. Manyetik ayırma veya saflaştırma aşamasına geçin.

5. Puaralığında olacak şekilde yapılır

1. MACS Ayırıcı manyetik alan MS sütun yerleştirin.
2. Arıtma tampon 500 ul ile sütun durulayın.
3. Kolona hücre süspansiyonu uygulanır. Yüksek bir hücre sayısı sütunu tıkayabilir olarak MS kolona hücrelerin uygun sayıda yükleyin. Dikkat: Her MS sütun daha sütunları kullanmak, daha yüksek bir hücre sayısı için 2 x 10 ⁷ hücre sayısını ağırlayacak.
4. Toplayın ve etiketsiz hücreleri içeren flow-through atın.
5. Arıtma tampon 500 ul üç kez sütun yıkayın. Yıkama adımları sırasında, kolon rezervuar müteakip arıtma tampon bölüntülerin eklemeden önce boş olduğundan emin olun.
6. MACS ayırıcı gelen sütun çıkarın ve 15 ml Falcon tüp üzerine yerleştirin.
7. Bir piston MS sütunu ile birlikte temin edilir. Pipet MS kolona ve hemen arıtma tampon 1 ml sıkıca sütuna pistonu iterek manyetik etiketli hücreleri yıkayın.
8. Plaka celKollajen Tip 1 ile kaplanmış ve% 95 O ₂ ve% 5 CO ₂ ile 37 ° C'ye ayarlanmış bir kuluçka ECCM hücreleri büyümek bir 35 mm kültür çanak ls.
9. Her dört gün orta değiştirin. Çanak konfluent olduğunda, 10-12 gün sonra deney ya da alt-kültür için PVECs kullanın.

6. PV ECS alt kültür

1. ECCM çıkarın ve steril PBS içinde 1-2 ml PVECS olan tek tabaka durulayın.
2. Yavaşça hücre tek katmanının karşılamak için% 0.25 tripsin-EDTA çözeltisi 1,5 ml ekleyin.
3. Inkübatör tabak dönmek. 5-7 dakika içinde, hücreler tabak yüzeyinden ayırır.
4. Hücreler müstakil hemen sonra tripsin inhibitörü eşit hacimde ve birkaç kez çiğnemek.
5. , Steril bir 15 ml Falcon tüpüne hücreleri aktarın. 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj tüpü.
6. Süpernatantı ve prewarmed ECCM 1 ml pelletini.
7. Kültür, im genişletilmesi için hücreleri tohumyaşlanma ya da başka deneyler.

Sonuçlar

Günde 1-12 dan PVECs fenotipik karakterizasyonu faz kontrast mikroskopisi ile (Şekil 2) ile gösterilir. Hücre bölünmesi (Şekil 2A) 1. gün gösteri morfolojisi karakteristik çanak bağlı hücreler. 5-8 gün arasında, taş taş PVECs geçiş endotel hücreleri ve (Şekil 2B ve 2C) ile in vivo duruma daha yakındır için tipik şekilli morfolojiye mili için. 12. günde kültür tarafından PVEC tam izdiham (Şekil 2B) elde edilir. PVECs koloni

Tartışma

PVEC ait daha fazla fizyolojik olarak uygun nörovasküler etkileşimleri ilgili çalışma other doku kaynaklarından erişkin beyin endotel hücreleri ve EC 'den ve aynı zamanda tedavi edici potansiyele sahiptir. PVEC hazırlanması için, ölü hücrelerin CD31 mikro, için spesifik olmayan bağlamak olabilir çünkü iyi bir canlılığı elde etmek için hızlı çalışması için diseksiyon ile kritik bir başlangıçtır. Tek hücre süspansiyonu önce manyetik etiketleme aşamasından elde değilse, hücre kümeleri, sütunu yapışmasına neden olacaktı...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
DNase I	Sigma	D-4527
Kollajen, sıçan kuyruğundan elde edilen Tip 1 solüsyonu	Sigma	C3867
DPBS	Kalite Biyolojikler	114057-131&	nbsp;
EDTA	Fisher Bilimsel	M4055
BSA	Sigma	A2058
MS sütunu	Miltenyi Biotech	130-042-201&	nbsp;
CD31 mikro boncuklar	Miltenyi Biotech	130-097-418
MACS ayırıcı	Miltenyi Biotech	130-042-102&	nbsp;
MACS çoklu stand	Miltenyi Biotech	130-042-303
Hücre süzgeci 70 & mikro; m	BD Biyobilim	352350
Antibiyotik ve antimikotik solüsyon	Sigma	A5955
FBS	Sigma	F4135
Kollajenaz / Dispas	Roche	10269638001
DMEM	Lonza	12-604F
35 mm Kültür kabı	BD Bioscience	353001
15 ml Falcon tüpü	BD Biyobilim	352097
50 ml Falcon tüp	BD Bioscience	352098
ECCM kiti	BD Bioscience	355054	Kiti, Endotel hücre büyüme takviyesi, EGF ve Soya Fasulyesi Tripsin İnhibitörü
Endotel Hücre Büyüme Takviyesi (EKGS)	Bioscience	354006
RBECGM	Hücre Uygulamaları	R819-500
DMEM F12	Yaşam Teknolojileri	10565-018
GlutaMAX	Yaşam Teknolojileri	305050-061
Doku Kültürü Sınıf Su Yaşam Teknolojileri		15230162
% 0.25 Tripsin	Yaşam Teknolojileri	15050
Soya fasulyesi tripsin inhibitörü	BD Bioscience	5425
Matrigel	BD Biyobilim	354234
Qtracker 655 Hücre Etiketleme Kiti	Yaşam Teknolojileri	Q25021
CellLight Plazma Membranı-RFP, BacMam 2.0	Yaşam Teknolojileri	C10608
Biyotinile İzolektin B4 antikoru	Sigma	L2140
Anti-Von Willebrand faktörü	Sigma	F3520
Anti-CD31/PECAM-1	BD Pharmingen	550274
DAPI Vektör Laboratuvarları ile VECTASHIELD Sert Montaj Ortamı		H-1500
Ketamin	Butler Schein Hayvan Sağlığı Temini	44028
Ksilazin	Lloyd Laboratuvarları	1009
Stereomikroskop	Motic	SMZ-168
Hemositometre	Fisher Scientific	267110
Ters mikroskop	Olympus CK-40	CK-40
Floresan mikroskop	Olympus FSX-100	FSX-100
İnce forseps	Roboz Cerrahi Alet	7 inox
İnce mikro uçlu makas	Roboz Cerrahi Alet	RS5611

içerirBD