Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Floresan

23.8K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/51030

⸱

24 Şubat 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Entomology, Volcani Center, 2Institute of Plant Sciences and Genetics in Agriculture, Robert H. Smith Faculty of Agriculture, Food and Environment, Hebrew University of Jerusalem, 3Department of Applied Sciences, Institute for Adriatic Crops and Karst Reclamation, 4The Institute of Plant Sciences, Volcani Center

Bu makalede

Özet

Biz, böcek ve bitki dokularında virüs ve bakterilerin lokalizasyonu için burada in situ hibridizasyon, basit bir floresan (FISH) yöntemi tarif eder. Bu protokol bütün montaj mRNA görselleştirme ve mikroskopik bölümleri için uzatılabilir.

Özet

In situ hibridizasyon (FISH) floresan yaygın ökaryotik hücrelerde gen transkript görselleştirme ve bundan başka, virüs ve bakteri enfeksiyonu gibi hücreye diğer bileşenleri görselleştirmek için modifiye edilebilir için kullanılan çeşitli teknikler verilen bir isimdir. Mekansal yerelleştirme ve enfeksiyon sırasında virüs ve bakterilerin görselleştirme farklı uyaranlara tepki olarak böyle mikroarray'ler ve RNAseq olarak ifade profilleme deneyler tamamlayan önemli bir adımdır. Bu maddelerle zamanmekansal enfeksiyonları anlama hücresel bileşenler ile etkileşimi anlamaya yönelik biyolojik deneyler tamamlar. Bu tür raportör gen sistemleri veya immünohistokimyasal yöntemler gibi virüs ve bakterileri görselleştirmek için çeşitli teknikler zaman alıcıdır ve bazı model organizmalar ile çalışmak ve karmaşık yöntemler dahil sınırlıdır. Hücreye RNA ya da DNA türleri hedef FISH nispeten kolay ve hızlı bir benimgenlerin zamanmekansal lokalizasyonu eğitim ve tanı amaçlı ThOD. Bu yöntem sağlam ve protokolleri pahalı değil kısa hibritlenmesini, ticari olarak satın sondalar, istihdam zaman uygulanması nispeten kolay olabilir. Örnek hazırlama, tespit, melezleme ve mikroskopik görüntüleme karmaşık adımlar içermeyen bu özellikle sağlamdır. Burada böcek ve bitki dokularında bakteri ve virüslerin lokalizasyonu için bir protokol açıklar. Bu yöntem, 5 'ya da 3' floresan boyalar konjüge kısa DNA probları uçları 20 baz çifti ile basit bir hazırlama, tespit ve böcek bütün bağlar ve kesilen organlarda veya el yapımı bitki bölümlerinin hibridizasyona dayanır. Bu protokol, başarılı bir şekilde böcek ve bitki dokularının, bir dizi tatbik edilmiştir ve hücrede mRNA veya başka RNA veya DNA türleri ifadesini analiz etmek için kullanılabilir.

Giriş

Onların hastalıklı bitki barındıran bitki virüs ve diğer patojenleri arasındaki etkileşimleri inceleyerek, bu onların bilgisayarlar üzerinde olumsuz etkilere neden bakılmaksızın, in situ patojenleri ve kendi nükleik asitleri görselleştirmek için önemlidir. Bitki hücreleri içinde ve arasında patojen hareketini incelemek bu çok önemlidir. Patojenin gen ürünlerinin yerinde Yerleştirmede patojenite sürecini incelemek için diğer yaklaşımları tamamlamaktadır önemli bir adımdır. Birçok bitki patojenleri, özellikle virüsler, kendi vektörleri ile karmaşık ve samimi etkileşimleri olan, böcekler tarafından iletilir. Kendi vektörlerde bu virüslerin lokalizasyonu iletim yolunu incelemek için önemlidir ve vektör içinde olası etkileşim siteleri. Bazı böcek-vectored bitki virüsleri iletim bu böceklerin içinde ikamet endosimbiyotik bakteriler tarafından destekli. Iyi bu bitki virüsleri b iletim incelemek içinbunların vektörleri, genel olarak endosimbiyotik bakteriler görsel ve özellikle virüs aktarımı dahil olanlar, için de gereklidir y. Virüs ve endosimbiyotik bakteriler yardımcı sınırlama böylece böcek ev sahibi olan bu organizmalar arasındaki olası ilişkileri araştırmak için arzu edilir. Kenara virüs iletim, endosimbiyotik bakteri böcek vektörlerin biyolojinin çeşitli yönlerini etkileyen, böceklere olan bu bakterilerin, böylece mekansal lokalizasyonu yüksek ilgi ve önem taşımaktadır.

Domates sarı yaprak kıvrılma virüsü (TYLCV) (Begomovirüs, Geminiviridae), tüm dünyada yetiştirilen 1-4 domates en önemli viral bir hastalıktır karmaşıktır. TYLCV floem sınırlı bir virüs olduğunu ve sadece beyaz sinek Bemisia tabaci 5,6 ile vectored edilir. Onların beyaz sinek vektörlerinde begomovirüslerinden translokasyon açıklayan bir model 6-9 önerilmiştir. İki özel bariyerler aktif dur kesilmişlerdirmidgut / hemolenfi ve hemolenfi / tükürük bezi bariyerler: Bu circulative iletimini ing. Bu iletim işlemi virüs kapsidine kabul bilinmeyen alıcıları tarafından aracılık ettiği varsayılmaktadır. TYLCV B. çapraz düşünülmektedir Bu bitki içine enjekte edilmeden önce orta bağırsak tabaci 6,10 ve birincil salya bezi 6 boyunca emilir. Beyaz sinek hemolimf ise, TYLCV böcek ikinci endosimbiyotik Hamiltonella bakteri tarafından üretilen bir proteinin GroEL ile etkileşime girer. Bu etkileşim hemolimfteki TYLCV güvenli taşıma sağlayan ve böcek bağışıklık sistemi 11. Hamiltonella ve Portiera birincil endosymbiont tarafından saldırılara karşı korur beyaz sinek, bacteriocytes yerleştirilmiştir, hemolenfi ve ev endosimbiyotik bakteriler 11. B. bulunan böcek hücreleri tabaci Rickettsia'lara, Arsenophonus, Wolbachia ve Fritsch gibi ek endosimbiyotik bakteri barındırırbacteriocytes içinde veya dışında lokalize edilebilir ve adet, böceğin biyolojisi 12 farklı etkileri vardır.

Çeşitli raporlar mikroskobik kalın bölümünde 10,13 üzerinde yerinde böyle Transmisyon Elektron Mikroskobu (TEM), antikorlar ve RNA gibi zaman alıcı ve masraflı protokolleri kullanarak bitki ve limonluk içinde TYLCV yerelleştirme çalışması için çalıştılar, yeni bir çalışma lokalizasyonu tarif basit bir protokol 14 ile kendi tesis ve vektör konak içindeki bitki virüsleri. Burada B. TYLCV lokalizasyonu için basit bir protokol açıklar tabaci midguts ve tükürük bezleri disseke ve bölümlerde TYLCV-enfekte bitkilerden hazırladı. Biz daha Portiera, B. birincil endosymbiont lokalizasyonunu tarif tabaci ve ikincil endosimbiyontlar Hamitonella, Rickettsia ve Arsenophonus. Bu protokol, kısa DNA sondaları kullanılarak dayalı olduğunufloresan, 5 'ucunda etiketlenmiştir ve özellikle viral ya da bakteriyel gen dizilerinde tamamlayıcı dizilere hibridize edilir. Numune işleme nispeten kolaydır ve elde edilen sinyal çok özeldir. Açıklanan protokol, bunların bitki, hayvan ve böcek ana virüs, bakteri ve diğer patojenleri lokalize etmek için kullanılabilir ve ayrıca herhangi bir dokuda mRNA lokalize etmek için de kullanılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1.. FISH Analizi Genel Sinek, Bitki ve Virüs Hazırlıklar

  1. Arka B ve Q biyotipindeki pamuk fidelerinin (Gossypium hirsutum L. cv. Acala) üzerinde sinekler ve 25 ± 2 ° C,% 60 bağıl nem standart koşullar altında böcek geçirmez kafesleri ve büyüme odaların içinde korumak, ve 14 saat ışık / 10 saat karanlık fotoperiyot.
  2. Daha önce tarif edildiği gibi 15-19 endosymbiont-özgü primerler kullanılarak endosimbiyont ile enfeksiyonu test etmek için PCR yapın.
  3. Ticari bir kreş veya bitki domates tohumları Domates fideleri (Solanum esculentum cv. Beefsteak) satın alın.
  4. Bitkiler TYLCV 15 beyazsineği-aracılı aşılama için en uygun yaş (bölüm 4.1 'e bakınız), dört gerçek yaprak aşamasına gelinceye kadar, yukarıda açıklanan aynı yetiştirme koşullarında koruyun.

2. Endo için böcek Taşıma, Fixation, Probe Tasarım, Hibritleşme ve Görselleştirmesymbiont BALIK

  1. Pamuk bitkilerinden aspirasyonu ile 10 yetişkin sinekleri toplayın, ya da pamuk yaprakları 10 3 üncü veya 4. evre perileri almak.
  2. Hemen Eppendorf tüpleri içine Carnoy fiksatif (kloroform-etanol buzlu asetik asit, 06:03:01, hac / hac) içinde bırakın. (Tercihen bir gece) gece 2 saat için düzelt.
  3. Tamamen fiksatif çıkarın ve 2 saat boyunca, etanol içinde% 6 H 2 O 2'de renginin.
  4. Oda sıcaklığında birkaç gün ila birkaç hafta boyunca mutlak etanol içinde örnekleri korumak, veya bir sonraki adıma geçin.
  5. Design probları, her bir bakterinin, 16S ribozomal RNA genlerinin göre tamamlayıcı DNA, ters primerler. Sondalar tasarımı için, hesaba PCR primerleri tasarımı için aynı düşünceler almak. Oligonükleotid probları kullanarak BTP1 5'-Cy5-TGTCAGTGTCAGCCCAGAAG-3 ', 5'-Cy3 Rb1-TCCACGTCGCCGTCTTGC-3', 5'-Cy3 BTH-CCAGATTCCCAGACTTTACTCA-3 've 5'-Cy3 Ars2-TCATGACCACAACCTCCAAA-3 'sırasıyla Portiera, Rickettsia, Hamilonella ve Arsenophonus, spesifik hedefleme için.
  6. , Ml başına hibridizasyon tamponu içinde karanlıkta gece boyunca melezleşme numuneleri (20 mM Tris-HCI, pH 8.0, 0.9 M NaCl,% 0.01 [ağr / hac], sodyum dodesil sülfat,% 30 [hacim / hacim] formamid) 10 pmol içeren floresan probe . Gerektiğinde farklı floresan boyalar ile birden fazla probun birleştirin. Hedeflenen bakteri ve hiçbir prob örneklerinin negatif kontroller ile enfekte olmayan whiteflies kullanın.
  7. Bir sıvı engelleyicisi ile yer hibridizasyon tamponu içinde, bir mikroskop lamı üzerine, bütün numunelerin bir kapak monte kayma ile kapak, bir floresan veya konfokal mikroskop altında oje ve görünümü ile sağlanır.

3. Beyazsineği Organ Diseksiyon, Fixation, Hibritleşme ve TYLCV FISH için Görselleştirme

  1. Sürekli aspirasyon ve ane tarafından TYLCV enfekte domates bitkileri yetiştirilen yetişkin sinekleri toplayınaseton ile emprenye kağıt havlu maruz bırakılarak sthetize. Aseton çok uzun pozlama whiteflies dokuları çözebilirsiniz gibi sadece 1-2 dakika whiteflies Açığa. Ibridazyonunu onaylamak için enfekte olmayan domates bitkileri ve denetimler için hiçbir prob örnekler üzerinde yetiştirilen nonviruliferous whiteflies kullanın.
  2. Depresyon mikroskop Mount whiteflies stereo mikroskop kullanarak organı diseksiyon için kayar.
  3. Prothorax gelen böcek başını çekmeye ve 1x PBS içinde tükürük bezlerini incelemek nedeniyle küçük boyutu, daha iyi görüntülenmesi için% 1 toluidin mavisi boyası ile desteklenmiş. 2-3 dakika boyunca, lekenin emme izin verir.
  4. Göğüs ve gözlemlemek ve midgut dışarı çıkarmak için karın arasındaki noktada ayrı böcek çekin. Karın ucunda forseps ile iterek karın içeriğini kovun.
  5. Yavaşça başarılı kesitlerden PBS ve toluidin mavisi çıkarın ve yavaşça 5 dakika boyunca organlarını düzeltmek için Carnoy fiksatifi 300 ul ekleyin.
  6. Akesilen organlarda kontrolsüz hareketini önlemek üzere depresif kuyunun bir taraftan olup üstten fiksatif dd. Bir kez fiksatif dokunmadan, organları cama yapışacak ve süreç boyunca onlar hareket etmez.
  7. Fiksatif çıkarın ve TYLCV kat protein geninde bir diziye tamamlayıcı olan floresan DNA probu Cy5-5'-GGAACATCAGGGCTTCGATA-3 ', 10 pmol ile takviye edilmiş hibritleme tampon 500 ul ekleyin.
  8. Altındaki ıslak havlu kağıt ile birlikte küçük bir plastik kutu içinde oluşan küçük bir nemli odası içinde örnek ile inkübe edilmesi slayt ile karanlıkta, oda sıcaklığında gece boyunca hibridize olur.
  9. Hibridizasyon sonra, ince bir diseksiyon aleti ile organları almak ve hızla DAPI (1 x PBS içinde 0.1 mg / ml) ile takviye edilmiş ve sıvı engelleyicisi ile içerdiği yeni hibridizasyon tamponu 30 ul ihtiva eden taze bir mikroskop lamı taşıyın.
  10. Bir kapak kayma örnekleri örtün, zekâ mühürBir floresan veya konfokal mikroskop altında h oje ve görünümü.

4. Bitki Taşıma, TYLCV FISH için El-kesit, Fiksasyon ve Hibritleşme

  1. Virüliferöz beyaz sinek aracılı aşılama kullanılarak TYLCV olan domates fideleri inoküle. Virüs symptomless bitkilerde bu FISH yöntemi aşılamadan bir hafta sonra kullanılarak tespit edilebilir. Tipik hastalık belirtileri görülebilir üç hafta sonrası aşılama vardır. Belirli bir hibridizasyon teyit etmek için kontrol enfekte olmamış domates bitkileri ve prob örnekleri kullanın.
  2. Domates el kesme 2-4 cm uzun boyuna veya enine kesitler hazırlamak için keskin bir histolojik jilet kullanın sapları ve yaprakları.
  3. Eppendorf tüpleri içinde, 2 saat için oda sıcaklığında gece boyunca Carnoy sabitleyici olarak bölümleri düzeltin.
  4. Fiksatif çıkarın ve oda sıcaklığında birkaç gün ila birkaç hafta boyunca mutlak etanol içinde muhafaza bölümleri, ya da bir sonraki adıma geçin.
  5. Bölümleri yıkayınHibridizasyon tamponu ile üç kez, her biri 1 dakika.
  6. TYLCV kılıf proteini genine bir diziye tamamlayıcı olan oligonükleotid prob, floresan Cy3-5'-GGAACATCAGGGCTTCGATA-3 '10 pmol ile takviye edilmiş hibritleme tampon 500 ul bölümleri hibridize.
  7. Melezleme tamponu, bölümleri üç kez, her biri 1 dakika yıkayın.
  8. DAPI (1x PBS içinde 0.1 mg / ml) ile takviye edilmiş ve sıvı engelleyicisi ile yer hibridizasyon tamponu içinde bütün montaj bölümleri, bir floresan veya konfokal mikroskop altında oje ve görünümü ile mühür, bir lamel ile kapsamaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu yazıda incelenen sistem Şekil 1 'de gösterilen ve TYLCV ile enfekte olmuş bir bitki, bir yetişkin beyaz sinek ve B'nin bir peri içerir tabaci ve böcek TYLCV translokasyon için yol gösteren beyaz sinek iç anatomisi. 2. birincil simbiyonudur Portiera ve ikincil simbiyonudur için bir yetişkin beyaz sineğe çift BALIK göstermektedir Arsenophonus. Şekil 3. Portiera ve Hamiltonella için çift BALI...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Aynı zamanda bitki ve böcek ev sahibi vektör bir bitki virüsünün lokalizasyonu ve onların özel sineği konukçuda endosimbiyotik bakteriler için burada açıklanan protokol, bitki ve hatta hayvan dokularında diğer virüslerin lokalizasyonu için uyarlanabilir. Ayrıca, protokol endosimbiyotik ve patojenik bakteri ve bitki ve hayvan sistemlerinin diğer mikroorganizmaları lokalize etmek için de kullanılabilir. Tarif edilen yöntemler, kısa, flüoresan-işaretli oligonükleotid DNA prob ve hücredeki hedef DNA ya da RNA molekülü arası...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

Ghanim laboratuarda araştırma hiçbir araştırma bursu ile desteklenmiştir. Alman-İsrail Vakfı (GIF) dan 908-42.12/2006, hiçbir hibe. IS-4062-07 Amerika Birleşik Devletleri-İsrail Binational Tarımsal Araştırma ve Geliştirme Fonu (Bard), ve araştırma hibe hayır dan. MG İsrail Bilim Vakfı (ISF) için 884/07

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Floresan etiketli  ProblarMetabion20 bp HPLC saflaştırılmışDizi müşteri tarafından tasarlandı
Toluidin mavisiSigma-Aldrich89640
Sodyum Dodesil SülfatSigma-AldrichL3771Moleküler Biyoloji Sınıfı
FormamidSigma-AldrichF9037Moleküler Biyoloji Sınıfı
Tris-HClSigma-AldrichT5941Moleküler Biyoloji Sınıfı
Buzul Asetik AsitSigma-Aldrich320099Moleküler Biyoloji Sınıfı
Sıvı EngelleyiciTed Pella, Inc.22309

Kaynaklar

  1. Czosnek, H., Laterrot, H. A worldwide survey of Tomato yellow leaf curl viruses. Arch. Virol. 142, 1391-1406 (1997).
  2. Ling, K. S., Simmons, A. M., Hassell, R. L., Keinath, A. P., Polston, J. E. First report of Tomato Yellow Leaf Curl Virus in South Carolina. Plant Dis. 90, 379 (2006).
  3. Polston, J. E., McGovern, R. J., Brown, L. G. Introduction of Tomato yellow leaf curl virus in Florida and implications for the spread of this and other geminiviruses of tomato. Plant Dis. 83, 984-988 (1999).
  4. Polston, J. E., Rosebrock, T. R., Sherwood, T., Creswell, T., Shoemaker, P. J. Appearance of Tomato yellow leaf curl virus in North Carolina. Plant Dis. 86, 73 (2002).
  5. Frohlich, D. R., Torres-Jerez, I., Bedford, I. D., Markham, P. G., Brown, J. K. A phylogeographical analysis of the Bemisia tabaci species complex based on mitochondrial DNA markers. Mol. Ecol. 8, 1683-1691 (2002).
  6. Ghanim, M., Morin, S., Czosnek, H. Rate of Tomato yellow leaf curl virus translocation in the circulative transmission pathway of its vector, the whitefly Bemisia tabaci. Phytopathology. 91, 188-196 (2001).
  7. Ghanim, M., Rosell, R. C., Campbell, L. R., Czosnek, H., Brown, J. K., Ullman, D. E. Digestive salivary and reproductive organs of Bemisia tabaci (Gennadius) Hemiptera: Aleyrodidae) B type. J. Morphol. 248, 22-40 (2001).
  8. Hunter, W. B., Hiebert, E., Webb, S. E., Tsai, J. K., Polston, J. E. Location of geminiviruses in the whitefly Bemisia tabaci (Homoptera: Aleyrodidae). Plant Dis. 82, 1147-1151 (1998).
  9. Rosell, R. C., Torres-Jerez, I., Brown, J. K. Temporal pathway of geminivirus in whitefly extracts, saliva, hemolymph and honeydew. Phytopathology. 89, 239-246 (1999).
  10. Czosnek, H., Ghanim, M., Ghanim, M. The circulative pathway of begomoviruses in the whitefly vector Bemisia tabaci—insights from studies with Tomato yellow leaf curl virus. Ann. Appl. Biol. 140, 215-231 (2002).
  11. Gottlieb, Y., et al. The transmission efficiency of Tomato yellow leaf curl virusby the whitefly Bemisiatabaciis correlated with the presence of aspecificsymbiotic bacterium species. J. Virol. 84, 9310-9317 (2010).
  12. Brumin, M., Levy, M., Ghanim, M. Transovarial transmission of Rickettsia spp. and organ-specific infection of the whitefly Bemisia tabaci. Appl. Environ. Microbiol. 78, 5565-5574 (2012).
  13. Ghanim, M., Medina, V. Localization of Tomato yellow leaf curl virus in its whitefly vector Bemisia tabaci. In Tomato Yellow Leaf Curl Virus Disease, Management, Molecular Biology, Breeding for Resistance. Czosnek, H. , Springer. New York. 175-187 (2007).
  14. Ghanim, M., Brumin, M., Popovski, S. A simple, rapid and inexpensive method for localization of Tomato yellow leaf curl virus and Potato leafroll virus in plant and insect vectors. J. Virol. Methods. 159, 311-314 (2009).
  15. Gotz, M., et al. Implication of Bemisia tabaci heat shock protein 70 in Begomovirus-whitefly interactions. J. Virol. 86, 13241-13252 (2012).
  16. Nirgianaki, A., et al. Wolbachia infections of the whitefly Bemisia tabaci. Curr. Microbiol. 47, 93-101 (2003).
  17. Baumann, P. Biology of bacteriocyte-associated endosymbionts of plant sap-sucking insects. Ann. Rev. Microbiol. 59, 155-189 (2005).
  18. Gottlieb, Y., et al. Identification and localization of a Rickettsia sp. in Bemisia tabaci (Homoptera) Aleyrodidae). App. Environ. Microbiol. 72, 3646-3652 (2006).
  19. Li, Z. X., Lin, H. Z., Guo, X. P. Prevalence of Wolbachia infection in Bemisia tabaci. Curr. Microbiol. 54, 467-471 (2007).
  20. Skaljac, M., Zanic, K., Hrncic, S., Radonjic, S., Perovic, T., Ghanim, M. Diversity and localization of bacterial symbionts in three whitefly species (Hemiptera: Aleyrodidae) from the east coast of the Adriatic. Bull. Entomol. Res. 103, 48-59 (2013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Floresan n Situ HibridizasyonFISH ProtokolVir s LokalizasyonuBakteri TespitiBitki Dokusu AnaliziB cek Dokusu AnaliziDNA ProblarRNA TespitiMikroskobik G r nt lemeNumune Haz rlama
Floresan
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.