Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Fare intralenfatik immünoterapi ve Aşılama

22.9K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/51031

⸱

2 Şubat 2014

 , 
1Department of Dermatology, University Hospital Zurich

Bu makalede

Özet

Profilaktik ve terapötik aşılama çoğu zaman düğümleri ve bağışıklık hücrelerinin dolayısıyla kötü katılımını lenf nedeniyle aşının hafta drenaj güçlü bağışıklık tepkilerini uyarmak için başarısız olur. Lenf düğümlerine aşı doğrudan enjeksiyon ile, sözde lenf sistemi içi enjeksiyon, aşı etkinliği güçlü geliştirilebilir ve aşı doz azaltılabilir.

Özet

Aşılar genellikle bağışıklık yanıtlarının uyarılması için deri altından ya da kas içinden enjekte edilir. Bu başarısı, antijen sağlayan hücreler, aranan bağışıklık yanıtlarının oluşturulması için lenfositleri ile etkileşim lenf düğümlerine aşının etkili bir drenaj gerektirir. Gücü ve kaynaklı bağışıklık tepkilerinin türü de yoğunluğu veya frekans etkileşimlerin hem de mikro-, sitokinlerin, özellikle içeriğine bağlıdır. Çevresel olarak enjekte edilen aşı sadece küçük bir kısmını, lenf düğümleri ulaştığında, fareler ve insanlarda aşı kasık lenf düğümleri, örneğin lenf sistemi içi enjeksiyonu içine aşı direkt enjeksiyonu ile yapılmıştır. İnsanlarda, prosedür ultrason tarafından yönlendirilmektedir. Farelerde, bir küçük (5-10 mm) bir kesik, lenf düğümü ve lokalize forseps ile hareketsiz hale anestezi uygulanmış hayvanların kasık bölgesinde yapılır ve aşı 10-20 ul'lik bir hacim görsel kontrol altında enjekte edilir.Kesik, cerrahi dikiş kullanarak tek bir dikiş ile kapatılmıştır. Fareler plasmid DNA, RNA, peptid, protein, parçacıklar ve bakteriler gibi yardımcı maddeler ile aşılandı ve aşıların her tür karşı bağışıklık karşılıklarının güçlü bir iyileşme gözlendi. Aşılama intralenfatik yöntem, geleneksel aşı yetersiz bağışıklık veya Müsait aşı miktarı sınırlıdır üreten durumlarda özellikle uygundur.

Giriş

Aşılar genellikle bağışıklık yanıtlarının uyarılması için deri altından ya da kas içinden enjekte edilir. Bu prosedürün başarısı, antijen sunan hücreler, T-ve B-hücresi tepkilerinin üretilmesi için lenfositleri ile etkileşim lenf düğümlerine aşının etkili bir drenaj gerektirir. Buna ek olarak, dayanıklılık ve kaynaklı bağışıklık tepkilerinin türü de yoğunluğu ya da frekans gibi etkileşimlerin hem de mikro kendisi, sitokinlerin, özellikle içeriğine bağlıdır. Çevresel bir doku içine enjekte edilen bir aşının sadece küçük bir kısmı, bir lenf düğümü ulaştığında, lenf düğümleri içine aşı direkt enjeksiyonu ile farelerde ve insanlarda ve aşılar, site bağışıklık cevapları oluşturulur edildi gerçekleştirilmiştir. İnsanlarda, prosedür ultrason da lenfatik sistem görselleştirme ve teşhis için görüntüleme maddeleri uygulanması için kullanılan bir prosedür ile yönlendirilir. Farelerde, prosedür invaziv. Burada, bir küçük (5-10 mm) incision, anestezi uygulanmış hayvanlar 1'in kasık bölgesinde yapılır, lenf düğümü ve lokalize forseps ile hareketsiz ve aşı 10-20 ul'lik bir hacim görsel kontrol altında enjekte edilir, 10 ul ilk enjeksiyon için kullanılır ve genç farelerde küçük lenf düğümleri ile, oysa 20 ul büyük lenf düğümleri lenf düğümleri daha büyük ya da zaten farede, enjekte edilebilir. İnsizyon edilebilir cerrahi dikişle, bir tek dikiş ile kapatılabilir. Bu yöntem ile, farenin plazmid DNA 2,3, haberci RNA 4, 1,3,5,6 peptid, protein, 7-10, 11, parçacıklar, bakteriler 12 hem de 7,13 ilave maddeler ve bağışıklık güçlü iyileşme ile aşılanmış olan aşıların her tür karşı tepkiler gözlenmiştir. Aşılama intralenfatik yöntemi geleneksel aşılama yetersiz bağışıklık üreten veya mevcut aşının miktarı sınırlı ya da ver olduğu durumlarda özellikle uygundurpahalı y. İnsanda, lenf sistemi içi aşılama yöntemi, alerji hastalara 14,15 ya da kanserli 16-21 olan hastalara uygulanmıştır. Mevcut kavramı intralenfatik yöntem, kas içi ve deri altı enjeksiyonlar gibi diğer enjekte edilebilir yöntemlere göre daha invaziv olmasıdır, ancak ağrı algısı, damar delinerek 15 sonra daha yüksek değildir. Bu lenf sistemi içi aşı koruyucu ve tedavi edici aşıların, özellikle diğer yöntemlere bir alternatif veya tamamlayıcı olacağı beklenmektedir. Bu makalede, lenf sistemi içi aşılama prosedürü farelerde gerçekleştirilir kadar ayrıntılı olarak açıklanmaktadır. Açıklanan tüm prosedürler, Zürih Kantonu Veterinerlik Kurumu tarafından onaylanan ve İsviçre federal kuralları ve bilimsel amaçlar için kullanılan hayvanların korunması ile ilgili direktifleri göre yapılmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1.. Farelerin Anestezi

  1. Tamponlu tuz çözeltisi içinde ketamin (dissosiyatif anestezi) ve ksilazini (sedatif ve analjezik) karıştırılarak anestezik hazırlayın. Nihai çözelti içinde ketamin ve ksilazin konsantrasyonları sırasıyla 12,5 ve 2 mg / ml 'dir.
  2. 25-30 G iğnesi olan bir şırınga kullanılarak intraperitonal uygulama ile farelere anestezi enjekte edilir. Vücut ağırlığının 0.1 ml/10 g kullanın.
  3. Kornea kurutulması Çıkış önlemek için farenin gözlerindeki bir oftalmik merhem uygulayın.
  4. Fare yeterince forseps ile ayak veya ayak kısma anestezi sağlamalıdır. Fare tutam refleksleri ile tepki vermezse, cerrahi geçin. Fare refleksleri veya kas kasılmaları ile tutam tepki varsa, 1-2 dakika bekleyin ve tutam testi tekrarlayın. Fare hala tepki vermiyorsa, bir yeni hayvan ile fare değiştirin ve sonrası adım 1.2 'den işlemleri tekrarlayın.

2. Cerrahi IMouse Kasık Alanı ncision

  1. Sırtında fare yerleştirin.
  2. Dezenfeksiyon etanol (% 70) ile bir inguinal bölge ıslatın. Daha iyi dezenfeksiyon sağlamak için, inguinal bölge etanol ile kürk önce dezenfeksiyon kaldırmak için traş olabilir.
  3. Arka bacak alın ve kalça ekleminin yaklaşık 90 ° açı üretmek için kalça eklemi bükün.
  4. Kavisli bir Microdissecting forseps kullanarak, kalça eklem bükülmüş kasık bölgesinde fare deri alıp hafifçe ıslatılmış cildi yukarı çekin.
  5. Forseps ile cilt kadar tutarken, cerrahi makas kullanılarak deri yoluyla küçük bir kesi (<5 mm) kesti.
  6. Kesi içine kapalı makas ucu yerleştirin ve daha fazla ensizyon içine tutarken makas açarak kesi açın. Bu, gözyaşı ve en az 10 mm'lik bir çapa üretmelidir cilt neden olur. Not: esnek ışık kılavuzları ile bir soğuk ışık kaynağı görünürlüğünü artırmak için kullanılabilir. Eski yılındafareler, özellikle erkek, lenf düğümü kimlik nedeniyle kasık bölgesinde fazla yağ dokusu zor olabilir.

3. Intralenfatik Enjeksiyon

  1. Bir 28-30 G derialtı iğne ile bir şırınga (0.5 ml veya daha az) hazırlayın; kısa konik uzun eğimin tercih edilebilir. Aşının aspire 10 ul enjekte ve şırınga serbest hava olduğunu garanti edilecek.
  2. Kavisli bir forseps yardımı ve kapalı makas ucu ile kasık lenf düğümü yerelleştirilmesine. Lenf düğümü daha beyazımsı yağ dokusu içindeki grimsi görünür ve daha fazla giriş ve lenf düğümü terk afferent ve efferent kılcal ile tespit edilebilir.
  3. Kavisli bir forseps dalları arasında tutarak lenf düğümü hareketsiz.
  4. Şırınga alın ve yukarı bakacak Eğim ile lenf düğümüne iğneyi, bütün konik lenf düğümü girer emin.
  5. Aşısı (10 ul) enjekte edilir. Eğer lenf node (üfleme) şişme, enjeksiyon başarılı kabul edilebilir. Iğne lenf düğümüne derinliklerine yeterince yer değilse, bazı veya tüm aşı dışarı sızıntı ve lenf düğümü giremezsiniz. İğne çok derin yerleştirildiğinde ise, deri altından enjekte edilen aşı, lenf düğümü, aşağıda açıklanacak. Ikinci durumunda, tekrar enjeksiyon ya da yeni bir tedavi edilmemiş fare ile fare değiştirin.

4. Dikiş ile kesi Kapanış

  1. Steril cerrahi sütür bir paket açın.
  2. Iğne gövdesinin distal kısmında bir iğne tutucusu ile dikiş iğnesi tutunuz. İlk mandal yakalar kadar sıkarak iğne tutucu sıkın.
  3. (Un dişli veya dişli forseps veya deri kanca kullanılabilir cerrahın tercihine bağlı olarak) forseps kullanılarak kesi bir tarafında deri tutunuz. İğne ca yerleştirin. 2-3 mm kesi kenarından, derinin dış giren.
  4. Loosforseps ile cilt beklemeye tr ve forseps ile kesi karşı tarafını kavrayın. İğne ca yerleştirin. 2-3 mm kesi kenarından, deri içine giren.
  5. İğne tutucu gevşetmek ve forseps ile iğne ucu kavramak. Birkaç farenin tedavi edilecek ise, daha kısa bir uç bırakmak (birinci iğne ekleme noktası dışında taban yüzünün uygun bir uzunluğu bırakarak deri yoluyla profili olan iğne çekin, 5-10 farenin bir dikiş iğnesi ile çalıştırılabilir /) yürümek.
  6. Standart cerrah protokollere göre tercih edilen düğüm yapın. Kesi 10 mm daha büyük değilse, tek dikiş yeterlidir. Daha büyük kesiler için, ikinci bir dikiş yapmak.

5. Post-operasyonel Tedavi

  1. Kafeste fare yerleştirin ve sıcak tutmak için dokuları ile kaplayın. Birden fareler tedavi ederken, sıcak tutmak için birbirine yakın onları yerleştirin. Onlar uyandı kadar alternatif, bir sıcak ped fareler yerleştirinkadar.
  2. Onlar uyanmak kadar fareler gözlemleyin.
  3. Iyileşme yanı sıra yara enfeksiyonları gibi diğer klinik belirtiler yara ile ilgili olarak günlük fareler dikkate alınmalıdır. Yara genellikle yeterince iki gün içinde kapalı ve prosedürün yedi gün içinde iyileşti.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Farelerde intralenfatik enjeksiyon prosedürü, cerrahi doğasına rağmen, yalındır ve nispeten hızlı. Eğitimli bir kişi 3-4 dakika içinde işlemi gerçekleştirebilirsiniz. Bir dikiş ile kapatılmıştır kesik tipik haliyle iki gün içinde iyileştirir (Şekil 1)

Lenf içine aşı veya aşı mRNA ile gerçekleştirilmiştir, plazmid DNA, peptidler, proteinler, virüs ve bakteri. 2 protein fosfolipaz A2 (PLA2), ana alerjen arı zehiri ile immünizasyondan sonra antikor üretimini gö...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Lenf içine aşılama ve immünoterapi antikor karşılıkları ve T-hücresi tepkilerinin her ikisinin stimülasyonu için uygun olduğu gösterilmiştir. Bu video-makale de gösterildiği gibi, aşı intralenfatik prosedür farelerde güçlü bir immün yanıtları stimüle etmek için hızlı ve kolay bir yöntemdir. Eğitimli bir cerrah 3-4 dakika boyunca yordamı gerçekleştirebilir. Oturumda ayrıca bir genellikle anestezi ve dikiş atılmasını yapıyor ve ikinci cerrah kesi ve enjeksiyon yapıyor, iki cerrahlar arasında paylaşılabilir. Prosedürün etk...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

TMK adam intralenfatik immünoterapi ile ilgili patent mucidi olarak adlandırılır. TMK bilimsel danışmanı olmuştur ve ImVisioN GmbH, Cytos Biyoteknoloji, MannKind Corporation ve XBiotech USA Inc PJ ifşa hiçbir çatışma ilgi seyahat masraflarını aldı.

Teşekkürler

Yazarlar Iris Erdmann'a, Barbara von Beust ve Julia Maria Martínez-Gómez farelerde intralenfatik bağışıklama yöntemini gelişmekte deneysel yardım için minnettarız. Bize bu video üretimi için kendi cerrahi tiyatro bildirdiğiniz için de Maggy Arras ve Nikola Cesarovic teşekkürler.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Ketamin (Ketasol-100)Graeub AG, İsviçreAnestezikler
Ksilazin (Rompun)Bayer, AlmanyaAnestezikler
Viscotears Göz JeliNovartis, İsviçreAnestezi sırasında gözlerin kurumasını önlemek için.
BD Micro-Fine 0.5 mlBD Medikal, Fransa29 G Kalıcı olarak takılan iğneli insülin şırıngaları
6-0 Dermalon Monofilament NaylonCovidien, MA, ABDSütürler için (0.7 metrik, 18 G, 45 cm, Mavi)
Kavisli forseps, 4.5 inPolymed, İsviçreLenf nodunun kesilmesi ve tutulması için
Düz cerrahi makas, 4.5Polymed, İsviçreİnsizyon
için İğne tutucu, 5.5Polymed, İsviçre'deİnsizyonu dikişle kapatmak için

Kaynaklar

  1. Johansen, P., et al. Direct intralymphatic injection of peptide vaccines enhances immunogenicity. Eur. J. Immunol. 35, 568-574 (2005).
  2. Maloy, K. J., et al. Intralymphatic immunization enhances DNA vaccination. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 3299-3303 (2001).
  3. Smith, K. A., et al. Enhancing DNA vaccination by sequential injection of lymph nodes with plasmid vectors and peptides. Vaccine. 27, 2603-2615 (2009).
  4. Kreiter, S., et al. Intranodal vaccination with naked antigen-encoding RNA elicits potent prophylactic and therapeutic antitumoral immunity. Cancer Res. 70, 9031-9040 (2010).
  5. Johansen, P., et al. Antigen kinetics determines immune reactivity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5189-5194 (2008).
  6. Smith, K. A., et al. Lymph node-targeted immunotherapy mediates potent immunity resulting in regression of isolated or metastatic human papillomavirus-transformed tumors. Clin. Cancer Res. 15, 6167-6176 (2009).
  7. Johansen, P., et al. Toll-like receptor ligands as adjuvants in allergen-specific immunotherapy. Clin. Exp. Allergy. 35, 1591-1598 (2005).
  8. Johansen, P., et al. Heat denaturation, a simple method to improve the immunotherapeutic potential of allergens. Eur. J. Immunol. 35, 3591-3598 (2005).
  9. Martinez-Gomez, J. M., et al. Intralymphatic injections as a new administration route for allergen-specific immunotherapy. Int. Arch. Allergy Immunol. 150, 59-65 (2009).
  10. Martinez-Gomez, J. M., et al. Targeting the MHC class II pathway of antigen presentation enhances immunogenicity and safety of allergen immunotherapy. Allergy. 64, 172-178 (2009).
  11. Mohanan, D., et al. Administration routes affect the quality of immune responses: A cross-sectional evaluation of particulate antigen-delivery systems. J. Control Release. 147, 342-349 (2010).
  12. Waeckerle-Men, Y., et al. Lymph node targeting of BCG vaccines amplifies CD4 and CD8 T-cell responses and protection against Mycobacterium tuberculosis. Vaccine. 31, 1057-1064 (2013).
  13. von Beust, B. R., et al. Improving the therapeutic index of CpG oligodeoxynucleotides by intralymphatic administration. Eur. J. Immunol. 35, 1869-1876 (2005).
  14. Senti, G., et al. Intralymphatic immunotherapy for cat allergy induces tolerance after only 3 injections. J. Allergy Clin. Immunol. 129, 1290-1296 (2012).
  15. Senti, G., et al. Intralymphatic allergen administration renders specific immunotherapy faster and safer: a randomized controlled trial. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 17908-17912 (2008).
  16. Lesterhuis, W. J., et al. Route of administration modulates the induction of dendritic cell vaccine-induced antigen-specific T cells in advanced melanoma patients. Clin. Cancer Res. 17, 5725-5735 (2011).
  17. Fadul, C. E., et al. Immune response in patients with newly diagnosed glioblastoma multiforme treated with intranodal autologous tumor lysate-dendritic cell vaccination after radiation chemotherapy. J. Immunother. 34, 382-389 (2011).
  18. Eizenberg, P., et al. Acceptance of Intanza(R) 9 mug intradermal influenza vaccine in routine clinical practice in Australia and Argentina. Adv. Ther. 28, 640-649 (2011).
  19. Durando, P., et al. Adjuvants and alternative routes of administration towards the development of the ideal influenza vaccine. Hum. Vaccin. 7, 29-40 (2011).
  20. Barth, R. J., et al. A randomized trial of ex vivo CD40L activation of a dendritic cell vaccine in colorectal cancer patients: tumor-specific immune responses are associated with improved survival. Clin. Cancer Res. 16, 5548-5556 (2010).
  21. Schwaab, T., et al. Clinical and immunologic effects of intranodal autologous tumor lysate-dendritic cell vaccine with Aldesleukin (Interleukin 2) and IFN-{alpha}2a therapy in metastatic renal cell carcinoma patients. Clin. Cancer Res. 15, 4986-4992 (2009).
  22. Senti, G., Johansen, P., Kundig, T. M. Intralymphatic immunotherapy. Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol. 9, 537-543 (2009).
  23. Catron, D. M., Itano, A. A., Pape, K. A., Mueller, D. L., Jenkins, M. K. Visualizing the first 50 hr of the primary immune response to a soluble antigen. Immunity. 21, 341-347 (2004).
  24. Itano, A. A., Jenkins, M. K. Antigen presentation to naive CD4 T cells in the lymph node. Nat. Immunol. 4, 733-739 (2003).
  25. Johansen, P., Mohanan, D., Martinez-Gomez, J. M., Kundig, T. M., Gander, B. Lympho-geographical concepts in vaccine delivery. J. Control Release. 148, 56-62 (2010).
  26. Johansen, P., von Moos, S., Mohanan, D., Kundig, T. M., Senti, G. New routes for allergen immunotherapy. Hum. Vacc. Immunother. 8, 1525-1533 (2012).
  27. Senti, G., Johansen, P., Kundig, T. M. Intralymphatic immunotherapy: from the rationale to human applications. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 352, 71-84 (2011).
  28. Duthie, M. S., Windish, H. P., Fox, C. B., Reed, S. G. Use of defined TLR ligands as adjuvants within human vaccines. Immunol. Rev. 239, 178-196 (2011).
  29. Ribas, A., et al. Intra-lymph node prime-boost vaccination against Melan A and tyrosinase for the treatment of metastatic melanoma: results of a phase 1 clinical trial. Clin. Cancer Res. 17, 2987-2996 (2011).
  30. Bedrosian, I., et al. Intranodal administration of peptide-pulsed mature dendritic cell vaccines results in superior CD8+ T-cell function in melanoma patients. J. Clin. Oncol. 21, 3826-3835 (2003).
  31. Lesimple, T., et al. Injection by various routes of melanoma antigen-associated macrophages: biodistribution and clinical effects. Cancer Immunol. Immunother. 52, 438-444 (2003).
  32. Brown, K., et al. Adenovirus-transduced dendritic cells injected into skin or lymph node prime potent simian immunodeficiency virus-specific T cell immunity in monkeys. J. Immunol. 171, 6875-6882 (2003).
  33. Fong, L., Brockstedt, D., Benike, C., Wu, L., Engleman, E. G. Dendritic cells injected via different routes induce immunity in cancer patients. J. Immunol. 166, 4254-4259 (2001).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

İntralenfatik EnjeksiyonLenf Noduna AşılamaFare İmmünizasyonuCerrahi Sütürle Kapatmaİnguinal Lenf NoduAşı Uygulama Yöntemleriİmmün Yanıt ÖlçümüSubkütan Enjeksiyon KarşılaştırmasıAntikor Üretim AnaliziSitotoksik T-hücresi Yanıtı
Fare intralenfatik immünoterapi ve Aşılama
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.