Genler belirlenmesi için VIGS-aracılığı ile İleri Genetik Tarama konakçı olmayan Direnç ilgilendim

Özet

Virüsün neden olduğu gen susturma, bitkilerin konakçı olmayan direncinde yer alan genleri tanımlamak için yararlı bir araçtır. Konakçı olmayan patojenlere duyarlı gen susturuculu bitkilerin tanımlanmasında GFPuv eksprese eden bakteriyel patojenlerin kullanımını gösteriyoruz. Bu yaklaşım kolay, hızlıdır ve büyük ölçekli taramayı kolaylaştırır ve diğer çeşitli bitki-mikrop etkileşimlerini incelemek için benzer bir protokol uygulanabilir.

Özet

Bakteriyel patojenlere karşı bitkilerin konakçı olmayan hastalık direnci karmaşık bir savunma yollar ile kontrol edilir. Bu mekanizmanın anlaşılması patojenlerin geniş bir karşı dayanıklı hastalığa dirençli bitkilerin geliştirilmesi için önemlidir. Virüs kaynaklı gen susturulması (VIGS) tabanlı ileri genetik tarama konakçı olmayan direnç aktarmanın bitki savunma genlerin belirlenmesi için yararlı bir yaklaşımdır. Tütün çıngırak virüsü (TRV) tabanlı VIGS vektör bugüne kadar en verimli VIGS vektör ve verimli bir şekilde kullanılmaktadır Nicotiana benthamiana endojen hedef genlerin susturmak için.

Bu yazıda, N. bir cDNA kütüphanesi tek tek klonların susturmak için bir ileri genetik tarama yaklaşımı göstermek benthamiana ve konakçı olmayan patojenlere karşı tehlikeye konakçı olmayan direnç için gen susturulması bitkilerin yanıt değerlendirilmesi, Pseudomonas syringae pv. domates T1, P. syringae pv. glycInea ve X campestris pv. vesicatoria. Bu bakteriyel patojenler ifade GFPuv proteine ​​tasarlanmıştır ve susturuldu hedef gen konakçı olmayan direnç aktarmanın söz konusu ise kendi yeşil Florasanl koloniler konakçı olmayan patojen aşılanmış bitkilerde UV ışık altında çıplak gözle görülebilir. Bu konakçı olmayan patojenlere duyarlı gen susturulması bitkilerin güvenilir ve daha hızlı kimlik kolaylaştırır. Bundan başka, umut verici bir aday gen bilgi TRV vektör bitki geni uç sıralanmasıyla bilinebilir. Burada konakçı olmayan direnç ile ilgili genleri tanımlamak için VIGS-aracılı ileri genetik yüksek verimlilik yeteneği göstermektedir. Yaklaşık, 100 cDNAs ayrı ayrı sonra bir hafta içinde incelenebilir yaklaşık iki üç hafta ve birkaç konakçı olmayan bakteriyel patojenler karşı konakçı olmayan direnç önemleri de susturulabilir. Bu yazıda, bu tarama ile ilgili ayrıntılı adımlar numaralandırmak. VIGS-aracılı ileri genetik Screening yaklaşım, konakçı olmayan direnç katılan genlerin belirlenmesi için değil, aynı zamanda, çeşitli bitki türlerinde çeşitli biyotik ve abiyotik stres tolerans kazandıran genler incelemek için sadece uzatılabilir.

Giriş

Konakçı olmayan direnç belirli bir patojen ^1,2 yarışları karşı tüm bitki türlerinin direncidir. Bu geniş spektrum ve bitkiler ^2,3 dayanıklı hastalık direnci verir. Bununla birlikte, özellikle de bakteriyel patojenlere karşı mekanizması, iyi ⁴ anlaşılmış değildir. Uzlaşma konakçı olmayan direnç ve konakçı olmayan direnç ^5-9 sırasında farklı şekilde ifade genlerin tanımlanması için yüksek verimlilik transkript profil daha önce bakteriyel konakçı olmayan direnç diseksiyon için kullanılan iki ana yaklaşım olduğunu mutantlar veya susturulması bitkiler için tarama. Konakçı olmayan direnç birçok gen, gen tanımlama için bir yüksek ....

Protokol

1. Bitki Büyümesi ve Hedef Gen Susturma

1. Bitki büyüme koşulları:
   1. N. benthamiana tohumlarını topraksız saksı karışımı Metro-Mix 350 üzerine ekin ve tohumları bir büyüme odasında çimlendirin. Metro-Mix yerine başka herhangi bir topraklı veya topraksız ortam da kullanılabilir.
   2. Üç haftalık fideleri ayrı saksılara nakledin ve önceki literatürde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi diğer büyüme koşullarıyla birlikte 21±2 ° C'de tutulan bir serada büyütün¹². Transplantasyondan iki ila üç gün sonra, bitkiler TRV aşılaması için kullanılabilir.
2. Büyüyen TRV2 klonları:
   TRV iki....

Sonuçlar

Bu çalışmanın temel amacı, konukçu dışı dirençleri zayıflatılmış, genleri susturulmuş N. benthamiana bitkilerinin kolay ve doğru bir şekilde tanımlanması için bir yöntem göstermektir. Bu metodolojide dört ana adım bulunmaktadır. İlk adım, TRV-VIGS kullanarak çok sayıda genin tek tek susturulmasıdır. Şekil 1'de gösterilen protokolü kullanarak yaklaşık 1,5 yıllık bir süre içinde yaklaşık 5.000 geni susturduk^6,18. Genleri susturulmuş bazı bitkiler; bodur büyüme, sararma ve foto-ağarma .......

Tartışma

Bitki bağışıklığı, konakçı olmayan patojenlerin büyümesini sınırlar ve bu nedenle, uzun dalga boylu UV ışığı altında konakçı olmayan patojen ile aşılanmış vektör kontrol bitki yapraklarından çok az yeşil floresan yayılır veya hiç yayılmaz (Şekil 3D). Bununla birlikte, konakçı olmayan dirençte yer alan bir gen susturulduğunda, gen susturulmuş bitkiler, konakçı olmayan patojenin büyümesini destekler ve yeşil floresan görülür (Şekil 3E). Bu, bu yazıda açıklanan yöntemde yer alan temel ilked.......

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
96 kuyulu U-alt plakalar	Becton Dickinson Labware (Franklin Lakes, NJ, ABD)	35-3077
96 pinli çoğaltıcı paslanmaz çelik	Nalge Nunc International (Naperville, IL, ABD)	250520
Yüksek Yoğunluklu UV Kontrol Lambaları, Model B-100ap	Thomas scientific (İsveçli, NJ, ABD)	6283K50	Üretici Kimliği 95-0127-01
Stuart SC6 koloni sayacı	Bibby Scientific Limited, Staffordshire, Birleşik Krallık	SC6PLUS
Topraksız saksı karışımı, Metro-Mix 350	SUNGRO Bahçe Bitkileri Dağıtımı, Inc., (Bellevue, WA, ABD)
Primerler: attB1 (GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT) attB2 (GGGGACCACTTTÄAGAAAGCTGGGT)	Integrated DNA Technologies, Inc (Coralville, IA, ABD)	Özel sentezlenmiş
MES, Monohidrat	VWR uluslararası (Radnor, PA, ABD)	CAS No. 145224-94-8
Asetosiringon (Dimetoksi-4'-hidroksiasetofenon)	Sigma Aldrich (St. Louis, MO, ABD)	D134406
Vac-In-Stuff (Silwet L-77)	Lehle Tohumları (Round Rock, TX, ABD)	VIS-30