Bir burnumun Extension Tepki Böcekler Davranış Plastisitesi incelenmesi için protokol: Basic, Biyomedikal Uygulama ve Tarımsal Araştırma

Birçok böcekler, ekolojik ilgili uyaranlara hakkında bilgi ve daha sonra kendi ortamında yeni akıllı ilişkilere uyum amacıyla bu uyaranlara kendi davranışsal tepkileri değiştirmek. Birçok farklı mekanizmalar bu davranışsal plastisite altında yatan (örneğin, nonassociative, çağrışımlı / Pavlovyan ve edimsel / ¹ enstrümantal). Plastisite Bu tür uyaranlar veya davranışlar gibi gıda geçtiği, bir arkadaşı ya da tehlike gibi önemli olaylar ile ilişkili nasıl farklıdır. Plastisite bu formları anlamak sinir sistemi yeni anılar ² kodlamak için nasıl değiştirdiği, temel araştırma için çok önemlidir. Bu bitkisel üretim (bal arıları) ya da zararlıları gibi, ya da tarım açısından önemli olan önemli bir hastalığın vektörleri (örneğin, Çeçe ve sivrisinek) ve böcekler böceklerin adaptif davranışlarını anlamak için önemlidir.

Herhangi Deriden davranışsal plastisite incelenmesiark alanında ¹ başarılamayabilir olan değişken bir dizi deney üstü bir kontrol düzeyi gerektirir. Daha kontrollü şartlar altında kullanılabilir, ancak yine de doğal koşullar altında davranışı için önemli olan sağlam bir klima protokol geliştirilmesini gerektirmektedir. Bal arısı (Apis mellifera) davranışsal plastisite ^3,4 kontrollü analizler gerçekleştirmek için bir protokol geliştirmek için nasıl bir mükemmel bir model. Bal arılarında Hortum Uzatma Yanıt (PER) bal arısı bir şeker çözeltisi ile antennal uyarılmaya karşılık olarak proboscis uzandığı doğal bir davranış refleks. Bal arısı çiçekte nektar bulduğunda, normal toplayıcı davranış sırasında, BAŞINA oluşur. Neyse ki, bal arıları kolaylıkla laboratuvarda bu basit ve kolayca ölçülebilir davranışı sergiler. Bu kontrollü bir ortamda, çalışma mümkün kılar, bu ekolojik ilgili davranışlarını ⁵ etkileyen mekanizmaları. BAŞINA can da plastikliğini ⁶ altında yatan davranışsal ve nöral mekanizmaları ortaya çıkarmak için tasarlanmış değişik tedavi koşulları altında uyaran algılama ve öğrenme ve hafıza araştırmak için bir klima protokol dahilinde kullanılacaktır.

Kuwabara ⁷ tarafından ilk çalışmalardan beri, BAŞINA klima yaygın nonassociative, birleşmeli ve bal arıları ⁸ davranışsal plastisite altında yatan edimsel mekanizmaları ortaya çıkarmak için kullanılır olmuştur. Bu mekanizmalar arasındaki serbest bal arılarının ⁹ çalışmalarda gösterilen ile aynıdır. Özgürce uçan bal arılarının çalışmaların aksine, BAŞINA klima protokoller elektrofizyoloji ^10,11 veya beynin canlı hücre floresan görüntüleme ^12-14 ile birleştiğinde olabilir. Ayrıca, PER protokolleri, Neur gibi ağın belirli bileşenlerinin rolleri hakkında hipotezleri test etmek için farmakolojik veya moleküler genetik tedaviler aracılığıyla nöral yolları deneysel manipülasyon için izinomodulators ^15,16. BAŞINA protokolleri de çevre koşullarının yanı sıra sağlık üzerine toksinlerin ve bal arılarının ¹⁷ toplayıcı verimlilik öldürücü etkilerini değerlendirmek için önemli bir yol sağladı.

Bu prosedür paralel iki koku teslim yöntem açıklanır. Yöntem 1 koku ve sakaroz ödül sunmak için ucuz ve teknik olarak basit bir yöntem sağlar koku ve koşulsuz uyarıcı (sakaroz) teslim bir sürümüdür. Bu yöntem, temel eğitim için iyi ve otomasyon mümkün olmadığında. Bu bir sınıf ya da öğretim laboratuara bu tekniği tanıtmak için mükemmel bir yoldur. Daha zor görevler ve koku algı, öğrenme, ya da hafıza birleştiğinde fizyolojik değerlendirmelerini içeren deneyleri için klima sırasında, doğru ve kesin uyaranların başlangıcı, süresi teslimat zamanlaması düzenleyen çok önemlidir. En güvenilir uyaran sağlanması için, koku teslim a otomatik bir araç kullanımınd ödül doğum hassas bir yöntem. Yöntem 2 koku teslimatı ve daha hassas sakaroz teslim otomatik çalışmaktadır. Bu teknik daha sofistike ve Yöntem 1 den ilk kurulum için daha fazlasını gerektirir, ancak önemli ölçüde klima için kullanılan uyarıların zamanlaması ve miktarının tutarlılığını artırır ve mümkün olduğunca kullanılmalıdır.

1. Koku (Koşullu uyarıcı) Kartuş Kurulum

1. Kondisyonlama denemeler için gerekli tüm farklı kokulara deney kurulumu çok koku kartuşu başında.
   1. Koku seyreltme ve koku kartuşu hazırlanması için bir davlumbaz kullanın. Kokular laboratuvara genelinde hızla yayıldı ve potansiyel klima önce koku bal arıları gösterecektir beri bu davlumbaz dışında kokuların asla açık şişe,. Koku kartuşlarını kurarken Ayrıca, eldiven giymek ve onları tutarken kokulara bal arıları maruz kalmasını önlemek için iyice daha sonra yıkayın.
   2. Her koku kartuş açıkça ilk kullanıldığı için koku bir renk kodlu etiketle işaretlenmiş olduğundan emin olun. Kartuşu üzerinde kalan, koku olabileceğinden yok Birden fazla koku için bir koku kartuşu (şırınga haznesi ya da basma) kullanılır.
2. Hazırlama Kokular ve Koku Karışımları
   1. D, heksan ya da mineral yağ ya da kokuları seyreltinesired konsantrasyonu.
      NOT: koku konsantrasyonu değiştirilmesi veya arılar kokuları algılayabilir ve klimalı dernek öğrenmek nasıl ek yönlerini soruşturma için izin verebilirsiniz iki veya daha fazla koku karışımlarını sunulması. Koku karışımları doğal koku uyaranı taklit birkaç koku olarak 50:50 ikili karışımı gibi basit ya da karmaşık olabilir. Koku konsantrasyonunu azaltmak da görevin zorlaştırır.
      1. Kokular, kartuşun yeniden kullanımı (Şekil 2) ile tükenmiş olur. Tükenmesi sorunlar her 10-12 kullanan yeni bir kartuş geçmek edebilmek için yeterli kartuşları yapmak önlemek için.
3. Koku Kartuşları hazırlanması
   1. Yöntem 1
      1. Bu yöntem için, koku kartuşlar için, pistonun kauçuk ucuna tutturulmuş bir filtre kağıdı, 15 mm çapındaki bir daire ile 20 ml'lik plastik şırınga kullanın.
      2. Şırınga pistonu çıkarın ve filte parçasını takmak için bir iğnenin kullanınpistonun ucuna r kağıdı.
      3. Filtre kağıdı üzerine koku 10 ul koyun ve bir şırınga ağzına pistonu takın bir mikropipet kullanın. Şırınga varil üzerinde 15 ml işaretine pistonu itin.
   2. Yöntem 2
      1. Bu yöntem için, 1 cc'lik cam ya da plastik tüberkülin şırıngaları (ya da benzer bir hacmi ve şekli değiştirilmiş pipetler) içindeki bir filtre kağıdı şeridi ve koku kartuşlar için, şırınga haznesinin geniş ucunda bir kauçuk ya da silikon sınırlayıcı kullanmak.
      2. 1 cc tüberkülin şırınga varil Plenseri. Şırınga aksamı olarak kullanılan koku kartuşunun gövdesi olacaktır.
      3. , Şırınga pistonunun ikinci ucu siyah lastik çıkarın ve kauçuk ucu kapalı olan bir ucunu kesti.
         NOT: Bu kauçuk halka zamanından önce kartuşun ve ölçülü bal arısı üzerinde koku çekecek arenada hava akımı, emiş azaltmak için bir kısıtlama olarak hareket edecektir. Alternatif olarak, silikon tüp (4.8 mm oute5 mm kesit halinde kesilmiş r çap) restrictors olarak çalışıyorum.
   3. Şırınga varil ve% 70 etanol ile kauçuk / silikon debi sınırlama içini durulayın (önceki kullanımdan kalan kokunun çok kaldırmak için) ve onlara hava kurumaya bırakın.
   4. Kağıt çıkan açılmanın dışında açılma 1-2 cm uzanır böylece namlunun olarak geniş açıklık içine bir filtre kağıdı 0.2 x 4 sm şerit yerleştirin.
   5. Koku, şırınga haznesinin ucuna temas izin vermeden filtre kağıdı üzerine kokunun 3-10 ul yerleştirmek için bir mikropipet kullanın. Pipet aynı koku için yeniden, ama sonraki koku kurmak için yeni bir ipucu kullandığınızdan emin olun olabilir.
   6. Filtre kağıdı tüp içine hızlı bir şekilde kayarak yukarı kadar şırınga haznesinin geniş açıklığına çevirin. , Şırınga haznesinin olarak geniş açıklık içine kısıtlayıcı yerleştirin.
      1. Her bir koku kartuşu açıkça ilk için kullanılan koku renk kodlu bir etiket ile etiketlenmiş olduğundan emin olun. Bir koku kartuşunu (şırınga varil veya restr asla kullanmayınictor) birden fazla koku için beri üzerinde kalan, koku olabilir.
   7. Tüy bırakmayan bir doku sonuna kadar top,% 70 etanol ile ıslatın ve iyice kartuşun dışında kalan kokuyu gidermek için kartuşun dış yüzeyini silmek için kullanabilirsiniz.

2. Toplama, frenleyici ve Arılar Besleme

1. Arı frenleyici Harness hazırlanıyor
   1. (Tüm iç çapı yaklaşık 0.9 cm ve 1-2 mm et kalınlığına sahip) plastik soda payet, sert plastik boru, ya da işlenmiş metal borudan dışarı bal arıları için basit yasaklama koşumları olun. Ameliyat ilgili işlemlerde dayanıklı koşumları kullanın.
   2. Boru için yaklaşık 3 cm kesitler halinde kesilmiştir. Sonra, kısmen demetini tespit ederken daha kolay yerinde arı tutmak için yapmak için koşum üst 1 cm uzakta yaklaşık yarısını kırpın.
   3. Koli bandı 0,2 x 6 cm şerit kesin ve arı koşum, lea bir tarafında bir ucunuücretsiz diğer ucunu Ving.
2. İşçi Bees Toplama
   1. Onlar koloniden ayrılmadan önce duraklar gibi koloni girişinde işçileri toplayın ya da kazarak dönmek gibi.
      NOT: işçi arılar boyunca emeklemek için giriş aşağı dönen işçileri yavaşlatır ve koloni girmeden önce daha kolay onları yakalamak için yapar üzerinde, sadece yeterince büyük delikli, tel örgü bir parça yerleştirilmesi.
   2. Bunun içine uçar kadar arı üzerinde bir parıldama ampulünün yerleştirin. Arı şişeden dışarı uçmak değil bu yüzden açılış yatay veya kapak takılır ise aşağı bakacak flakon tutun. Her flakon tek bir arı yerleştirin. Kapak yeterli gaz değişimini sağlayacak bir delik olduğundan emin olun.
   3. Onlar şişelerde harcadığınız zamanı en aza indirmek için hızlı arılar toplayın. Gölgede küçük bir kutu içinde onları arılar ile şişeleri tutun.
   4. Laboratuara şişelerde ve arılar ile kutuyu aktarın ve bir buz-su sl içine şişeleri yerleştirmekurry arılar kadar hareketli durdurmak. Bir arı hareketsiz bir kez, soğuğa aşırı maruz önlemek için hemen buz flakonun çıkarılması ve bir kısıtlayıcı demeti içine arı yerleştirin.
      NOT: arılar soğuğa aşırı maruz kalma sonucu, hareketsiz hale ne zaman izlemek zordur beri buzdolabında veya derin dondurucuda arılar yerleştirerek önermiyoruz. 10'dan fazla arıları yararlanarak zaman, her seferinde su-buz karışımına sadece birkaç arılar aktarın.
3. Arılar frenleyici
   1. Sadece, borunun üst seviyesinde, oyuk boru bölümünü ve başını dönük dorsal göğüs ile demetindeki arı yerleştirin. Onun ağız parçaları boru kenarından dışarı uzanan çok hafifçe tüpün yakın arı basın. Baş ve arı sırt tarafında toraks arasında kanal bant şerit kaydırın ve sıkıca koşum tarafına serbest ucunu takın.
      1. Emin koşum bant pürüzsüz ve gergin olduğundan emin olun. Hiçbir bildirilecek olmalıarı koşum ön ve bant ve bant arasındaki ceable boşluklar koşum üstünde düz durmalıdır. Boşluklar varsa arı doğru düzgün burnumun uzatmak mümkün olmayabilir ya da kaçabilir. Ayrıca, arı ön bacakları koşum ön ve kanal bant arasında çıkıntılı olmadığından emin olun.
4. Klima Aralığı'na arılar ve Besleme Hayvan Besleme
   1. Kemerler aşağıdaki yaklaşık 30 dk - arılar ilk kurulum kurtarıldı sonra - arılar (suda) 3-4 ul 0.5 M sukroz doyurmaya. Bu miktar 3-4 saatte bir besleme-to-klima aralığı için yeterli olacaktır.
      1. Genel olarak, arılar henüz aralığını hayatta klimalı ilişkiyi öğrenmek için motive edilmelidir klima başında yeterince aç sağlamak için beslenme ve klima arasındaki bekleme süresi yaklaşık her saat için 1 ul 0.5 M sukroz doyurmaya. Bir laboratuvarda bir ılık sıcaklığında veya u eğer tuttusükroz değişik konsantrasyona şarkı beslenen miktarı buna göre zaman aralığını ayarlamak.
         NOT: 24 saat condition aralığında bir beslenme ile, klima başlayacak önce tüm arılar 0.5 veya 1 M sükroz en az 24 saat ile doygunluğuna beslenen emin olun. Bir klima protokolde de cevap verecek motive önce, oda sıcaklığında, yaklaşık olarak 24 saat arı gerektirir.
         Not: öğrenme performansını düşürebilir ¹⁸ klima sırasında kullanılan sükroz konsantrasyonu, daha az duyarlı hale gelmesini önlemek için havalandırma arıları sırasında bir ödül olarak kullanılan konsantrasyona göre arıları beslemek için sukroz çözeltisi daha düşük bir konsantrasyonda kullanın.
      2. De uzak eğitim alanından bir alanda arılar besleyin. Klima önce klima bağlamda koşulsuz uyarıcı (sakaroz) maruz koku sonraki klima etkileyebilir.
   2. Besleme ve c arasındaki aralıktaonditioning gereksiz rahatsızlığı önlemek için laboratuar sakin bir alanda tezgah üzerinde arılar yerleştirin. Laboratuar düşük ortam neme sahip ise, o zaman aralığı boyunca ıslak kağıt havlu ile plastik bir kap içerisinde arılar yerleştirin. Onlar uzun süreler boyunca düşük neme maruz eğer arılar ölebilir, çünkü bu kuruma önler.
      NOT: Bir deney içinde kullanımını ve beslenme protokolü değişiklik yapmayın! Kurma ve arılar beslenme ve arılar hepsi tam aynı şekilde tedavi edilir böylece her bir deney için klima başlayan arasında sadece belirli bir zaman aralığı kullanınız.

3. Klima

1. Sukroz Duyarlılık Test
   1. Klima başlamadan önce bir kaç dakika, 0.5 M sukroz çözeltisi (beslenmesi sırasında, aynı yoğunlukta), küçük bir damlacık ile anten dokunarak beslemek için raflarından motivasyon test edin. Onları bu test sırasında doyurmaya izin vermeyin. Onlar EXTE tarafından cevap veriyorsaonların burnumun nding, muhtemelen öğrenmek için yeterince motive ve protokolü için kullanılabilir.
2. Deney Tasarımı
   NOT: Bu protokol bal arıların öğrenme ve hafıza yetenekleri birçok yönlerini araştırmak amacıyla öğrenme protokollerin geniş bir dizi uyacak şekilde modifiye edilebilir. Inter-deneme aralığı, inter-uyaran aralığı, tipi ve konsantrasyonu ve kokuların, türü ve koşulsuz uyarıcı konsantrasyonu, sayısı ve sırası sayısı, belirli bir zamanda eğitimli arıların sayısı: ayarlanabilir birçok parametre arasında olan çalışmaların (Şekil 1; Tablo 1) ^19-21. Her klima deneme için tam protokolünü tasarlarken, bireylerin tutarlı arası deneme aralığını tutmak çok önemlidir. Arıların 'performansı düşeceğinden çok uzun veya tutarsız, çok kısa bir inter deneme aralığı. Bu konu tam bir tedavi için tartışma bakın.
   NOT: Arıs daha hızlı bir şekilde sıcak bir ortamda iseniz görevi öğreneceksiniz. Bu nedenle, antrenman ortam sıcaklığını tutarlı ve sıcak (29-30 ° C mümkünse) tutun.
3. Koku teslim (Stimulus Büfe)
   1. Yöntem 1
      1. Koku Dağıtım Sistemi Kurma
         1. Istikrarlı ve küçük ucunu arının antenleri doğrudan bakacak şekilde koku muamele filtre kağıdı yüklü plastik 20 ml şırınga monte edin. 15 ml işaretine pistonu ayarlayın ve piston kolayca erişilebilir yüzden şırınga yerleştirin.
      2. Koku Stimulus sunulması
         1. Antenlerinin koku kartuşa doğru doğrudan işaret her denemenin başında, klima arenada çiviye koşum arı yerleştirin. Arı koku uyaran sırasında görsel ortamda ani değişiklik nedeniyle bozulmasını azaltmak için koku uyaran başlamadan önce 15-25 saniye boyunca arena gelmesini sağlar.
            1. Arı klima arenada yerleştirilir hemen sonra koku kartuşa yanıt başlarsa, kartuşun ucunda koku olabilir. % 70 etanol batırılmış tüysüz bir doku ile kartuşu yıkayarak kirletici koku çıkarın. Bu sorunu çözmezse, kartuşu değiştirin.
         2. Piston tam olarak 4 saniye içinde bastırılır böylece sabit bir oranda şırınga pistonu basın. Koşulsuz uyaran sunmadan önce koku arının yanıtını izlemek.
         3. Her denemenin ardından, arı başka bir 15-25 saniye boyunca klima arenada dinlenmeye bırakın. Deneme aşağıdaki çok yakında arı Hareketli ölçüde her klima davanın etkinliğini azaltacaktır.
   2. Yöntem 2
      1. Koku Dağıtım Sistemi Kurma
         1. Hava akımı Kaynak ve Debi
            1. Koku iletimi için kaynak Hava akışılaboratuvar onunla donatılmış olup olmadığını, bir akvaryum havalandırıcı pompa veya laboratuar tezgah basınçlı hava beslemesini kullanabilirsiniz.
               NOT: Tipik bir akvaryum havalandırıcı pompası 400 ml / dk yakınlarındaki bir hava akışı oranı (7 ml / sn) sahip olacaktır; 4 saniye koku uyaran üzerinde, hava 28 mi, 1 ml kartuş akacaktır.
            2. Hava besleme akış hızını düzenlemek için hava besleme aygıtının boru ile paralel bir akış ölçeri kullanarak. Akış hızı 400 ml / dak kadar akış ölçeri ayarlayın. Ayrı bir saati ile koku kartuşunun açılışında akış hızını kontrol edin.
            3. Plastik boru ve valf sistemi vasıtasıyla koku kartuşa hava akışı bağlanır.
               NOT: aşağıda tarif zamanlama cihazı denemede uygun bir zamanda valfleri açılır. Plastik konnektörleri kartuşun şırınga varil Luer tipi eki aracılığıyla koku kartuşa hava akımı sistemi takın.
            4. Ne olursa olsun hava akımı kaynağı, ma periyodik akış hızını kontrolke emin hattı ile faal olduğu ve akış hızı, istenen hızda tutulur.
      2. Otomatik Koku Gönderme
         1. Koku teslim otomatikleştirmek için bir programlanabilir lojik kontrolör (PLC) kullanın.
            NOT: PLC, küçük bir hoparlör aracılığıyla, (bir düğmeye basarak başlatılan) programı başlatıldıktan sonra koku teslim hava akış 6 sn vanalarını açıp 4 saniye boyunca açık vanaları tutmak ve sesli bir besleme sinyalini ses programlanmıştır koku uyaranın başlangıcından sonra 3 sn sukroz teslim deneyci sinyal.
         2. Her duruşma sırasında koku uyaran zamanlama belirtmek için küçük bir LED kullanın. Onlar iyi göremiyorum böylece arıların fotoreseptör kısa [uv] dalga boyu daha uzun [kırmızı] dalga boylarından gelen ve doğru kayınca beri Mümkünse, bir kırmızı LED kullanın. Işık yanlışlıkla klimalı hale gelen uyaran olmayacak şekilde, kendi görüş alanının dışında, arkasında ve arı altındaki LED yerleştirin.
            NOT: light de PLC'nin düzgün çalıştığını doğrulamak yardımcı olur ve test denemeleri sırasında arıların cevaplarının video kayıtlarını analiz yararlıdır.
      3. Egzoz Sistemi
         1. Arı geçmiş havayı çekin ve kokunun her sunum için ayrı bir takvim korumak için klima arenada koku yüklü havayı tahliye için yardımcı arı arkasında bir egzoz sistemi kurun.
            Not: Laboratuarda bir vakum sistemi vardır, vakum noktasını değiştirmek ve arıtma arena boşaltılması için gerekli olan hava akımı oluşturmak için kurutucu bir boru kanalını ekleyin. Bir vakum sistemi var değilse, kurutma boru ile paralel olarak yerleştirilmiş bir küçük elektrikli fan duman başlığı ya da bir pencere yeterli olacaktır ile olmuştur.
      4. Her günün başlangıcında, koku dağıtım sistemi ve egzoz sisteminin elektrik ve hava bağlantılarını kontrol edin. Koku dağıtım sistemi üzerinde start düğmesine basınız ve presleme arasındaki zaman izlemekdüğmesi ve açık valfler (sessiz tıklama ve LED ışığı yanar) ve isteka koşulsuz uyaran sunmak için zaman (bir sinyal sesi) duyulur. Koku kartuşa bağlı olacaktır konektörün önünde nemli bir parmak yerleştirerek hava çıkışı kontrol edin. Vanalarının açık sadece güçlü bir hava akımı olmalıdır. Emin hava akımı düzgün klima arenada havayı tahliye için yeterince güçlü olduğundan emin olmak için egzoz sisteminin açılması tüy bırakmayan bir doku up tutarak egzoz sistemini kontrol edin.
   3. Koku kartuş montaj
      1. Egzoz sisteminin önünde doğrudan arı ve koku kartuşunu yerleştirmek için stand tezgah üzerinde veya küçük bir pleksiglas üzerine ya bazı modelleme kil yerleştirin. Kil, cam koku şırınga yerleştirin ve geniş sonunda açılış arının kafasına işaret edilmektedir şekilde ayarlayın. Şırınganın ucu arı 1-2 cm olmalıdır. Bu aralıkta bir mesafe almak ve sabit.
      2. Güvenli şırınganın dar buzlu cam ucuna hava tüpü ve valf sistemi için kartuş bağlantı rakoru yerleştirin.
   4. Koku Stimulus sunulması
      1. Antenlerinin koku kartuşa doğru doğrudan işaret her denemenin başında, klima arenada çiviye koşulmuş arı yerleştirin. Onun yeni ortama alışmış izin koku uyaran başlamadan önce 15-25 saniye arenada arı dinlensin.
         NOT: arı hemen klima arenada konulduktan sonra koku kartuşa yanıt başlarsa, kartuşun ucunda koku olabilir. % 70 etanol batırılmış tüysüz bir doku ile kartuşu yıkayarak kirletici koku çıkarın. Bu sorunu çözmezse, kartuşu değiştirin.
      2. Koku teslimat için zamanlama mekanizmasını başlatmak için start düğmesine basın. Uyaranın sonra koku arının yanıtını izlemekbaşlangıçlı ve koşulsuz uyarıcının sunulmasından önce.
      3. Her denemenin ardından, arı ilk bellek oluşumu için izin vermek için bir 15-25 saniye boyunca klima arenada dinlenmeye bırakın. Deneme aşağıdaki çok yakında arı Hareketli ölçüde her klima davanın etkinliğini azaltacaktır.
4. Sevkiyat Sakaroz (koşulsuz uyarıcı)
   1. Yöntem 1
      1. Bu yöntem için, sukroz teslim etmek için bir kürdan.
         NOT: Bu ahşap kürdan klimalı uyarana arıların yanıtları etkileyecektir bir koku var çünkü plastik kürdan kullanmak en iyisidir.
      2. Sukroz çözeltisi içine kürdan ucu batırın ve bu koşulsuz uyaran sunmak için zaman zaman, arının önünde kürdan tutun ve arı yaklaşık 1 saniye boyunca kürdan gelen sukroz yalamak için izin verir.
      3. Su'nun oluşumunu önlemek için düzenli kürdan değiştirinCrose.
   2. Yöntem 2
      1. Sukroz Dağıtım Sistemi
         Not: koşulsuz uyaran sunmak için daha kesin bir yolu doğru bir şekilde az miktarda sükroz ödül (bir mikrolitre onda biri) sağlayabilir mikrometre şırıngalarının kullanımıdır.
         1. Lütfen mümkün olduğu kadar şırınga mikrometre sarın. Sükroz solüsyonu ile mikrometre bir şırınga gövdesi içinde yükleyin. Emin cam kısmında hava kabarcığı olmadığından emin olun ve şırınga monte. Şırınga haznesinin dar ucuna yerleştirmeden önce sakaroz çözeltisi ile iğnenin hub doldurun. Emin iğne sıvı iğnesini yıkamadan su sakaroz ve aslında yapmak için, deney başlamadan önce ileri 1-2 ul mikrometre sarın.
   3. Sukroz Sunum
      1. Koku sunulmasına rağmen, yaklaşık 2 cm arı iğne ucu tutun. Önlemek için eğitim arena kenarını kullanınhareket olarak şırınga sallayarak arı dikkatini edebilirsiniz. Bu da erken sakaroz koku gelen arının dikkatini kayacak yana, besleme sinyalinin beklentisiyle çok yakın iğne alamadım.
      2. Arı, burnumun uzanır kadar kısa sürede besleme sinyal sesi gibi, hafifçe antenleri dokunun, ardından arı doyurmaya. Bu anten sadece çok hafif bir dokunuş ya da iki gerektirir.
         1. 0.2 ve 0.8 ul arasında bir ödül miktarını kullanın. Arı kolayca koşulsuz uyaran (~ 1-2 sn) için ayrılan süre içinde tüm damlacığı tüketmek gerekir. Arı birkaç saniye boyunca beslenir ama tamamen tüketmek değil büyük bir damlacık gelen besleme "istenildiği kadar" kullanmayın.
         2. Ödül sonraki sunumlar için arının tepkisini azaltacaktır anten, üzerine inşa sakaroz için izleyin. Bu oluşursa besleme işlemi değiştirin.
         3. Koku doğru eşleştirme sağlamak içinisteka ve sükroz ödül, sesinden sonra kısa sürede arı sukroz çözeltisi damlacık sunmak için emin olun.
            NOT: CS (koku) ve ABD (sakaroz) başlangıcı arasındaki zamanlama önemlidir. İdeal olarak, koku sunum ve sükroz sunum kısaca üst üste gelmelidir. Daha bir kaç saniye CS sonu ve ABD'nin teslimi arasındaki süre geçerse, klima performansı azalacaktır.

4. Test

1. Klima kullanımı donatısız testi denemelerden sonra arılar öğrendim ne kadar iyi değerlendirmek ve / veya klimalı ilişkiyi hatırlamak için.
   NOT: klima çalışmalarda performans ve test denemeleri ve test kokuların sayısı amacıyla bir açıklama 'Arıların yanında Katkısız test çalışmalarda yanıtları' Arıların analiz önemini ayrıntılı bir açıklama için tartışma bakın.
2. Konsolidasyon Zaman
   1. Aşağıdakiklima, hemen bir deneme deneme yönetmek veya arılar bir konsolidasyon dönemi boyunca dinlenmeye bırakın ya.
      Not: Konsolidasyon süresinin uzunluğu, havalandırma ve test arasındaki zaman aralığı, deneyin amacı bağlıdır. Amaçlı öğrenme farklılıkları veya kısa-süreli hafıza araştırmak için ise test denemeleri üzerine arıların performansı hemen ardından ya da şartlandırma birkaç saat sonra değerlendirilebilir. Deney uzun vadeli bellek araştıran içeriyorsa, test eden çalışmalar klima sonunda sonra en az 24 saat verilmelidir.
   2. Test denemeleri klima Aşağıdaki fazla 24 saat ise, test çalışmalarda önce 12-24 saat kadar daha sonra günde en az bir kez klima sonra 0.5 M sukroz ile doygunluğuna arıları beslemek ve.
      1. Onların antene dokunmadan artık tepki olarak burnumun uzatmak kadar onları her birkaç farklı kez doyurmaya, arılar doyma ulaşmış emin olmak içinsakaroz ile e. Onlar doyma ulaşmak 40'a kadar ul tüketebilir.
   3. Konsolidasyon döneminde kendi desike ve ölüyor engellemek için nemlendirilmiş bir kapta arılar tutun.
3. Testi Denemeler
   1. Test için yalnızca yeni hazırlanan koku kartuşlarını kullanın.
      NOT: Test uyaran nedenle, denemeler, kokular, ve bireysel arılar arasında tutarlı olmayacak ve böylece edinimi için kullanılan kartuşlar farklı olarak önemli ölçüde sonuçların tutarlılığını ve sağlamlığını etkileyebilecek, tükenmiş olabilir.
   2. Deneyin koşullandırma aşamasında kullanılan test sırasında, aynı deneme arası aralığı ve diğer parametreleri sürdürmek.
   3. Bir ödül varlığı, şartlandırılmış uyarana arıların yanıtı değiştirebilir potansiyel Klima protokolü veya bir tedavinin daha ince maskeleme efektleri beri test denemeleri sırasında koşulsuz uyaran sunmak etmeyin.
   4. Tüm rekor videoları otest çalışmalarda f sonra koku (ler) için birden fazla Yönleri arıların tepkilerini ölçmek mümkün.

5. Arıların Cevapları Kayıt

1. PER ikili (varlığı / yokluğu) Puanlama
   1. Klima denemeler sırasında ve test denemeleri sırasında PER bir ikili puanlama sistemi kullanın. Pozitif ya da negatif olarak yanıtlar Skor; Bu tedavi grubu başına 20-40 arıların bir örneklem büyüklüğü ile analizler birçok türde için tatmin edicidir. Tepkilerinin tam topolojisi ²² karmaşık olabilir. Bunu görmek ve olumlu bir yanıt kriter puan için kolay kurmak için önemlidir.
      1. Arı açılan altçenelerinin ipuçları bağlayarak yapılan hattının ötesine burnumun uzandığında pozitif (+) gibi bir arının yanıt Skor. Arı koku başlangıcından sonra ancak ofset koku öncesi burnumun uzandığında sadece olumlu bir yanıt puan.
      2. Negatif bir arının yanıt Skor (-) herhangi bir e olduğundahortum koku verici ofset sonra uzatılır veya eğer duruşma sırasında burnumun xtension.
      3. Kısmi yanıtları puanı çalışıyor kaçının. Arıların davranışlarında daha ince ayrımlar yapmak için, aşağıda belirtilen video analiz tekniği kullanın.
2. Ek BAŞINA Ölçümleri Video Analizi (Film 1)
   1. Bir koku, bir arının tepkilerinin videoları analiz ederek davranış testlerinden ek bilgi toplayın.
      NOT: Tedavi grupları arasında PER varlığı / yokluğu puanlamada bir fark yok özellikle bu ölçümler de, kokulara arıların tepkilerin incelenmesi için bir yüksek temporal çözünürlük sağlayabilir.
   2. Video kaydederken
      1. Daima video kayıtları için Katkısız testi veya söndürme denemeleri kullanın. Ödül varlığı hortum uzatma süresini değiştirerek, koku arıların tepkisini değiştirecektir.
      2. Eğitim arenada üzerinde bir tripod üzerinde bir video kamera ayarlayın ve arının başının önündeki kamerayı odaklamak, böylece antenleri ve hortum keskin odak vardır.
      3. Koku başlamasını ve analiz sırasında ofset tanımlamak için kullanmak için video görünür arının arkasında bir alanda, koku uyaran sunum gösterir küçük bir LED ışığı, yerleştirin.
      4. Koku başlamadan önce 20 saniye kayıt başlayın ve koku arı rahatsız öncesi ofset sonra en az 20 saniye boyunca kayda devam.
   3. Video Analiz
      1. Videoda belirli çerçeveler arasındaki zaman aralıklarını ölçme yeteneği ile, bu tür iMovie veya Final Cut Pro gibi video düzenleme yazılımı içine videoları, yükleyin.
      2. Koku uyaran (örneğin, 10 veya 20 saniye) başlangıcında başlayan bir ayrık süre için koku arıların tepki analiz.
      3. PER değerlendirmek için aşağıdaki ortak ölçümleri kullanın:
         1. Tedbirhortum (yukarıda açıklanan) mandibula-to-mandibula hattının ötesine uzanan toplam zamanı hortum uzatma, süresi.
            NOT: Bir arı uzatmak ve 10-20 sn zaman penceresi sırasında burnumun birden çok kez geri olabilir. Tek tek her hortum uzantısı ölçün ve toplam süresini hesaplayın. Her hortum uzantısı sayısını ve süresini analiz de değerli bilgiler sağlayabilir.
         2. LED ışığı geldiğinde, koku başlangıcı arasındaki zaman hortum uzatma, ve ilk hortum uzantısı gecikme ölçmek.
         3. Toplamı ve koku verici madde başlangıcından ilk uzama veya başka zamanlama parametreleri nispi zaman Glossal uzantıları.
         4. Ayrıca karakteristik koku odaklı değişiklikleri göstermek Antennal hareketleri ^23, izlemek.
            NOT: Film 1'de, antennal hareketler antennal hareketlerinde değişiklik göstermek video izleme yazılımı ile takip edilmiştir ibir koku yanıtı uyaran n.

Yukarıda tarif edilen BAŞINA protokollerin kullanımı iki örneğini sunuyoruz. Yöntem 2 ilk örneği yapılmış kullanımı bal arılarının CS 5,24,25 olarak kullanılan koku için moleküler benzerlik bir fonksiyonu olarak farklı kokuyu nasıl algıladıklarını incelemek için. İkinci Yöntem 1 ve araştırma laboratuvarında koşullama deneyleri PER kullanmaya başlarken alınması gereken tedbirler bazı kullanımının bir örnektir.

Bu gibi çalışmalar 13 veya elektrofizyolojik 26 analizleri Biyogörüntüleme ile birlikte bal arıları ve kelebekler koku 'algısal alan' tanımlamak için kullanılmıştır. Bal arılarının (n = 20) 12 ileri eşleştirme klima çalışmalarda (Şekil 3A) üzerinde sukroz takviye ile Odorant desanal ilişkilendirmek için klimalı edildi. Bal arılarının yaklaşık% 10 normaldir ilk deneme, üzerinde 'kendiliğinden' yanıtını verdi. Bundan sonra responde yüzdesibal arılarının% 100, beşinci deneme ve sonraki her deneme cevap verene kadar önümüzdeki birkaç çalışmalarda üzerinde artış d. Çeşitli çalışmalar yanıt olarak bu artış birçok önemli kontrol prosedürleri 3 için ileri eşleştirme durumda (Şekil 1) nisbetle için özel olduğunu göstermiştir. Edinim aşaması, sonra, her bir bal arısı koku CS ve sistematik olarak molekül yapılarında CS farklı birçok koku maruz katılan takviye edilmemiş test çalışmalarda bir dizi (Şekil 3B) 'e tabi tutulmuştur. Bal arıları CS en güçlü yanıt verdi. Diğer koku karşı tepkileri CS gibi en koku en düşük tepkiler ile yapısal olarak sistematik değişikliklerin bir fonksiyonu olarak düşmüştür.

Şekil 4, öğrenciler ilk kez öğrendiği bir son atölyeden sonuçları, nasıl gösterilmektedir Yöntem 1 kullanarak bal arıları şartlandırılması. Öğrenciler köknar t sukroz takviye (Şekil 4A) ile ileriye doğru eşleştirme methycyclohexanone (AÇS) veya oktanolde (OKT) ile bal arıları klimalı. Yüzde yanıtları ilk deneme düşük ve arılar koku-sakaroz dernek öğrendim belirten sonraki çalışmalar artmıştır. Arılar öğrencilerin farklı gruplar arasında şartlanmış ilişkiyi öğrendiği derecede farklılıklar vardı. Bizim tecrübelerimize göre, farklılıkların bu tür yöntemle (Yöntem 1) de kesin elemanları, ya da deneycilerden eğitim seviyesine, CS olarak kullanılan koku nedeniyle olabilir. Üçüncü durumda, performans hızlı deneyselciler 'artan tecrübe ile daha tutarlı hale gelir. Klima sonra, her bal arısı her koku ile iki kez test edildi. Ekim veya AÇS ileri eşleştirme ile klimalı olmuştu bal arılarının gruplar halinde, yanıt olarak, klimalı koku (Şekil 4B) güçlü bekleniyordu.

ent "> Ekim için eşleştirmesini ileri deneyimli bal arıları ikinci grup koku Ekim geriye sakaroz ile eşleşmiş oldu başka bir gruba paralel olarak klimalı edildi. Geriye eşleştirme göstermek için kontrol prosedürlerinin çeşitli türlerinden biridir verdiği yanıtta artış Geriye eşleştirme için, sakaroz ABD ve koku CS Şekil 1'de gösterilmiştir ne ters sunulmaktadır bu anlayışın gelen spesifik olmayan uyarılma olarak, eşleştirmeyi iletmek özgü ve başka bir işlem nedeniyle değildir.. Toplama verileri geriye eşleştirme vardır CR sakaroz sunumundan sonra koku CS sunum derecelendirilirler olamaz çünkü gösterilmemiştir. birleşmeli klima için tahmin edilebileceği gibi, Ekim için tepki düzeyleri geriye grubunda (Şekil 4C) için ileri eşleştirilmiş grup göreli olarak yüksek bulunmuştur.

7fig1highres.jpg "width =" 500 "/>
Şekil klima için deneysel tasarım 1. Diyagramlarına ileri eşleştirmeyi kullanarak. Bak bu şekilde kullanılan terimlerin tanımları için Tablo 1. (A) CS (koku) öncesinde ve ABD (sakaroz / su çözeltisi) ile örtüşmektedir. Gösterilen CS ve ABD arasındaki ilişki klima bal arıları ve kelebekler için en uygunudur. Ama optimum ISI klima protokol ve hayvan türlerinin 1 güvenebilirsiniz. (B) tamir ve CS, CR, ABD ve UR göreli zamanlama. ABD sunum öncesi veya Katkısız 'test' denemeler sırasında birinin meydana CR Deneysel protokollerin bağımlı ölçüdür.

Şekil 2. kartuşları yeniden kullanım ile Koku tükenmesi. Bu veriler için, koku kartuşları vardıkurulum hekzanol ile metinde anlatıldığı gibi. Heksanol yaygın BAŞINA çalışmalarda CS olarak kullanılır; Bununla birlikte, tükenmesi gerçek oranı, koku ve solvente bağlıdır. Kartuşları sonra 4 sn (40 kullanımları eşit olur standart deneyde 5 bal arılarının / deneme varsayarak) 8 çalışmalarda üzerinde her dakika için bir kez kullanıldı. BAŞINA deneyler nispeten standart vardı belirtilen solven içinde dilüsyonlar, 2.0 M (A) ve 0.2 M (B) idi. (A, B), birinci ve koku, bir katı faz üzerine adsorpsiyon ile sekizinci denemeden sonra numune alındı daha sonra bir gaz kromatografisinde üzerine kusturulmuş edildi mikroekstraksiyon (SPME) lif. Zirveleri altında göreceli alanlar, hem çözücülere sekizde ilk deneme akrabası sonra hem konsantrasyonları daha yüksek bulunmuştur (Wilcoxon eşleştirilmiş çiftler işaretli sıra testi p <0.05 [*] veya daha fazla), daha az koku kartuştan teslim olduğunu gösterir Kartuş bir kaç kez. (C, D) sadece sekizinci tr gösteren aynı veri kullanıldıktan sonra genişletilmiş y-ekseni ile ial. Bu tükenme mineral yağ heksan edebilmesi için biraz daha fazla, ancak sadece düşük bir konsantrasyonda olduğunu göstermektedir.

Şekil 3. Toplama ve test CS ve klima yöntem 2 olarak desanal kullanarak. (A) Deneme-by-deneme 12 ileri eşleştirme denemeleri (Şekil 1) tepkinin (CR). Veri 5 bal arılarının her dört grupta klimalı n = 20 bal arıları vardır. ISI 3 saniye olmuştur ve ITI 6 dakika olmuştur. (B), C-zincir uzunlukları ve / veya karbonil karbon pozisyonu ile dekanal farklılık kokuları ile Katkısız testleri. Kokular dört gruba genelinde bir randomize dizi sunuldu ve CR tükenme önlemek amacıyla desanal (her iki-üç denemeler) ile takviyeli çalışmalar ile serpiştirilmiş edildi.

hep ">:" keep-together.within-page = fo "e_content
Bir atölye Şekil 4. Veri sırasında öğrenciler (sırasıyla n = 23 ve 15 Gps 1 ve 2) oktanol şartına bal arılarının üç grup yöntemi BAŞINA 1. (A) Toplama verileri kullanarak bal arıları kondisyon için eğitilmiştir olarak mezun ve metilsikloheksanon (n = 10) (B) iki kokuları ile Katkısız testleri sırasında CRs.; Dört grup arasında rastgele seride sunulmaktadır denemeler. (C) bal arılarının, ileri eşleştirilmiş biri iki grupta hem kokuları ile Takviyesiz testleri (Gp 1, n = 23) ve bir geri (n = 25) eşleştirilmiş.

Dönem (kısaltma)	Tanımı	İlgili Örnek
Klimalı Uyarıcı (CS)	Birİlk az ya da hiç tepki ortaya çıkaran ve ABD sinyalleri uyaran	KOKU
Klimalı Yanıt (CR)	ABD ile dernek sonra CS tepki	Burnumun Extension
Koşulsuz uyarıcı (ABD)	Bir yanıt uyandıran bir biyolojik olarak önemli bir uyarıcı	SAKKAROZ / SU ÇÖZÜM
Şartsız Tepki (UR) bir	ABD tepkisi	Burnumun Extension
Inter-Uyarıcı Aralığı (ISI)	ABD CS başlangıcı ve başlangıcı arasındaki süre	SÜKROZ aralığına KOKU
Inter-Deneme Aralığı (ITI)	Tek bir hayvan için ardışık CS-ABD eşleşmeleri arasındaki süre	KOKU için KOKU (deneme n) (deneme n + 1) aralık

Tablo 1. Important Terminoloji. derneklerin diğer türleri için rağmen, CR ve UR aynıdır klima BAŞINA için., bu terimlerin bir örnek için Şekil 1'e bakın ve CR ve UR farklılık refleksleri.

Film 1. bir koku yanıt vermek için klimalı edildikten sonra PER yapan bir bal arısı bir video. Yaklaşık 1.5 sn koku başlangıcından sonra arının PER yanıtını unutmayın. Izleme yazılımı koku sunumuna karşılık olarak antennal hareketleri çizilmiştir. Videonun sağ üst köşedeki çizilen çizgiler gerçek antennal hareketlerini tasvir. X (sol) ve Y ekranda göstermek antennal hareketlerinin altındaki iki grafik (sağ) koordine eder. Videoda gösterilen grafikteki dikey çizgiler, sağa, ışık ON, PER sol işaret ışığı yanmıyor ve tekzip fil hortumu.

Yazarların açıklayacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.