Yöntem makalesi

Aktif Kaspaz 3 Algılama Tüm montaj immünofloresans tarafından Zebra balığı Embriyolar Apaptozun Analizi

21.1K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/51060

⸱

20 Aralık 2013

 ,  ,  , 
1Department of Oncological Sciences, University of Utah

Bu makalede

Özet

Bazı genetik bozulmalar veya toksinlere maruz kalma, belirli hücre tiplerinin ölümüne yol açan normal gelişimsel süreçleri bozabilir. Zebra balığı embriyolarında tam montajlı immünofloresan ile aktive edilmiş Kaspaz 3'ün analizi, spesifik olarak apoptoz geçiren hücrelerin evre ve dokuya özgü lokalizasyonunu ortaya koymaktadır.

Özet

Aktive edilmiş Kaspaz 3'ü (Casp3 testi) tespit etmek için tam montajlı immünofloresan, zebra balığı embriyolarında içsel veya dışsal apoptoz geçiren hücreleri tanımlamak için yararlıdır. Tam montaj analizi, apoptozis geçiren hücre tiplerini tam olarak belirlemek için nihai olarak kesitleme ve / veya birlikte etiketleme gerekmesine rağmen, apoptozan hücrelerin doku özgüllüğü ile ilgili olarak mekansal bilgi sağlar. Tam montajlı Casp3 testi, 4 hücreli aşama ile döllenmeden 32 saat sonra sabit embriyoların analizi için optimize edilmiştir ve zebra balığı mutantlarının ve morfantlarının analizi, mutant ve vahşi tip mRNA'ların aşırı ekspresyonu ve kimyasallara maruz kalma dahil olmak üzere bir dizi uygulama için yararlıdır. Canlı embriyolardaki apoptotik hücreleri birkaç saat içinde tanımlayabilen akridin portakal boyaması ile karşılaştırıldığında, Casp3 ve TUNEL testlerinin tamamlanması oldukça uzun sürer (2-4 gün). Bununla birlikte, apoptotik hücre oluşumunun ve klirensinin dinamik doğası nedeniyle, sabit embriyoların analizi, apoptotik hücrelerin belirli zaman noktalarında birden fazla numunede doğru bir şekilde karşılaştırılmasını sağlar. Ayrıca Casp3 testinin, maliyet ve güvenilirlik açısından tam montajlı TUNEL testi ile apoptotik hücrelerin analizinden daha üstün olduğunu bulduk. Genel olarak, Casp3 testi, erken zebra balığı embriyolarında apoptotik hücreleri analiz etmek için sağlam, yüksek oranda tekrarlanabilir bir testi temsil eder.

Giriş

Burada, aktive edilmiş Kaspaz 3 (bundan sonra Casp3 testi olarak anılacaktır) ile hücreleri tespit etmek için erken zebra balığı embriyolarında tam montajlı immünofloresansın nasıl gerçekleştirileceğini açıklıyoruz. Bu yöntemin genel amacı, zebra balığındaki apoptotik hücrelerin nispi bolluğunu ve yerini 4 hücreli aşamadan döllenme sonrası 32 saate (hpf) kadar belirlemektir.

Hem içsel (mitokondri aracılı) hem de dışsal (ölüm reseptörü aracılı) apoptotik yollar, kaskaz kaskadı1-2'nin aktivasyonu yoluyla hücre ölümüne aracılık eder. Başlatıcı kaspazlar normalde hücre içinde monomerler olarak bulunur ve bir pro-apoptotik sinyale yanıt olarak yola özgü platformlara alındıktan sonra aktive edilmiş dimerler haline gelirler. Aktive edilmiş başlatıcı kaspazlar (Kaspaz 9; içsel yol ve Paz 8; dışsal yol) daha sonra aktif heterotetramerler oluşturmak üzere bölünme için predimerize, inaktif efektör kaspazları (Kaspaz 3, 6, 7) hedefler. Aktif efektör kaspazlar daha sonra, kromatin yoğunlaşması ve zar kanaması gibi apoptozun ultrastrüktürel ayırt edici özellikleriyle sonuçlanan spesifik proteolitik yıkımı başlatmak için hücresel hedefleri spesifik tetrapeptit kalıntıları ile ayırır ve hücrenin fagositler tarafından yutulmak üzere paketlenmesine aracılık eden hücre yüzeyi sinyalleri immün sessiz bir şekilde. Memeli hücrelerinde, aktif efektör kaspazların, hem içsel hem de dışsal yollar1-2 yoluyla apoptoza aracılık eden hücresel bölünme olaylarının çoğunu gerçekleştirdiği düşünülmektedir. Burada açıklanan protokol, kaspaz 3'ün bölünmüş, heterotetramerik formunu spesifik olarak bağlayan, ancak aktif olmayan kaspaz 3 dimerini bağlamayan bir antikor kullanır.

Casp3 testinin avantajlarından biri, apoptotik hücrelerin uzamsal dağılımını tüm embriyo bağlamında görselleştirme yeteneğidir. Bu nedenle, ilgilenilen dokular apoptotik hücrelerin varlığı açısından incelenebilir ve belirli hücre tiplerini etiketleyen antikorlar veya floresan transgenik suşlar varsa, o zaman birlikte etiketleme deneyleri yoluyla apoptoz geçiren hücrelerin tam kimliğini belirlemek mümkündür. Birkaç grup, zebra balığı embriyolarında apoptoz için bir belirteç olarak aktive edilmiş Kaspaz 3'ü başarıyla kullanmıştır (ör. 3-7). Zebra balığı embriyolarındaki apoptotik hücreleri tanımlamak için ek tam montaj teknikleri arasında TUNEL testi8 ve akridin turuncu (AO) boyama9 bulunur. Zebra balığı embriyolarında apoptotik hücreleri tanımlamak için her üç yöntemi de kullandık4,6,10.

TUNEL (Terminal deoksinükleotidil transferaz dUTP çentik ucu etiketleme) boyama, lenfositlerde VDJ rekombinasyonu sırasında DNA'nın 3' hidroksil uçlarına nükleotidler eklemek için kullanılan Terminal deoksinükleotidil Transferaz (TdT) enziminden yararlanır11. TdT, esas olarak apoptotik hücrelerde bol miktarda bulunan DNA'daki serbest 3' hidroksil gruplarına dUTP-biyotin ekler. Dokular daha sonra avidin-peroksidaza maruz bırakılır ve substrat 3-amino-9-etilkarbazol eklendikten sonra apoptotik hücreler boyanır. TUNEL testi, vahşi tip zebra balığı dokularında embriyonik gelişim sırasında apoptotik hücrelerin kapsamlı bir analizini yapmak için kullanıldı12. Casp3 testine benzer şekilde, TUNEL testi sadece sabit embriyolar üzerinde gerçekleştirilir. Casp3 testinin TUNEL testinden daha tutarlı ve daha ucuz olduğunu bulduk.

AO boyama ilk olarak Drosophila13'teki apoptotik hücreleri spesifik olarak tanımlamak için bir mekanizma olarak tanımlandı. AO, apoptotik, ancak nekrotik olmayan hücrelerin hem sitoplazmasını hem de çekirdeğini boyar. AO'nun nükleik asitleri14 bağladığı iyi bilinmektedir ve bunun nükleer lekelenmeyi açıkladığı düşünülmektedir. Bununla birlikte, AO canlı hücrelerin kromatinini lekelemez; daha ziyade, apoptoz sırasında meydana gelen spesifik değişikliklerin, yoğunlaştırılmış apoptotik çekirdeklerin15 araya girmesine ve boyanmasına izin verdiği görülmektedir. AO boyama, canlı embriyoların hızlı apoptotik analizi avantajına sahiptir. Bununla birlikte, apoptotik hücre oluşumunun ve klirensinin dinamik doğası nedeniyle numunelerin dokümantasyonu hızlı bir şekilde yapılmalıdır. Öte yandan, tüm numunelerin aynı anda fiksasyonu, tüm numunelerde belirli bir zamanda apoptozun anlık görüntüsünü sağlar ve bu zamansal değişkene tabi değildir. Bu nedenle, AO boyama ile apoptotik hücrelerin analizi sabit embriyolarla uyumlu olmadığından, Casp3 testi, birden fazla numunede fotoğrafik dokümantasyon ve / veya nicelemenin gerekli olduğu deneyler için tercih edilir.

Protokol

1. Çözeltilerin Hazırlanması

  1. 500 ml 1x PBST (1x PBS,% 0.1 Tween-20) hazırlayın ve filtre sterilize edin. 1x PBST, bakteri üremesi belirtisi olmadığı sürece süresiz olarak oda sıcaklığında (RT) tutulabilir.
  2. DİKKAT: Toz haline getirilmiş PFA'yı 1x PBS'de 1x PBS'de 1 saat boyunca 1 saat çözerek ve ışıktan korumak için alüminyum folyo ile kaplayarak kimyasal bir başlıkta 50 ml %4 paraformaldehit (PFA) hazırlayın. 4 °C'de 1 ay veya -20 °C'de 2 yıl saklayın.
  3. 500 ml taze 1x PDT (1x PBST, %0.3 Triton-X, %1 DMSO) hazırlayın. 1x PDT, 4 °C'de bir aya kadar saklanabilir.
  4. 50 ml bloke edici tampon hazırlayın (1x PBST,% 10 ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu,% 2 sığır serum albümini). 10 ml alikotlar oluşturun ve -20 ° C'de 1 yıla kadar saklayın. Çözüldükten sonra, blokaj tamponu 4 °C'de 48 saate kadar saklanabilir.
  5. 30 ml suyu 80 °C'ye ısıtarak 100 ml %4 metilselüloz hazırlayın. Sıcak suya 4 g metilselüloz ekleyin ve oda sıcaklığında bir karıştırma plakası üzerinde bir karıştırma çubuğu kullanarak karıştırın. İyice karıştırma genellikle 4 saat ila gece sürer. Kalan (ısıtılmamış) suyu ekleyin ve 4 °C'de 1 saat karıştırın. RT'de saklayın.
  6. Kuyruk tomurcuğu aşaması ile 32 hpf arasında embriyo kullanılıyorsa, 50 ml 10 mg / ml pronaz hazırlayın ve 4 ° C'de 1 haftaya kadar saklayın. Aksi takdirde, 1 yıla kadar -20 ° C'de 10 ml'lik alikotlarda saklayın.
  7. -20 °C'de 50 ml %100 metanol yerleştirin.
  8. 280 g Instant Ocean Sea Tuzunu 2 L damıtılmış suda (Westerfield 16'da olduğu gibi) çözerek60x yumurta suyu hazırlayın. 60x stoğu deiyonize suda seyrelterek 1x yumurta suyu hazırlayın.

2. Embriyoların Hazırlanması

  1. Zebra balığı embriyolarını bir Petri kabında 1 hücreli aşama ile 4 hpf arasında 32 x yumurta suyunda toplayın.
    1. 4 hücreli ve kuyruk tomurcuğu aşamaları arasındaki embriyolar için adım 2.2'ye geçin.
    2. Kuyruk tomurcuğu aşaması ile 32 hpf arasındaki embriyolar için, 10 ml 1x yumurta suyunda embriyolara 100 μl 10 mg / ml pronaz ekleyerek koryonları çıkarın.
    3. Not: Pronaz aktivitesi partiler arasında değişken olabilir. Bu nedenle, yeni partiler elde edildiğinde nihai pronaz konsantrasyonu dekoryonasyon için optimize edilmelidir.
      1. Oda sıcaklığında 30 dakika inkübe etmeye bırakın.
      2. Yumurta suyunu / pronaz çözeltisini atığa dökün ve yavaşça taze 1x yumurta suyunu geri ekleyin.
      3. Mevcut yumurta suyunu (ve serbest yüzen koryonları) dökerek 2 kez durulayın ve yavaşça yeni yumurta suyu ekleyin.
      4. Not: Çoğu koryon bu noktada kaldırılmalıdır. Bir transfer pipeti ile, kalan koryonlar çıkarılana kadar embriyoları nazikçe yukarı ve aşağı emdirin.
  2. 1,5 ml'lik bir tüpe 40 adede kadar embriyo aktarın. 1 ml 1x PBST ile 2 kez durulayın.  
  3. Embriyoların hemen üzerinde sıvı bırakarak PBST'yi çıkarın (tüpte yaklaşık 100 μl hacim kalmalıdır). 1 ml% 4 PFA ekleyin. Taşıma kolaylığı için uygun büyüklükte bir kapta (örneğin bir Petri kabı veya bir pipet kutusu üstü) tüpleri yan yatırın (böylece embriyolar tüpün uzunluğu boyunca yayılır) ve gece boyunca veya bir haftaya kadar 4 ° C'de yumuşak bir külbütöre yerleştirin.  
    1. 4 hücreli ve kuyruk tomurcuğu aşamaları arasındaki embriyolar için, sabit embriyoları forseps ile manuel olarak dekoryonlayın.

3. İmmünofloresan Prosedürü

  1. Tüpleri bir tüp rafına yerleştirin, böylece tüm embriyolar tüpün dibine çöker. PFA'yı (uygun atık kabına) çıkarın, sıvıyı embriyo seviyesinin hemen üzerinde bırakın. Fiksasyonu takiben (adım 2.3), arka plan antikor lekelenmesini önlemek için embriyolar asla havaya maruz bırakılmamalıdır.
  2. 1 ml buz gibi %100 metanol (geçirgenleşmesi için) damla damla ekleyin. Embriyolar fiksasyondan sonra artık kırılgandır ve sonraki tüm sıvıların çıkarılması / eklenmesi sırasında tüp içinde yuvarlanmalarını önlemek için ekstra özen gösterilmelidir. Tüpleri yanlarına yerleştirin ve -20 °C'de 2 saat bekletin. Alternatif olarak, embriyolar -20 ° C'de 24 saate kadar bırakılabilir.
  3. Tüpün dibindeki embriyoları toplamak için tüpleri bir rafa yerleştirin. Metanolü çıkarın, sıvıyı embriyo seviyesinin hemen üzerinde bırakın.
  4. Dikkatlice 1 ml 1x PDT ekleyin. PDT'yi çıkarın ve 1 ml taze 1x PDT ekleyin. Tüpleri yanlarına yerleştirin ve 30 dakika boyunca RT'de hafifçe sallayın. PDT'yi çıkarın ve taze PDT ile 30 dakika yıkayın
    5. .
  5. Sıvı, embriyo seviyesinin hemen üzerine çıkana kadar PDT'yi çıkarın ve 500 μl bloke edici tampon ekleyin.
    1. Embriyoları bir taşıma kabına yan yatırın ve embriyoların tüpün uzunluğunun 2 / 3'ünden daha fazla hareket etmediğinden emin olun. Aksi takdirde embriyolar tüpün kapağına ve sıvının dışına sıkışır.  
    2. Tüplü taşıma kabını 1 saat boyunca RT'de çok yumuşak bir külbütöre dikkatlice yerleştirin.
  6. Tüpleri bir tüp rafında dik tutun ve kapağa yapışmış embriyoları kontrol etmek için tüm tüpleri açın. Kapağında embriyo bulunan herhangi bir tüp için, üst kısmı kapatın ve tüm embriyoları sıvıya geri getirmek için tüpü elinizle hafifçe sallayın.
  7. 1 μl tavşan anti-aktif Kaspaz 3 antikoru (1:500 seyreltme) ekleyin.
    1. Bir ortak etiketleme deneyi yapılıyorsa, anti-aktive edilmiş Kaspaz 3 antikoruna ek olarak tavşan türevi olmayan ikinci antikorun uygun seyreltmesini ekleyin.
  8. Embriyoları dikkatlice yan yatırın ve oda sıcaklığında 2 saat boyunca hafifçe sallayın. Alternatif olarak, embriyolar gece boyunca 4 ° C'de inkübe edilebilir.
  9. Tüpleri bir tüp rafına yerleştirin. Blok/antikor solüsyonunu çıkarın. 1 ml 1x PDT ekleyin. Tüpün kapağına yapışmış embriyoları toplamak için tüpü elle ters çevirdiğinizden emin olun. Ardından, tüm embriyoların kapaktan çıkarıldığından emin olmak için tüm tüpleri açın.
  10. Adım 3.4'ü tekrarlayın.
  11. 3.5-3.10 adımlarını tekrarlayın, ancak anti-aktive Kaspaz 3 antikorunu, mavi ışığı emen ve yeşil ışık yayan bir anti-tavşan florofor konjuge antikorun uygun seyreltilmesi ile değiştirin. Bununla birlikte, kullanıcı tarafından tercih edilen bir absorpsiyon/emisyon spektrumuna sahip herhangi bir florofor konjuge antikor burada kullanılabilir. İkincil antikorun eklenmesinden sonra, testin geri kalanında embriyoları karanlıkta tutmak önemlidir. İnkübasyon adımları sırasında taşıma kabını alüminyum folyo ile örtün, ancak tamponları değiştirirken ışığa maruz kalma konusunda endişelenmeyin.
    1. Bir ortak etiketleme deneyi yapılıyorsa, bu adımda tamamlayıcı bir florofor konjuge ikincil antikorun uygun seyreltmesini ekleyin.
    2. Not: Kullanıcı, aktif Kaspaz 3'ü Gfp eksprese eden hücrelerle birlikte etiketlemek isterse, tavşan anti-aktif Kaspaz 3 antikorunu burada yeşil olmayan floresan bir anti-tavşan ikincil antikoru takip etmeli ve anti-GFP antikorunu yeşil floresan tavşan olmayan ikincil antikor takip etmelidir. Bu, embriyoların fiksasyonundan sonra bir miktar Gfp floresansı görünür kalırsa karışıklığı ortadan kaldıracaktır.

4. Apoptotik Hücrelerin Floresan Mikroskobu ile Analizi

  1. Uygun ışık filtresini kullanarak floresan mikroskop altında küçük bir Petri kabında veya cam spot plakada 1x PDT'deki embriyoları analiz edin. Pozitif kontroller minimum arka plana sahip parlak floresansa sahipse, adım 4.2'ye geçin. (Değilse, Tartışmadaki sorun giderme bölümüne bakın ve protokolü yeni embriyolarla tekrarlayın.) Embriyolar 1x PDT'de 4 ° C'de 48 saate kadar saklanabilir.
  2. 3,5 cm'lik bir Petri kabına% 4 metilselüloz dökün, sadece tabağın altını kaplayacak kadar. Alternatif olarak, çöküntüde büyük bir damla metilselüloz ile bir cam spot plaka veya çöküntü slaytı kullanılabilir. Embriyoları tüpün altından dikkatlice temiz bir transfer pipetine emdirin ve görselleştirme için Petri plakasına aktarın.
  3. Açılı bir prob kullanarak dokümantasyon için ilgilenilen bir embriyoyu yönlendirin. Aynı numuneden alınan embriyolar arasında muhtemelen bir miktar değişkenlik olacaktır, bu nedenle bu numuneden alınan embriyoların çoğunda gözlenen floresan yoğunluğunu ve modelini temsil eden görüntülerin alınması önemlidir. Spesifik olmayan arka plan floresansının birikmesini önlemek için dokümantasyon testin tamamlanmasından sonraki 48 saat içinde yapılmalıdır. Artık %4 metilselüloz, embriyoların genotiplendirilmesi için gerekli olan sonraki PCR reaksiyonlarına müdahale etmeyecektir.
  4. Not: Bir embriyonun belirli bir açıda hareketsiz hale getirilmesine yardımcı olmak için, embriyoyu tabağın dibine nazikçe itmek yardımcı olur, böylece yumurta sarısı veya embriyonun başka bir kısmı (istenen görünüme bağlı olarak) tabağın dibinde durur. Ardından, dokümantasyon için istenen açıyı elde etmek için embriyoyu veya hemen çevresindeki metilselülozu (aynı anda mikroskop altında görselleştirirken) hareket ettirmek için probu kullanın.

Sonuçlar

Casp3 testi, 4 hücreli evreden 32 hpf'ye kadar apoptotik hücrelerin net kanıtlarını sunar. Şekil 2A, Bim veya Noxa gibi güçlü pro-apoptotik bh3-only proteinlerini kodlayan yüksek konsantrasyonlardaki mRNA'ların embriyolara enjekte edilmesinin, gelişimin 4 hücreli evresinde hızla aktif-Kaspaz 3 oluşumuna yol açtığını göstermektedir. Embriyonik ölüm sonrasında 1 saat içinde meydana gelir4. Floresans yoğunluğunun orta düzeyde olduğuna, ancak sonuçların kesin olduğuna dikkat edin. Daha ileri evrelerde, floresans yoğunluğu daha güçlüdür. Örneğin, Şekil 2B, pro-apoptotik bh3-only geni olan puma'yı kodlayan orta derecede toksik düzeylerde4 mRNA enjekte edilmiş küre evresindeki embriyolarda parlak aktif-Kaspaz 3-pozitif hücreleri göstermektedir. puma mRNA enjeksiyonunun apoptozu intrinsik, mitokondri aracılı yolak üzerinden indüklediğini kanıtlamak için anti-apoptotik bcl-2 genini kodlayan haberci RNA birlikte enjekte edilmiştir.

Zebrafish'lerde IR kaynaklı apoptoz, puma5-6 gibi bh3-yalnız genlerin p53 aracılı transkripsiyonunu gerektirir. Şekil 3'teki IR kaynaklı apoptozda görülen gecikme, p53 aracılı transkripsiyon gereksinimiyle uyumludur.

Casp3 protokolü, güçlü bir sinyal-gürültü oranı sağlamalıdır. Şekil 4, optimal Casp3 analiz sonucunu, kritik adımlar ihmal edildiğinde ortaya çıkan yaygın iki suboptimal sonuçla karşılaştırmaktadır (bkz. Tartışma): hayvan dokusundaki arka plan floresansı nedeniyle oluşan zayıf bir sinyal-gürültü oranı ve ilgi duyulan sinyali gölgeleyen vitellus floresansı.

Transgenik GFP ekspresyonu yapan hatlar kullanılarak yapılan kolabelleme deneyleri, apoptoza uğrayan dokuları yaklaşık olarak belirler (Şekil 5).

Embriyo immünboyama akış şeması: metanol permeabilizasyonu, antikor işlemi, görüntüleme süreci.
Şekil 1. Casp3 protokolünün basitleştirilmiş şeması.

Zebrafish embriyonik gelişimi, 4-hücre ve küre evreleri, gen ekspresyon analizi ile birlikte parlak alan mikroskopisi.
Şekil 2. (A) 4-hücre evresi embriyolarda apoptoz analizi. Embriyolar, gelişimin tek hücreli evresinde 50 pg egfp (kontrol) veya pro-apoptotik bh3-only genleri olan bim ve noxa kodlayan mRNA ile enjekte edildi. 4-hücre evresinde (enjeksiyondan yaklaşık bir saat sonra, hpi), aktif Caspase 3'ü tespit etmek için embriyolar immünofloresan ile analiz edildi. Bim ve noxa mRNA'ları, enjeksiyonun hemen ardından zebrafish embriyolarında hızlı apoptozu indükler ve embriyoların gelişmesine izin verilirse, 2 hpi'ye kadar ölümle sonuçlanır4. Karşılaştırma için yabani tip bir 4-hücre evresi embriyosunun parlak alan görüntüsü gösterilmiştir. (B) Küre evresi zebrafish embriyolarında apoptoz analizi. Embriyolar, gelişimin tek hücreli evresinde 50 pg egfp (kontrol), 5 pg puma artı 45 pg egfp (puma) veya 5 pg puma artı 45 pg bcl-2 (bcl-2) kodlayan mRNA ile enjekte edildi. Küre evresinde (yaklaşık 4 hpi), embriyolar Casp3 testi ile analiz edildi. Apoptotik hücreleri görselleştirmek için hem lateral hem de animal pol görünümleri gösterilmiştir. bcl-2 tarafından puma ile indüklenen apoptozun kurtarılması, puma mRNA enjeksiyonunun apoptozu spesifik olarak intrinsik, mitokondri aracılı yolak üzerinden indüklediğini göstermektedir. Karşılaştırma için yabani tip bir küre evresi embriyosunun parlak alan görüntüsü gösterilmiştir.

Sıralı embriyonik gelişim, floresan görüntüleme; embriyo büyüme evreleri 0-3 hpfIR, 17-20 hpf.
Şekil 3. 17-20 hpf arasında iyonize radyasyon (IR)-indükli apoptozun zaman seyri. Zebrafish embriyoları 17 hpf'de 8 Gy IR ile ışınlanmış ve IR sonrası 0, 1,5, 2 ve 3. saatlerde (hpIR) Casp3 analizi ile incelenmiştir. 20 hpf'deki oklar, 3 hpIR'de spinal korddaki apoptotik hücrelerin birikimini göstermektedir. Karşılaştırma amacıyla 17-hpf'lik bir embriyonun parlak alan görüntüsü gösterilmiştir.

Embriyo floresan analizi; kontrol ve işlem görmüş örneklerin karşılaştırmalı mikroskopi görüntüleri.
Şekil 4. 27-hpf embriyolarda optimal ve sub-optimal Casp3 immünofloresan sonuçları. Zebrafish embriyoları 24 hpf'de 15 Gy ile ışınlanmış (veya ışınlanmamış) ve Casp3 analizi ile incelenmiştir. "Optimal" grup, apoptotik hücrelerin parlak floresan verdiği, apoptotik olmayan hücrelerin ve vitellusun ise minimum arka plan floresansı gösterdiği ideal sonuçları göstermektedir. “Kontrolde arka plan floresansı” grubundaki oklar, kontrol embriyolarının hayvan dokusundaki aşırı arka plan floresansını belirtmektedir. “Vitellus floresansı” grubundaki yıldızlar, vitellustaki aşırı spesifik olmayan floresansı göstermektedir.

Floresan mikroskopi analizi; α-Gfp, α-Casp3 ekspresyonu; hücre apoptozu tespiti; üst üste bindirilmiş diyagram.
Şekil 5. Çift etiketleme deneyleri, IR kaynaklı apoptozun yaklaşık doku özgüllüğünü göstermektedir. Tg(olig2:egfp)vu12 transgenik hattı motor nöronları ve oligodendrositleri etiketler17, Tg(elavl3:egfp) hattı ise tüm farklılaşan nöronları etiketler18. Her bir transgenik hat 24 hpf'de 15 Gy ile ışınlanmış ve 3 saat sonra önce fare anti-GFP ve tavşan anti-aktif-Kaspaz 3 primer antikorları, ardından sırasıyla yeşil ve kırmızı floresan ikincil antikorlar kullanılarak analiz edilmiştir. Omuriliğin (27-hpf, 3-hpIR embriyolarının vitellus uzantısının sonunun dorsal kısmında yer alan) büyütülmüş görüntüsü gösterilmektedir. Apoptoz geçiren hücreler kısmen hem Tg(elavl3:egfp) hem de Tg(olig2:egfp)vu12 popülasyonlarında lokalize görünmektedir (üst üste bindirilmiş görüntüdeki ok uçlarına bakınız); bu durum, nöronların ve oligodendrositlerin IR kaynaklı apoptoza duyarlı olduğunu göstermektedir.

Tartışma

Bu protokolde sunulan Casp3 testinin basit olması amaçlanmıştır ve burada belirtildiği gibi gerçekleştirilirse, sağlam bir sinyal-gürültü oranına yol açmalıdır. Bu protokolün kritik adımları arasında tüm yıkamalar için taze 1x PDT tamponunun kullanılması, embriyoların birincil antikorda inkübasyonunu takiben PDT tamponunda yeterli uzunlukta yıkama adımları, embriyoların nazikçe işlenmesi ve protokolün tüm adımları sırasında tüpler veya transfer pipetleri içindeki tüm embriyoların titizlikle muhasebeleştirilmesi yer alır.

Deneyimlerimize göre, pozitif kontrollerde sinyal eksikliğinin en yaygın nedenleri şunlardır: 1) yıkama adımları sırasında 1x PDT yerine 1x PBST ikame edildi, 2) 1x PDT tamponu bir aydan eski, 3) yanlış ikincil antikor kullanıldı, 4) embriyolar 32 hpf'den daha eski ve/veya 5) bir tüpte 40'tan fazla embriyo analiz edildi. Numunelerde tutarsız sonuçlar veya değişkenlik ortaya çıktığında, bunun nedeni genellikle 1) işlem sırasında tüm embriyoların her zaman sıvı içinde kalmasını sağlamak için özen gösterilmemesi ve/veya 2) embriyoların yeterli sallanma altında inkübe edilmemesidir. Yüksek düzeyde arka plan gürültüsü genellikle embriyonun hayvan dokusu boyunca ortaya çıkan genel bir floresan pus olarak görselleştirilir (bkz. Şekil 4, "arka plan floresansı"). 1) embriyolar birincil antikoru takiben yeterli süre yıkanmadığında ve/veya 2) embriyolar önerilen süreden daha uzun süre PFA veya metanol içinde bırakıldığında zayıf bir sinyal-gürültü oranı ortaya çıkabilir. Testin sonunda embriyolar bozulmadan kalamazsa: 1) PFA ile fiksasyonun ardından çözeltiler damla damla eklenmedi ve/veya 2) inkübasyon adımları sırasında rocker hızı çok yüksek ayarlandı.

Casp3 testinin doğasında bulunan tam montajlı görselleştirme, apoptotik hücrelerin uzamsal lokalizasyonu için yararlıdır. Bununla birlikte, doku özgüllüğü yaklaşıktır ve apoptoz geçiren hücrelerin tam kimliğini belirlemek için muhtemelen birlikte etiketleme tekniklerine (bkz. Şekil 5) ve/veya embriyo kesitine dayanacaktır. Burada açıklanan protokolde, birlikte etiketleme, tahlilimizde kullanılan spesifik tavşan kaynaklı antikor gereksinimi ile sınırlıdır. Zebra balığı embriyolarında apoptotik hücreleri tam montajlı immünofloresan ile spesifik olarak etiketleyen, ticari olarak temin edilebilen, tavşan türevi olmayan anti-aktif bir Kaspaz 3 antikoru tanımlamadık. Bu nedenle, tavşanlarda yetiştirilen hücre tipine özgü antikorlar, birlikte etiketleme deneyleri için Casp3 testi ile uyumlu olmayacaktır. Bir alternatif, apoptotik hücreleri etiketlemek için fare kaynaklı bir antikor gerektiren bir TUNEL testi yapmaktır6. Bununla birlikte, zebra balığı embriyoları üzerinde gerçekleştirilen tam montajlı TUNEL testinin, TdT enziminin konsantrasyonu, TdT enziminde embriyo inkübasyon süresi ve tüp başına mevcut embriyo sayısı dahil olmak üzere reaksiyondaki bir dizi değişkene karşı çok hassas olduğunu bulduk (yayınlanmamış gözlemlerimiz). Bu nedenle, sonuçların tutarlı bir şekilde yorumlanmasını sağlayan bir enzim dengesi bulmak zordur. Bu nedenle, tercih edilen bir alternatif, belirli bir hücre tipinde GFP gibi bir florofor (ticari olarak temin edilebilen sağlam antikorlarla) eksprese eden transgenik zebra balığı embriyolarındaki apoptotik hücreleri analiz etmektir. Daha sonra, bir birincil fare anti-Gfp antikoru ve ardından bir yeşil floresan anti-fare ikincil antikoru kullanılarak birlikte etiketleme deneyleri gerçekleştirilebilir. Örnek için Şekil 5'e bakın.

Casp3 protokolü, 4 hücreli aşamadan 32 hpf'ye kadar embriyolarda apoptotik hücrelerin sağlam, güvenilir bir şekilde boyanmasını sağlarken, antikorların yaşlı embriyoların derisine nüfuz edememesi nedeniyle 32 hpf'nin ötesinde sınırlı bir uygulamaya sahiptir. Kollajenaz, tripsin, aseton veya etanol ile tedavi de dahil olmak üzere embriyoları geçirgen hale getirmek için ek teknikler, bu tahlili daha yaşlı embriyoların analizine uyarlamak için potansiyel olarak optimize edilebilir. Bununla birlikte, AO ile boyama, en az 5 günlük olana kadar canlı zebra balıkları üzerinde yapılabilir9. Böylece, AO testi embriyonik aşama kısıtlamasını aşar ve apoptotik hücreleri analiz etmek için hızlı bir testi temsil eder (1-2 saat). Buna karşılık, Casp3 testi, embriyoların gece boyunca sabitlenmesini gerektirir ve tamamlanması 2-4 gün sürer. AO testinin dezavantajları arasında, embriyolar canlı olduğundan ve apoptotik hücreler hızla oluşup temizlendiğinden, embriyoların verimli fotoğrafik dokümantasyonunun birden fazla örnekle zor olabilmesi yer alır. Bu, özellikle dokümantasyon için belirli bir oryantasyon elde etmek için embriyoların monte edilmesi gerekiyorsa sorunlu olabilir. Ek olarak, PFA ile fiksasyondan sonra AO boyamasının azaldığını, dolayısıyla immünofloresan içeren ortak etiketleme deneyleriyle uyumlu olmadığını bulduk.

Aktifleştirilmiş Kaspaz 3'ün kantitatif analizi, belgelenmiş görüntülerin floresan yoğunluğunu ölçen yazılım programları kullanılarak gerçekleştirilebilir. Nöral dokuda IR kaynaklı apoptozu ölçtük, başka bir yerde ayrıntılı olarak tanımladığımız bir yöntem10. Deneye bağlı olarak, aktive edilmiş Kaspaz 3'ün kantitatif analizi, optimal doku analizi için uygun oryantasyon elde etmek için düz montaj gibi embriyoların daha fazla manipülasyonunu gerektirebilir. Ek olarak, analizin doğrusallığı, analiz edilen dokunun kalınlığına bağlı olacaktır. Örneğin, beynin nöron yoğun dokusundan ziyade omuriliğin sığ nöral dokusunda aktif-Kaspaz 3 immünofloresansını ölçerek nöral dokuda IR kaynaklı apoptozu analiz ettik4,10.

Deneyimlerimize göre, Casp3 testi, analizin dokümantasyon için yeterli zaman gerektirdiği durumlarda, 4 hücreli aşama ile 32 hpf arasındaki zebra balığı embriyolarında apoptozu analiz etmek için mevcut en sağlam ve güvenilir testtir. Spesifik hücreleri tanımlamak için uygun antikorlar veya transgenik hatlar mevcut olduğunda, bu tahlil aynı zamanda apoptoza uğrayan spesifik hücre tiplerini tanımlamak için birlikte etiketlemeye de oldukça uygundur.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Finansman, Huntsman Kanser Vakfı (CJ, CT), Amerikan Kanser Derneği hibesi #RSG-13-025-01-CSM (RS) ve NIH T32 GM007464-36 (SS) tarafından sağlandı.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1.5 ml tüpler ve nbsp;Denville Scientificc2170Tehlikesiz. Benzer 1,5 m'lik plastik tüpler yeterli olacaktır.
10x Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS)Sigma AldrichP5493Tehlikesiz.
a-aktif-insan-Kaspaz-3 antikoruFisher ScientificBDB559565Solunması veya yutulması halinde zararlı olabilir.
a-GFP monoklonal antikor (fare)Life Technologies33-2600Solunması veya yutulması halinde zararlı olabilir.
a-HuC/HuD insan nöronal proteini, fare IgG2b, monoklonal 16A11 - UNCONJLife TechnologiesA21271Solunması veya yutulması halinde zararlı olabilir.
Albümin, Sığır BSA Isı Şoku İzolasyonu AmrescoCAS 9048-46-8Tehlikesiz. Bioexpress aracılığıyla da satın alınabilir: 0332-1006
Alexa Fluor 488 Eşek anti-fare IgGLife TechnologiesA110291:200 seyreltmede kullanın. Solunması veya yutulması halinde zararlı olabilir.
Alexa Fluor 488 Eşek anti-Tavşan IgGYaşam TeknolojileriA212061:200 seyreltmede kullanın. Solunması veya yutulması halinde zararlı olabilir.
Alexa Fluor 568 Eşek anti-Tavşan IgGYaşam TeknolojileriA100421:200 seyreltmede kullanın. Solunması veya yutulması halinde zararlı olabilir.
Dimetil Sülfoksit (DMSO)Sigma AldrichD8418Yanıcı.
Dumont #5 Inox Forseps (standart uçlar/düz)Güzel Bilim Araçları11251-20Keskin!
FBS HyClone Fetal Sığır Serumu Thermo-FisherSH3091003Tehlikesiz.
Fisher Scientific Ocelot DöndürücüFisher Scientific05-450-21Manuel hız kontrollü herhangi bir döndürücü uygundur.
Anında Okyanus Akvaryumu Tuzu Petco1373684Tehlikesiz.
Metanol (aseton içermez)Sigma AldrichM1775Yanıcı: solunması, yutulması ve temas yoluyla toksiktir.
MetilselülozSigma AldrichM0387-1006Tehlikesiz.
ParaformaldehitSigma AldrichP6148Yanıcı: solunması, yutulması ve temas yoluyla toksiktir.
Prob (Açılı 80 Kısa/15,5 cm/0,15 mm uç çapı)İnce Bilim Araçları10140-02Keskin!
PronaseRoche11459643001Tehlikesiz.
Pyrex Spot PlakasıFisher Scientific13-748BTehlikesiz.
Transfer Pipetleri, Samco genel amaçlıThermo-Scientific204Tehlikesiz.
Triton X-100Sigma AldrichT8787Tahriş edici: yutulması veya temas halinde zararlıdır.
Tween-20Sigma AldrichP7949Tehlikesiz. Diğer markalar arasında VWR # 97063-872 bulunur.

Kaynaklar

  1. Tait, S. W., Green, D. R. Mitochondria and cell death: outer membrane permeabilization and beyond. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 621-632 (2010).
  2. Taylor, R. C., Cullen, S. P., Martin, S. J. Apoptosis: controlled demolition at the cellular level. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 231-241 (2008).
  3. Eimon, P. M., et al. Delineation of the cell-extrinsic apoptosis pathway in the zebrafish. Cell Death Differ. 13, 1619-1630 (2006).
  4. Jette, C. A., et al. BIM and other BCL-2 family proteins exhibit cross-species conservation of function between zebrafish and mammals. Cell Death Differ. 15, 1063-1072 (2008).
  5. Kratz, E., et al. Functional characterization of the Bcl-2 gene family in the zebrafish. Cell Death Differ. 13, 1631-1640 (2006).
  6. Sidi, S., et al. Chk1 suppresses a caspase-2 apoptotic response to DNA damage that bypasses p53, Bcl-2, and caspase-3. Cell. 133, 864-877 (2008).
  7. Zhao, X., et al. Interruption of cenph causes mitotic failure and embryonic death, and its haploinsufficiency suppresses cancer in zebrafish. J. Biol. Chem. 285, 27924-27934 (2010).
  8. Yager, T. D., Ikegami, R., Rivera-Bennetts, A. K., Zhao, C., Brooker, D. High-resolution imaging at the cellular and subcellular levels in flattened whole mounts of early zebrafish embryos. Biochem. Cell Biol. 75, 535-550 (1997).
  9. Furutani-Seiki, M., et al. Neural degeneration mutants in the zebrafish, Danio rerio. Development. 123, 229-239 (1996).
  10. Sorrells, S., et al. Ccdc94 Protects Cells from Ionizing Radiation by Inhibiting the Expression of p53. PLoS Genet. 8, (2012).
  11. Gavrieli, Y., Sherman, Y., Ben-Sasson, S. A. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation. J. Cell Biol. 119, 493-501 (1992).
  12. Cole, L. K., Ross, L. S. Apoptosis in the developing zebrafish embryo. Dev. Biol. 240, 123-142 (2001).
  13. Abrams, J. M., White, K., Fessler, L. I., Steller, H. Programmed cell death during Drosophila embryogenesis. Development. 117, 29-43 (1993).
  14. Beers Jr, R. F., Hendley, D. D., Steiner, R. F. Inhibition and activation of polynucleotide phosphorylase through the formation of complexes between acridine orange and polynucleotides. Nature. 182, 242-244 (1958).
  15. Delic, J., Coppey, J., Magdelenat, H., Coppey-Moisan, M. Impossibility of acridine orange intercalation in nuclear DNA of the living cell. Exp. Cell Res. 194, 147-153 (1991).
  16. Westerfield, M. The Zebrafish Book. , University of Oregon Press. Eugene, OR. (1993).
  17. Shin, J., Park, H. C., Topczewska, J. M., Mawdsley, D. J., Appel, B. Neural cell fate analysis in zebrafish using olig2 BAC transgenics. Methods Cell Sci. 25, 7-14 (2003).
  18. Park, H. C., et al. Analysis of upstream elements in the HuC promoter leads to the establishment of transgenic zebrafish with fluorescent neurons. Dev. Biol. 227, 279-293 (2000).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Apoptosis TespitiFloresan MikroskopiKaspaz 3 DeneyiEmbriyo FiksasyonuAntikor BoyamaDoku SpesifitesiH cre l m Analizi
Aktif Kaspaz 3 Algılama Tüm montaj immünofloresans tarafından Zebra balığı Embriyolar Apaptozun Analizi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.