Yöntem makalesi

Kültürler Hücre Şok Dalga Uygulama

12.5K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/51076

⸱

8 Nisan 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiac Surgery, Innsbruck Medical University, 2Clinic of Anesthesiology, Intensive Care Medicine and Pain Therapy, Goethe-University Hospital

Bu makalede

Özet

Şok dalgaları günümüzde de kendi rejeneratif etkileri bilinmektedir. Bu nedenle in vitro deneyler, giderek artan ilgi çekmektedir. Bu nedenle, böylece rahatsız edici fiziksel etkilerini önlemek vivo koşullarda taklit bize sağlayan in vitro şok dalgası çalışmalarda (IVSWT) için bir model geliştirmiştir.

Özet

Şok dalgaları günümüzde de kendi rejeneratif etkileri bilinmektedir. Temel araştırma bulguları şok dalgaları sonraki herhangi bir zarar vermeden hücreleri ya da hedef dokuya biyolojik bir uyarıcı neden yok olduğunu gösterdi. Bu nedenle, in vitro deneyler, giderek artan ilgi çekmektedir. Hücre kültürleri üzerinde şok dalgaları uygulanması için çeşitli yöntemler tarif edilmiştir. Genel olarak, mevcut tüm modelleri en iyi hücreleri üzerine şok dalgaları uygulamak için nasıl odaklanmak.

Ancak, bu bir soru kalır: Ne hücre kültürü geçtikten sonra dalgalar olur? Hücre kültür ortamının akustik empedans ve ortam havasının fark şok dalgalarının fazla% 99 yansıyan olsun, yüksek! Bu nedenle esas olarak dalgalar hücre kültürünün geçtikten sonra su içinde yayılmasına izin veren bir pleksiglas dahili kabın oluşan bir model geliştirmiştir. Bu kavitasyon etkileri yanı sıra aksi yaklaşan olanları rahatsız olur dalgaların yansımasını önler. WiBu modelde inci biz vivo koşulları taklit ve böylece şok dalgalarının fiziksel uyaran bir biyolojik hücre sinyalinin ("mechanotransduction") tercüme alır nasıl hakkında daha fazla bilgi elde edebiliyoruz.

Giriş

Şok dalgaları enerji, örneğin ani bir sürümü kaynaklanan ses basınç dalgaları vardır. Gök gürültüsü gibi şimşek. Tıpta şok dalgaları böbrek taşlarının dağılması için Böbrek Taşı Kırma 30 yıldır kullanılmaktadır. 1980'lerin başında Lithotripsy hastalarda iliyak kemik kalınlaşması rastlantısal yana, ilk çalışmalar 1 şifa kemik üzerinde şok dalga tedavisi (cc) etkisini değerlendirmek için yapılmıştır. Uzun kemik kaynamamalarının geliştirilmiş şifa etkileyici sonuçları 2 gözlenebilir. Daha sonra, endikasyonları yumuşak doku yaraları 3 genişletildi. Temel araştırma sonuçları şok dalgaları sonraki herhangi bir zarar vermeden, hedef dokuya biyolojik bir uyarıcı neden yok olduğunu gösterdi. Anjiyojenik büyüme faktörleri (örneğin, VEGF, PIGF, FGF) serbest kalır önemli anjiyogenez tarafından takip edilir. Bu işemik patolojiler yönelik endikasyonlar bir başka genişlemesine yol açtı. Bizim grup ve diğerleri pozitif eff gösterdivb hayvan modellerinde, iskemik kalp hastalığı ile ilgili SWT hem de klinik çalışmalarda 4-6.

Ancak, SWT fiziksel uyaran bir biyolojik sinyali (mechanotransduction) çevrilir nasıl tam mekanizması büyük ölçüde bilinmemektedir. Sürekli tıp artar çeşitli alanlardan SWT faiz olarak, mekanizması için arayışı daha fazla ve daha yoğun oluyor. Bu nedenle, in vitro şok dalgası deneyler önem kazanmaktadır. Hayvan deneyleri ve maliyet-etkililik azaltmanın yanında, in vitro şok dalga tedavisi (IVSWT) en büyük avantajı belirli bir hücre tipi belirli davranış okuyan olasılık olabilir. Şok dalgası aracılı doku rejenerasyonu olarak en olası tedavi edilen doku tüm hücreler dahil, hatta sistemik etkileri tartışılmıştır. Bununla birlikte, her bir hücre tipi özel bir rol oynar ve kendi iç işlevi vardır. IVSWT Bu özel fonksiyon a algılamak için bize sağlarnd böylece bize karmaşık yatan süreçlerin daha iyi anlaşılmasını sağlar.

Hücre kültürleri üzerinde şok dalgasının etkileri hakkında Bugünün bilgi çoğalması artış, hücre zarı reseptörlerinin değişiklik, artış ve hücre farklılaşmasının hızlanması, büyüme faktörleri ve kemo-cezbedici salınımını yanı sıra artmış hücre göçü 7-9 içerir.

İn vitro model Hücre kültürleri üzerinde şok dalgaları uygulanması çeşitli yöntemler çoğu dikkat dağıtıcı fiziksel etkileri tarif edilmiştir. Bu durum, hücre uyarımı fiziksel koşullar, bu modeller arasında oldukça farklıdır gibi, sonuçları karşılaştırmak için son derece zordur soruna yol açar. Genel olarak, mevcut tüm modelleri en iyi hücreleri üzerine şok dalgaları uygulamak için nasıl odaklanmak.

Ancak, bu bir soru kalır: Ne hücre kültürü geçtikten sonra dalgalar olur? Asıl sorun olduğunu akustik farkıHücre kültür ortamı ve ortam havasının empedans şok dalgalarının fazla% 99 Şekil 1 yansıyan olsun, bu yüksektir.

Nedeniyle iki ortam akustik empedans farkından dolayı dalgalar yansıtılır değil, aynı hücreler, Şekil 2, 180 ° 'lik bir faz kayması güçlü gerilme kuvvetleri ile sonuçlanan oluşur.

Akustik empedansı, bir malzemenin yoğunluğunun ürünü ve ses hızı Z = ρ x c olarak tanımlanır. Su için akustik empedans hava için sadece 420 Ns / m 3, ZWater = 1440000 Ns / m 3 'tür. Bu iki değer arasında büyük bir fark şok dalgaların yansıma ve faz kayması ile sonuçlanır. Faz kayması bir gerilme dalgası içine bir pozitif basınç darbe döner.

Bu germe gücü, hücre için zararlı değildir bile, in vitro, in vivo şok dalga etkileri taklit fikri ile müdahale. In vivo bugerilme kuvvetleri neredeyse nedeniyle büyük beden yapıları ortaya çıkar.

Ayrıca, dalgalar çalıştıran bile geri gelen olanları rahatsız edebilir. Bu girişime neden olabilir. Girişim iki tip bilinmektedir. Yapıcı girişim hem dalgalar böylece ikiye genlik Şekil 3 neden eklenir demektir. Dalgalar zıt karşılamak durumunda yıkıcı girişim olur. Bu dalgaların kaldırılması (Şekil 3) neden olur. Bu nedenle, IVSWT hücre kültürü geçtikten sonra yaymak için şok dalgaları sağlayan bir model ihtiyacı vardır.

IVSWT su banyosu

Yukarıda belirtilen sorunlardan aşağıdaki noktalara dikkat anlatılan sorunlar Temel olarak, bu şok dalgası uygulayıcının her türlü bağlamak için bir zar ile inşa edilmiş bir pleksiglas bir kap oluşur. Şekil 4 önlemek için bir su banyosu tasarımı götürmektedir. Bu membran ve aplikatör ultrason iletim ge arasında bağlantı içinl kullanılmak zorundadır. Su banyosu gazı su içinde çözülerek ise ortaya çıkabilecek kavitasyon önlemek için gazı giderilmiş su ile doldurulur. Bir kontrol birimine bağlı olan bir sıcaklık sensörü ile altta bir ısıtıcı in vivo koşulları taklit için sıcaklığını düzenlemek için ve işlem sırasında soğutmak için hücre kültürlerinin önlemek sağlar. Bir kuluçka makinesi içinde yapıldığı gibi sıcaklık santigrat 37 derece stabil yapılabilir. Hücre numuneleri için bir tutucu kültür şişesi veya tüp herhangi bir çeker sağlar. Böylece, örnek kabının hava kabarcıkları şok dalgaları engellemek gibi tamamen kültür ortamı ile doldurulması gerekir! Hamamın arka duvarında bir kama şeklindeki susturucu amacıyla yansıyan ve girişimi önlemek için geri çalıştırmak almak için değil dalgalar ortadan kaldırmış.

Diğer IVSWT modellere bir başka avantajı, aplikatör ile kültür şişelerine arasındaki mesafenin farklılaşması olasılığıdır. Bu modeli açıkça s kullanmak Grubumuzun Bulgular ve diğerleriHer hücre tipi farklı tedavi parametrelere çok özel nasıl tepki vereceğini söyledi. Bu şok dalgası uygulayıcının odak ile ilgili olarak belirli bir konumda olmak üzere kontrol hücreleri ile bize sağlar Dahası, dalgaları kaynağı ile örnek arasındaki mesafeyi tanımlayan çok önemlidir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Etik izni

Hastaların Yazılı bilgilendirilmiş izinleri alındıktan sonra, göbek kordonu, insan göbek damarı endotelial hücrelerde (HUVECler) izolasyonu için Kadın Hastalıkları Bölümü'nde sezeryan elde edilmiştir. İzin Innsbruck Tıp Üniversitesi (no. UN4435) etik komitesinden verildi.

1.. IVSWT Su banyosu hazırlayın

  1. Uygun bir tankta musluk suyu 3,5 L hazırlayın. Su (Protokolü: 6), 37 ° C'ye kadar ısıtılması gerekir.
  2. Su seviyesi yaklaşık 3 cm kenarının altına kadar su banyosu içine su doldurun. Tamamen su ile membran kapak Zihin. Bu, yaklaşık olarak hazırlanmış 3.5 L. gerektirir
  3. Güç kaynağına sıcaklık sensörü bağlayın.
  4. Su banyosunun arka duvarında amaçlanan montaj içine sensörünü koyun.
  5. Sıcaklık sensörünün güç kaynağına ısıtma bağlayın. Olmadan bunu yapmayınısıtıcı olarak su banyosunda Pleksiglas eritmek olacaktır.
  6. Su 37 ° C arasında sabit bir sıcaklığa ulaşana kadar bekleyin Su banyosu boyunca sabit sıcaklık garanti sopa çeşit düzenli su karıştırın.

2.. Hücreler ve Kültür şişeler hazırlayın

  1. Bunlar istenen kaynaşmaya kadar ulaştığı, doğrudan T25 kültür şişelerinde ya da kültür şişelerinde hücreler istenilen yoğunlukta gece boyunca tohum hücreleri.
  2. Deneyden önce, dikey olarak şişeler hizalayın.
  3. Sağ onların boyunlarına altına kadar kültür ortamı ile kültür şişeler doldurun. Kontamine alacağı boyun veya kapanış kapağa temas ortamı olarak şişeler içine çok fazla orta doldurmayın.
  4. Su kirliliği önlemek için filtre olmadan katı kapaklar şişeler vida. Banyoda su ve banyo kendisi steril olmadığını akla.
  5. Su banyosu içine sokulmadan önce Parafilm ile kapaklarını sıkıca kapatın.
  6. sağlanan standında mühürlü kültür şişeleri Fix.
  7. Su banyosunun içine sabit şişesi yerleştirin. Hücre kültür şişesi orta şok dalgası aplikatör membranın merkezi olarak aynı yükseklikte olduğu dikkat edin. Banyo tarafında bir çizgi sizi yönlendirir.

3.. Tedavi Parametreler tanımlayın

  1. Şok dalgası kaynağı ve örnek arasındaki mesafe tanımlayın. Şekil 6'da tarif edildiği gibi parametre bulgu Pilot deney ile mükemmel bir tedavi parametrelerini belirlemek.
  2. Şok dalgası aygıtta doğru tedavi parametreleri (enerji akı yoğunluğu, sıklığı) seçin. Yine, Şekil 6'ya bakınız.

4. Şok Dalga Uygulama

  1. Şok dalgası uygulayıcı yanı sıra, su banyosunun zarı üzerinde ticari olarak temin edilebilen ultrasonik iletim jel bol miktarda koyun. Bu kavrama temin etmektir. Resim hava ya da hava kabarcıkları gibi aplikatör ile membran arasında olmalıdırBu şok dalgaları absorbe eder.
  2. Zara aplikatör bağlayın ve zarın merkezinde sabit tutun. Yatay hizalanmış olduğunu dikkat edin.
  3. Su banyosu içine prob doğru dikey konumu gösterilen banyo kenarındaki işaretleme paralel olduğundan emin olun.
  4. Yatay bir çizgi olarak uygulayıcının ve şişe istikrarlı merkezleri tutun.
  5. Şok dalgası cihazı etkinleştirme ve bütün işlem sırasında sabit bir pozisyonda kültür şişesi gibi aplikatör tutarken darbeleri uygulanır.

5.. Sonra Tedavi

  1. Su banyosundan kültür şişesi al.
  2. Ortak kağıt havlu ile kurulayın.
  3. Dezenfekte edici ajanlar ile doğru şişeyi silin.
  4. Parafilm sızdırmazlık ve kapağını çıkarın.
  5. Santrifüj tüplerine matara içinde Orta Pipet.
  6. Uygun santrifüj. Santrifüj parametreleri kullanılan hücre türüne bağlıdır, Örneğin. HUVECler için, oda sıcaklığında, 290 g kullanın.
  7. Şişeye hücre kültür ortamının 5ml ekleyin. Hücre kültürü ortamı ile 2 ml santrifüjlenmiş hücre pelletini. Şişeye süspansiyonu pipetle. Böylece, tedavi sırasında müstakil olabilir hücre fragmanları ya da hücrelerin kaybolmak yok.

Tuzaklar

  1. Preparasyon hem de muamele hücre kültürü kirlenmesini önlemek için laminar akış içinde steril koşullar altında gerçekleştirilmelidir.
  2. İyi hücre kültürü uygulamaları prob kirlenmesini önlemek için tavsiye edilir. Özel olarak, şişe dış dezenfeksiyonu güçlü geri inkübatör yerleştirmeden önce önerilir. Su banyosu, hem de su içinde, steril değil!
  3. Su banyosu banyo inşa pleksiglas zarar görmesini önlemek için su ile doldurulur sürece güç kaynağına ısıtıcı takmayın.
  4. Şok dalgası İçi üzerinde ultrason jeli bol miktarda kullanınicator banyoya doğru kavrama ve dalga yayılımı garanti. Hava ve hatta küçük hava kabarcıkları şok dalgaları absorbe yapın!
  5. Tüm büyüme alanı tedavisini sağlamak için bir aplikatör ile ilgili olarak su banyosu içindeki sondaların konumunu kontrol edin.
  6. Kontaminasyonu önlemek için çok derin suya sondaları dunk etmeyin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Kordon Biz önceden izole edilmiş, insan göbek bağı damarı endotel hücrelerine şok dalgaları uygulanan tarif edilen yöntem (HUVECler) kullanılması. Göbek kordonları elektif sezaryen bölümlerden elde edildi.

HUVEC'ler bir elektrohidrolik şok dalga tedavisi sistemi ile bir T25 hücre kültürü şişesi içinde% 90 bir izdiham tedavi edildi. Tedavi parametreleri 0.1 mJ / mm 2 ve 5 Hz'lik bir frekansta bir enerji akı yoğunluğu idi. 300 darbeleri şok dalgası kaynağından 5 cm'lik b...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

In vitro şok dalgası tedavisi için önerilen modelin önemi dalgaları mevcut modelleri aksine, hücre kültürü geçtikten sonra, yayılan bir gerçektir. Böylece, gerilme kuvvetleri gibi rahatsız edici bir fiziksel etkileri önlenebilir. Bu model daha yakından diğerleri doğrudan hücre kültürü şişelerine dalgaları uygulayarak daha vivo koşullarda benzer.

Diğer bir avantaj şok dalgası kaynağı ve hücreler arasındaki mesafe değişen olasılığıdır. Doğrudan bir kültür şişesi tedavi, bu mü...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

Yazarlar bu model için ilham için Reiner Schultheiss ve Wolfgang Schaden teşekkür ederim. Biz aynı zamanda araştırma desteklemek için onun her zaman muazzam çabaları için Hıristiyan Dorfmüller teşekkür ederim.

Bizim fikirlerin dikkatli bir teknik gerçekleşmesi için Robert GÖSCHL ve Hans Hohenegger için çok teşekkürler!

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Orthogold şok dalgası cihazıDoku Rejenerasyon Teknolojileri, Woodstock, GA – MTS-Europe GmbH, Konstanz, Almanya
tarafından üretilmiştir IVSWT Su Banyosu V2.0Johann Hohenegger - Teknik Ürünler
EBM-2 Bazal Orta 500 m +EGM-2 SingleQuot Suppl. & Büyüme FaktörleriLonzaCC-3156 & CC-4176Bu besiyeri, hücre kültürü şişesini doldurmak için HUVEC'lerle gösterilen deneyler için kullanıldı. Diğer hücre türleri için önerilen ortamı kullanın.
Pechiney  Parafilm M PM996Pechiney Plastik AmbalajPH-LF-PM996-EA at labplanet.com şişelerinsızdırmazlığı için
Falcon Serolojik pipetler 25 mlBecton Dickinson Labware357525
CellMate II Serolojik Pipet;Matrix Technologies
Skintact Ultrasonik JelSkintactUL-01 250 ml
T25 Hücre kültürü şişeleriCOSTAR3056
Mikrozid dezenfektanSchü lke
3,5 L Gazdan arındırılmış su
Kağıt havlu

Kaynaklar

  1. Haupt, G., Haupt, A., Ekkernkamp, A., Gerety, B., Chvapil, M. Influence of shock waves on fracture healing. Urology. 39, 529-532 (1992).
  2. Schaden, W., Fischer, A., Sailler, A. Extracorporeal shock wave therapy of nonunion or delayed osseous union. Clin. Orthop. Relat. Res. 387, 90-94 (2001).
  3. Schaden, W., et al. Shock wave therapy for acute and chronic soft tissue wounds: a feasibility study. J. Surg. Res. 143, 1-12 (2007).
  4. Tepeköylü, C., et al. Shock wave treatment induces angiogenesis and mobilizes endogenous CD31/CD34-positive endothelial cells in a hindlimb ischemia model: Implications for angiogenesis and vasculogenesis. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 146, 971-978 (2013).
  5. Nishida, T., et al. Extracorporeal cardiac shock wave therapy markedly ameliorates ischemia-induced myocardial dysfunction in pigs in vivo. Circulation. 110, 3055-3061 (2004).
  6. Fukumoto, Y., et al. Extracorporeal cardiac shock wave therapy ameliorates myocardial ischemia in patients with severe coronary artery disease. Coron. Artery Dis. 17, 63-70 (2006).
  7. Gotte, G., Amelio, E., Russo, S., Marlinghaus, E., Musci, G., Suzuki, H. Short-time non-enzymatic nitric oxide synthesis from L-arginine and hydrogen peroxide induced by shock waves treatment. FEBS Lett. 520, 153-155 (2002).
  8. Wang, F. S., Wang, C. J., Huang, H. J., Chung, H., Chen, R. F., Yang, K. D. Physical shock wave mediates membrane hyperpolarization and Ras activation for osteogenesis in human bone marrow stromal cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 287, 648-655 (2001).
  9. Mittermayr, R., et al. Extracorporeal shock wave therapy (ESWT) minimizes ischemic tissue necrosis irrespective of application time and promotes tissue revascularization by stimulating angiogenesis. Ann. Surg. 253, 1024-1032 (2011).
  10. Baker, M., et al. Use of the mouse aortic ring assay to study angiogenesis. Nat. Protoc. 22, 89-104 (2011).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

H cre K lt r UygulamasUltrason Jel KuplajSu Banyosu KurulumuGer ek Zamanl PCRSitokin Dizisi AnaliziEndotel H cre ProliferasyonuMekanotransd ksiyon S reciok Dalgas Yans mas ndan Ka nmaIn Vitro Deney Modeli

İlgili makaleler