Özet

Özet

Şok dalgaları günümüzde de kendi rejeneratif etkileri bilinmektedir. Bu nedenle in vitro deneyler, giderek artan ilgi çekmektedir. Bu nedenle, böylece rahatsız edici fiziksel etkilerini önlemek vivo koşullarda taklit bize sağlayan in vitro şok dalgası çalışmalarda (IVSWT) için bir model geliştirmiştir.

Abstract

Şok dalgaları günümüzde de kendi rejeneratif etkileri bilinmektedir. Temel araştırma bulguları şok dalgaları sonraki herhangi bir zarar vermeden hücreleri ya da hedef dokuya biyolojik bir uyarıcı neden yok olduğunu gösterdi. Bu nedenle, in vitro deneyler, giderek artan ilgi çekmektedir. Hücre kültürleri üzerinde şok dalgaları uygulanması için çeşitli yöntemler tarif edilmiştir. Genel olarak, mevcut tüm modelleri en iyi hücreleri üzerine şok dalgaları uygulamak için nasıl odaklanmak.

Ancak, bu bir soru kalır: Ne hücre kültürü geçtikten sonra dalgalar olur? Hücre kültür ortamının akustik empedans ve ortam havasının fark şok dalgalarının fazla% 99 yansıyan olsun, yüksek! Bu nedenle esas olarak dalgalar hücre kültürünün geçtikten sonra su içinde yayılmasına izin veren bir pleksiglas dahili kabın oluşan bir model geliştirmiştir. Bu kavitasyon etkileri yanı sıra aksi yaklaşan olanları rahatsız olur dalgaların yansımasını önler. WiBu modelde inci biz vivo koşulları taklit ve böylece şok dalgalarının fiziksel uyaran bir biyolojik hücre sinyalinin ("mechanotransduction") tercüme alır nasıl hakkında daha fazla bilgi elde edebiliyoruz.

Introduction

Şok dalgaları enerji, örneğin ani bir sürümü kaynaklanan ses basınç dalgaları vardır. Gök gürültüsü gibi şimşek. Tıpta şok dalgaları böbrek taşlarının dağılması için Böbrek Taşı Kırma 30 yıldır kullanılmaktadır. 1980'lerin başında Lithotripsy hastalarda iliyak kemik kalınlaşması rastlantısal yana, ilk çalışmalar 1 şifa kemik üzerinde şok dalga tedavisi (cc) etkisini değerlendirmek için yapılmıştır. Uzun kemik kaynamamalarının geliştirilmiş şifa etkileyici sonuçları 2 gözlenebilir. Daha sonra, endikasyonları yumuşak doku yaraları 3 genişletildi. Temel araştırma sonuçları şok dalgaları sonraki herhangi bir zarar vermeden, hedef dokuya biyolojik bir uyarıcı neden yok olduğunu gösterdi. Anjiyojenik büyüme faktörleri (örneğin, VEGF, PIGF, FGF) serbest kalır önemli anjiyogenez tarafından takip edilir. Bu işemik patolojiler yönelik endikasyonlar bir başka genişlemesine yol açtı. Bizim grup ve diğerleri pozitif eff gösterdivb hayvan modellerinde, iskemik kalp hastalığı ile ilgili SWT hem de klinik çalışmalarda 4-6.

Ancak, SWT fiziksel uyaran bir biyolojik sinyali (mechanotransduction) çevrilir nasıl tam mekanizması büyük ölçüde bilinmemektedir. Sürekli tıp artar çeşitli alanlardan SWT faiz olarak, mekanizması için arayışı daha fazla ve daha yoğun oluyor. Bu nedenle, in vitro şok dalgası deneyler önem kazanmaktadır. Hayvan deneyleri ve maliyet-etkililik azaltmanın yanında, in vitro şok dalga tedavisi (IVSWT) en büyük avantajı belirli bir hücre tipi belirli davranış okuyan olasılık olabilir. Şok dalgası aracılı doku rejenerasyonu olarak en olası tedavi edilen doku tüm hücreler dahil, hatta sistemik etkileri tartışılmıştır. Bununla birlikte, her bir hücre tipi özel bir rol oynar ve kendi iç işlevi vardır. IVSWT Bu özel fonksiyon a algılamak için bize sağlarnd böylece bize karmaşık yatan süreçlerin daha iyi anlaşılmasını sağlar.

Hücre kültürleri üzerinde şok dalgasının etkileri hakkında Bugünün bilgi çoğalması artış, hücre zarı reseptörlerinin değişiklik, artış ve hücre farklılaşmasının hızlanması, büyüme faktörleri ve kemo-cezbedici salınımını yanı sıra artmış hücre göçü 7-9 içerir.

İn vitro model Hücre kültürleri üzerinde şok dalgaları uygulanması çeşitli yöntemler çoğu dikkat dağıtıcı fiziksel etkileri tarif edilmiştir. Bu durum, hücre uyarımı fiziksel koşullar, bu modeller arasında oldukça farklıdır gibi, sonuçları karşılaştırmak için son derece zordur soruna yol açar. Genel olarak, mevcut tüm modelleri en iyi hücreleri üzerine şok dalgaları uygulamak için nasıl odaklanmak.

Ancak, bu bir soru kalır: Ne hücre kültürü geçtikten sonra dalgalar olur? Asıl sorun olduğunu akustik farkıHücre kültür ortamı ve ortam havasının empedans şok dalgalarının fazla% 99 Şekil 1 yansıyan olsun, bu yüksektir.

Nedeniyle iki ortam akustik empedans farkından dolayı dalgalar yansıtılır değil, aynı hücreler, Şekil 2, 180 ° 'lik bir faz kayması güçlü gerilme kuvvetleri ile sonuçlanan oluşur.

Akustik empedansı, bir malzemenin yoğunluğunun ürünü ve ses hızı Z = ρ x c olarak tanımlanır. Su için akustik empedans hava için sadece 420 Ns / m 3, ZWater = 1440000 Ns / m 3 'tür. Bu iki değer arasında büyük bir fark şok dalgaların yansıma ve faz kayması ile sonuçlanır. Faz kayması bir gerilme dalgası içine bir pozitif basınç darbe döner.

Bu germe gücü, hücre için zararlı değildir bile, in vitro, in vivo şok dalga etkileri taklit fikri ile müdahale. In vivo bugerilme kuvvetleri neredeyse nedeniyle büyük beden yapıları ortaya çıkar.

Ayrıca, dalgalar çalıştıran bile geri gelen olanları rahatsız edebilir. Bu girişime neden olabilir. Girişim iki tip bilinmektedir. Yapıcı girişim hem dalgalar böylece ikiye genlik Şekil 3 neden eklenir demektir. Dalgalar zıt karşılamak durumunda yıkıcı girişim olur. Bu dalgaların kaldırılması (Şekil 3) neden olur. Bu nedenle, IVSWT hücre kültürü geçtikten sonra yaymak için şok dalgaları sağlayan bir model ihtiyacı vardır.

IVSWT su banyosu

Yukarıda belirtilen sorunlardan aşağıdaki noktalara dikkat anlatılan sorunlar Temel olarak, bu şok dalgası uygulayıcının her türlü bağlamak için bir zar ile inşa edilmiş bir pleksiglas bir kap oluşur. Şekil 4 önlemek için bir su banyosu tasarımı götürmektedir. Bu membran ve aplikatör ultrason iletim ge arasında bağlantı içinl kullanılmak zorundadır. Su banyosu gazı su içinde çözülerek ise ortaya çıkabilecek kavitasyon önlemek için gazı giderilmiş su ile doldurulur. Bir kontrol birimine bağlı olan bir sıcaklık sensörü ile altta bir ısıtıcı in vivo koşulları taklit için sıcaklığını düzenlemek için ve işlem sırasında soğutmak için hücre kültürlerinin önlemek sağlar. Bir kuluçka makinesi içinde yapıldığı gibi sıcaklık santigrat 37 derece stabil yapılabilir. Hücre numuneleri için bir tutucu kültür şişesi veya tüp herhangi bir çeker sağlar. Böylece, örnek kabının hava kabarcıkları şok dalgaları engellemek gibi tamamen kültür ortamı ile doldurulması gerekir! Hamamın arka duvarında bir kama şeklindeki susturucu amacıyla yansıyan ve girişimi önlemek için geri çalıştırmak almak için değil dalgalar ortadan kaldırmış.

Diğer IVSWT modellere bir başka avantajı, aplikatör ile kültür şişelerine arasındaki mesafenin farklılaşması olasılığıdır. Bu modeli açıkça s kullanmak Grubumuzun Bulgular ve diğerleriHer hücre tipi farklı tedavi parametrelere çok özel nasıl tepki vereceğini söyledi. Bu şok dalgası uygulayıcının odak ile ilgili olarak belirli bir konumda olmak üzere kontrol hücreleri ile bize sağlar Dahası, dalgaları kaynağı ile örnek arasındaki mesafeyi tanımlayan çok önemlidir.

Protocol

Etik izni Hastaların Yazılı bilgilendirilmiş izinleri alındıktan sonra, göbek kordonu, insan göbek damarı endotelial hücrelerde (HUVECler) izolasyonu için Kadın Hastalıkları Bölümü'nde sezeryan elde edilmiştir. İzin Innsbruck Tıp Üniversitesi (no. UN4435) etik komitesinden verildi. 1.. IVSWT Su banyosu hazırlayın Uygun bir tankta musluk suyu 3,5 L hazırlayın. Su (Protokolü: 6), 37 ° C'ye kadar ısıtılması gerekir. </l…

Representative Results

Kordon Biz önceden izole edilmiş, insan göbek bağı damarı endotel hücrelerine şok dalgaları uygulanan tarif edilen yöntem (HUVECler) kullanılması. Göbek kordonları elektif sezaryen bölümlerden elde edildi. HUVEC'ler bir elektrohidrolik şok dalga tedavisi sistemi ile bir T25 hücre kültürü şişesi içinde% 90 bir izdiham tedavi edildi. Tedavi parametreleri 0.1 mJ / mm 2 ve 5 Hz'lik bir frekansta bir enerji akı yoğunluğu idi. 300 darbeleri şok dalgas…

Discussion

In vitro şok dalgası tedavisi için önerilen modelin önemi dalgaları mevcut modelleri aksine, hücre kültürü geçtikten sonra, yayılan bir gerçektir. Böylece, gerilme kuvvetleri gibi rahatsız edici bir fiziksel etkileri önlenebilir. Bu model daha yakından diğerleri doğrudan hücre kültürü şişelerine dalgaları uygulayarak daha vivo koşullarda benzer.

Diğer bir avantaj şok dalgası kaynağı ve hücreler arasındaki mesafe değişen olasılığıdır….

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar bu model için ilham için Reiner Schultheiss ve Wolfgang Schaden teşekkür ederim. Biz aynı zamanda araştırma desteklemek için onun her zaman muazzam çabaları için Hıristiyan Dorfmüller teşekkür ederim.

Bizim fikirlerin dikkatli bir teknik gerçekleşmesi için Robert GÖSCHL ve Hans Hohenegger için çok teşekkürler!

Materials

Orthogold shock wave device Tissue Regeneration Technologies, Woodstock, GA – manufactured by MTS-Europe GmbH, Konstanz, Germany
IVSWT Water Bath V2.0 Johann Hohenegger – Technical Products
EBM-2 Basal Medium 500 m +EGM-2 SingleQuot Suppl.&Growth Factors Lonza CC-3156 & CC-4176 This medium was used for the shown experiments with HUVECs to fill the cell culture flask. For other cell types, use the recommended medium.
Pechiney Parafilm M PM996 Pechiney Plastic Packaging PH-LF-PM996-EA at labplanet.com for sealing flasks
Falcon Serological pipets 25ml Becton Dickinson Labware 357525
CellMate II Serological Pipette  Matrix Technologies
Skintact Ultrasonic Gel Skintact UL-01 250 ml
T25 cell culture flasks COSTAR 3056
mikrozid disinfectant Schülke
3,5l degassed water
paper towels

Referanslar

  1. Haupt, G., Haupt, A., Ekkernkamp, A., Gerety, B., Chvapil, M. Influence of shock waves on fracture healing. Urology. 39, 529-532 (1992).
  2. Schaden, W., Fischer, A., Sailler, A. Extracorporeal shock wave therapy of nonunion or delayed osseous union. Clin. Orthop. Relat. Res. 387, 90-94 (2001).
  3. Schaden, W., et al. Shock wave therapy for acute and chronic soft tissue wounds: a feasibility study. J. Surg. Res. 143, 1-12 (2007).
  4. Tepeköylü, C., et al. Shock wave treatment induces angiogenesis and mobilizes endogenous CD31/CD34-positive endothelial cells in a hindlimb ischemia model: Implications for angiogenesis and vasculogenesis. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 146, 971-978 (2013).
  5. Nishida, T., et al. Extracorporeal cardiac shock wave therapy markedly ameliorates ischemia-induced myocardial dysfunction in pigs in vivo. Circulation. 110, 3055-3061 (2004).
  6. Fukumoto, Y., et al. Extracorporeal cardiac shock wave therapy ameliorates myocardial ischemia in patients with severe coronary artery disease. Coron. Artery Dis. 17, 63-70 (2006).
  7. Gotte, G., Amelio, E., Russo, S., Marlinghaus, E., Musci, G., Suzuki, H. Short-time non-enzymatic nitric oxide synthesis from L-arginine and hydrogen peroxide induced by shock waves treatment. FEBS Lett. 520, 153-155 (2002).
  8. Wang, F. S., Wang, C. J., Huang, H. J., Chung, H., Chen, R. F., Yang, K. D. Physical shock wave mediates membrane hyperpolarization and Ras activation for osteogenesis in human bone marrow stromal cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 287, 648-655 (2001).
  9. Mittermayr, R., et al. Extracorporeal shock wave therapy (ESWT) minimizes ischemic tissue necrosis irrespective of application time and promotes tissue revascularization by stimulating angiogenesis. Ann. Surg. 253, 1024-1032 (2011).
  10. Baker, M., et al. Use of the mouse aortic ring assay to study angiogenesis. Nat. Protoc. 22, 89-104 (2011).

Play Video

Bu Makaleden Alıntı Yapın
Holfeld, J., Tepeköylü, C., Kozaryn, R., Mathes, W., Grimm, M., Paulus, P. Shock Wave Application to Cell Cultures. J. Vis. Exp. (86), e51076, doi:10.3791/51076 (2014).

View Video