Yöntem makalesi

Otomatik Ayırma C. elegans Değişken derecelerde Bakteriyel Patojen tarafından kolonileştirildiğini

DOI:

10.3791/51090

⸱

21 Mart 2014

 ,  , 
1Department of Integrative Biology, University of California, Berkeley

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wormsorter floresan gazetecilere ifadeye göre solucanlar sıralayarak Caenorhabditis elegans genetik ekranları kolaylaştırır. Burada, yeni bir kullanımını tanımlamak: GFP-ifade patojen tarafından kolonizasyon göre sıralama, ve biz bağışıklık tepkilerini başlatarak patojen tanıma anlaşılamamıştır rolünü incelemek için istihdam.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wormsorter Caenorhabditis elegans çalışmalarda kullanılan bir FACS makinesine benzer bir alettir, tipik olarak bir flüoresan raportör ekspresyonu göre solucanlar sıralamak. Burada, bir GFP-ifade patojenin kolonizasyon derecelerine göre solucanlar sıralama için bu aletin alternatif bir kullanım gelmek. Bu yeni kullanım ki, bu solucan bağırsak ve bağışıklık sisteminin indüksiyonunun kolonizasyon arasındaki ilişkiyi ele bırakıldı. Ederken C. farklı patojenlere elegans bağışıklık yanıtları, bunları başlatır ne hala bilinmiyor, dokümante edilmiştir. (Birbirini dışlayan değil) iki ana olasılık patojen ilişkili moleküler desen tanıma ve enfeksiyona neden hasar tespiti vardır. Iki olasılık arasında ayrım için, patojene maruz sebep olduğu hasar ayrılmış olmalıdır. Gram-n tarafından yaygın-kolonize edildi solucanlar wormsorter etkin ayrılıkkolonize benzer maruz bırakıldı solucanlardan muhtemel patojen yükün yol açtığı hasar, ancak, ya da marjinal, ile egative patojen Pseudomonas aeruginosa,. Bu farklı popülasyonlar patojen yük ve transkripsiyonel bağışıklık tepkilerinin indüklenmesinde arasındaki ilişkiyi değerlendirmek için kullanıldı. Sonuçlar, iki patojen tanıma olasılığını destek, ayrışmış olduğunu göstermektedir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Otomatik solucan sıralama, bir tüp içinde düzleştirilmiş geçtikçe (genellikle raportör proteinlerin transgenik ekspresyonu tarafından sağlanan) bir solucan bir flüoresan sinyal ölçümü ile çalışan yönlendirme ya da bir toplama tüpüne / oyuk ya da bir atık kabına göre sağlayan, çok FACS gibidir araştırmacı 1 tarafından belirlenen parametreleri yolluk için. Wormsorter birçok yönden araştırma kolaylaştırabilir; analitik bir araç olarak kullanan bir örnek neredeyse 1.000 genler 2 için yükseltici faaliyet zamanmekansal modellerini takip eden bir çalışmadır.
Bununla birlikte, wormsorter en önemli kullanım hedef gen ekspresyon düzeyleri veya solucanın 3-5 ekseni boyunca floresan protein lokalizasyonu sonra, genetik ekranlar yer almaktadır.

Burada, bir floresan etiketli patojenin solucanın kolonizasyonu Aşağıdaki, wormsorter için yeni bir uygulama açıklanmaktadır. Bu bir araç olarak biz Pathog arasındaki ilişkiye odaklanmıştırkolonizasyon / yük ve immün yanıt tr, solucan bağışıklık tepkilerinin başlamasından sorumlu mekanizmalarına yeni anlayışlar kazanmak için.

Bugüne kadar incelenen hemen hemen tüm organizmalarda, mikrobiyal patojenlere karşı doğal bağışıklık tepkilerinin başlaması patojen ilişkili moleküler desenleri (PAMPs) tanınması bağlıdır, ve / veya tehlike / zarar-ilişkili moleküler desenleri (sönümlendirir) 6,7. Mikrobiyal hücre duvarı olarak, flagellum'un, ya da lipid çift katlı 6 bileşenlerini içerir ilk korunmuş mikrobiyal yapılar, ikinci, hem de serbest molekülleri (örneğin ATP 8), değiştirilmiş proteinler veya değiştirilmiş hücresel süreçlerin 9,10 diğer işaretleri içerir. Sinyallerin iki tip spesifik üzerine bir desen molekülün bağlanma koruyucu bir tepki yol açan olaylar zincirini aktive örüntü tanıma reseptörleri (PRR) olarak belirlenen proteinler tarafından tanınır. C'yi elegans bir TRACTA olarak son derece yararlı olmuşturble modeli konak-patojen etkileşimleri çeşitli yönlerini incelemek, ama iyi anlaşılmış değildir bir şey bağışıklık tepkileri solucan başlatılan nasıl da. Diğer organizmalarda eden örüntü tanıma reseptöleri (PRR) hiç ortolog olan farazi reseptör hiçbiri PAMPs bağlandığı gösterilmiştir ve diğer organizmalarda bağışıklık yanıtları için önemli olan PRRS en ortologlar birçok solucan patojen tepkilerinin şaşırtıcı bir şekilde sınırlı bir katkı göstermektedir ve direnç. Örneğin Gram pozitif patojenler direnç göstermek için gerekli olan Drosophila Toll reseptör, C temsil edilir belirten verilerle kombine ancak test edilen diğer Gram-negatif ya da-pozitif patojenlerin 11,12 dan, Gram negatif bir patojen Salmonella Typhimurium 11 korunmasına katkıda bulunur. Bu gözlemler, bir tek homolog, tol-1, ile elegans bu bağışıklık tepkileri Hücresel protein için h bozarak neden olabilirled gibi bazı önermek için o C. elegans öncelikle sönümlendirir 9,13,14 algılar. Bununla birlikte, bağışıklık karşılıklarının uyarılması için ölü patojenlerin yeteneğini tarif raporları PAMP bağlayıcı C'de patojen tanınmasında önemli bir role sahip olabileceğini göstermektedir elegans 15,16. Yaş-senkronize genetik özdeş C bağışıklık yanıtları odaklanarak Önceki iş elegans nüfus, bakteri Gram-negatif patojen Pseudomonas aeruginosa tarafından intestinal kolonizasyonu büyük bireysel değişkenlik gösterdi.

Ancak, transkripsiyonel profilleme çalışmaları bir varlık 17,18 olarak bu değişken-kolonize popülasyonları tedavi. Bu değişkenlik yararlanan, GFP-ifade P. maruz Caenorhabditis elegans farklı şekilde kolonize popülasyonları ayırmak için otomatik bir wormsorter odaklanan bir protokol geliştirdi aeruginosa. Farklı sömürgeleştirilen toplumlarda gen ifadesini li incelenmesipatojen yük (ve ilişkili hasar) ve immün yanıtları ve C patojen tanıma konusunda sağlanan yeni anlayışlar arasındaki ilişkinin değerlendirilmesi litated elegans 19. Biz herhangi bir floresan etiketli patojen ile enfekte solucanlar sıralamak için uygulanan olabilir protokolü, tanımlayacağız.

Potansiyel kullanıcılar için dizildi gereken kurtların sayısı sayılır kullanımında müteakip analizler ve protokoller niteliğine bağlı olduğu unutulmamalıdır. Örneğin, mikro-dizi gen ekspresyon analizi durumunda,> 1000 solucanlar standart protokoller kullanıldığında, yeterli RNA elde etmek için gerekli, ancak amplifikasyon kullanılması halinde ~ 100 solucanlar yeterli olacaktır, malzemenin hızlı bir koleksiyon sağlar ve bu nedenle stres en aza indirmek solucanlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1.. Genç Yetişkin Hayvanlar bir Senkronize Kültürü Edinme

  1. OP50-1 E. ile ekildi birkaç NGM plakalar üzerinde solucanlar büyütün coli bakterisinin (10x doymuş bir kültürden konsantre) birçok solucan gebe aşamasına kadar.
  2. Senkronize bir kültürü (yumurta) elde etmek için yumurta hazırlık solüsyonu ile gebe hayvanları tedavi.
  3. Çok sayıda 60 mm plakalar NGM levhalar yumurta kabaca 150-200 yumurta / levha yoğunluğunda 10x konsantre OP50-1 ile tohumlandı.
  4. (- Küçük yetişkin aşamada solucanlar L4 ulaşana kadar) 2 gün boyunca 25 ° C'de inkübe edin.

2. Pseudomonas aeruginosa Plates hazırlanması ve Worms bulaşıyor

  1. Yumurta-prep (adım 1.1) de günde 100 ug / ml 'lik bir nihai konsantrasyonda King B içeren bir ortamda rifampisin, 2 ml bir PA14 :: GFP kültürü inoküle. Ajitasyon O / N 37 ° C 'de kültür inkübe
  2. PA14 :: GFP cul PlateDeney için gerekli olduğu kadar çok yavaş öldürme Plakalar (SKP) üzerine Ture. Her 150 mm SKP Petri pipet üzerinde 75-100 doymuş kültür ul ve steril cam bir dağıtıcı ile yayılır. 20-24 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  3. Inkübatör plakaları kaldırmak ve onları RT (~ 20 dk) soğumaya bırakın. M9 tampon kullanarak, PA14 üzerine adım 1.4 solucanlar yıkama :: GFP plakaları bir sıvı minimal hacimde. 150 mm tabak kullanırken, birkaç yüz solucanlar, tek bir plaka üzerine yerleştirilebilir.
  4. 18-21 saat boyunca 25 ° C'de inkübe edin. P. için aeruginosa maruz kalan genç erişkin solucanlar, bu noncolonized hayvanların vs kolonize optimal dağılımını görüntüleyen zaman penceresi olduğunu.

3. Wormsorter ayarlama

Örnek sıralama yapmadan önce, makinenin düzgün çalıştığından emin olun. Detaylar http://www.unionbio.com/support/documents.aspx?id=43 elde, ve inci olabilire gerekli adımlar aşağıda özetlenmiştir.

  1. Yaklaşık 5 psi (4.5-5.5 aralığı) için kılıf valf basıncını ayarlayın.
  2. Bu kılıf sıvı akış hızı uygun doğrulamak dağıtıcının altında bir 15 ml konik tüp yerleştirmek, kılıf vana açmak ve sıralayıcı vanasını kapatın. 60 saniye için dağıtıcı tüpü altında tutun. Tüp içinde hacmi 9-10 ml olmalıdır. Bu aralığın dışında ise, buna kılıf valf basıncını ayarlamak.
  3. (Adım 3.2 olarak ayarlanmış) bu kılıf sıvısı akış hızı 40 um kontrol parçacıkları kullanarak sıralama oranı test, doğru sıralamayı sağlayacak sağlamak için:
  4. Kılıf vanasını kapatın. Hazneye kontrol parçacık çözeltisi yaklaşık 25 ml ilave edilir.
  5. Kılıf vana ve numune vana açın.
  6. Bilgisayar yazılımı, "kontrol parçacık modu" gidin ve Al'ı tıklatın.
  7. Parçacık akış hızı genişliğine yakın bir TOF (uçuş süresi) ile, ~ 5-8 parçacıklar / sn olduğundan emin olunParçacığın, 40 um. Böyle bir TOF tek bir 40 um amacı, bir zamanda geçerek olduğunu gösterir. Değerleri bu aralığın dışında ise, buna göre (yukarıdaki yönergelerle) ayarlarını yapın.

4. Noncolonized Worms vs kolonileştirildiğini, sıralama

  1. M9 kullanarak, 15 ml'lik konik tüplere solucanlar yıkayın. Yetişkin solucanlar yerçekimiyle tüpün dibine çöker ve süpernatant kaldırmak için izin verin. Taze M9 ile tüp doldurun. Bu işlemi 3-4x tekrarlayın. Bu, larva büyük bir kısmı hem de aşırı bakteri yok eder ve yaklaşık 10 dakika sürer.
  2. Bir yavaşça karıştırma küçük karıştırma çubuğu ile wormsorter rezervuar solucanlar ekleyin.
  3. 200 600 Yeşil PMT ayarlama ve Kırmızı ve Sarı PMT tarafından ilk sinyal kazancı ayarlayın.
  4. Ayarlarını yapmak için veri elde başlayın.
  5. Saniyede 25-30 olaylar (solucanlar) bir çeşit oranı hedefliyoruz. Sayısı hızı çok yüksek ise, buna göre M9 ile rezervuar içinde solucanlar seyreltin. Oranı iseo düşük, M9 küçük bir hacimde daha solucanlar ekleyin.
  6. Deney noncolonized solucanlar vs kolonize çok sıkı ayrılığı gerektiriyorsa, "tesadüf kontrol" için "saf" olarak ayarlayın. Bu olay iki nesne birbirine çok yakın olması veya aynı açılan, makine yerine toplamaktan daha düşüş reddeder sağlar.
  7. , Ilgi nüfusu sıralamak boyutunu (erişkin solucanlar elde etmek için) ve (noncolonized düşük kolonize için yani yüksek) floresan yoğunluğunu gösteren eksenleri etrafında kapıları çizmek için. Floresan yolluk için değerler deneysel olarak tespit edilmelidir.
  8. Solucanlar başlamak üzere sıralama sıralama vanasını açın solucanları toplamak için bir çok plaka veya dağıtıcı altında bir Petri kabı yerleştirin.
  9. Kriteri nüfus ilgi nüfusu mikroskop altında doğrulamak için hayvanların küçük bir nüfusa toplayın. Eğer değilse, buna göre yolluk parametrelerini ayarlamak ve örnek toplama ile devam ediyor.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yaştaki zaman, genetik olarak özdeş C. elegans P. maruz aeruginosa, geniş bir dağıtım kolonizasyon (Şekil 1A) seviyeleri gözlenir. Kolonize solucanlardan noncolonized verimli ayırma (Şekil 1 B) elde edilebilir, burada açıklanan protokolü yardımıyla. Noncolonized solucanlar aksine, sömürgeleştirilmiş solucanlar gibi uyuşukluk ve azaltılmış dışkılama 19 olarak hasar belirtileri göstermektedir. İkincisi solucanlar P. tarafından kolonize bir nedeni olab...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz tarif yöntemi solucanı ve çevre arasındaki etkileşimleri takip etmek, solucanın dışında kişilerin floresan etiketleme yararlanır. Sunduğumuz durumda, ayırma, bir patojenin etiketleme dayanmaktadır ve hiçbir (veya ışık) yük olan ağır patojen yük ayrı solucanlar için istihdam edilmiştir. Sonraki gen ekspresyon analizleri onlar patojen yük bağımsız olduğunu düşündüren iki grup arasında bağışıklık yanıtlarında fark bulunamadı. Yanıtı başlatan sinyal fiziksel olarak, bu sinyal, PAMP olabileceğini düşündürmektedir yerine ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar verdikleri destek için Ellison Tıp Vakfı ederim. Biz wormsorter kullanarak yardım için Abby Dernburg laboratuvar üyelerine teşekkür etmek de isterdim.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
EvdeM9 Tamponu
RifampicinSigmaR3501'de
Evdeyumurta hazırlama solüsyonu50 ml su; 40 ml çamaşır suyu; 10 ml 10 N sodyum hidroksit
EvdeNGM plakalarıEvde hazırlanan
wormbook.org SKP'de tarifTarif NGM ile aynı, sadece% 0.35 pepton% 0.25
kontrol test parçacıklarıUnion Biometrica310-5071-001
hazırlanan wormbook.org tarif hazırlanan hazırlanan

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pulak, R. Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system. Methods Mol. Biol. , 275-286 (2006).
  2. Dupuy, D., et al. Genome-scale analysis of in vivo spatiotemporal promoteractivity in Caenorhabditis elegans. Nat. Biotechnol. 25, 663-668 (2007).
  3. Squiban, B., Belougne, J., Ewbank, J., Zugasti, O. Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in elegans. J. Vis. Exp. (60), (2012).
  4. Doitsidou, M., Flames, N., Lee, A. C., Boyanov, A., Hobert, O. Automated screening for mutants affecting dopaminergic-neuron specification in C. elegans. Nat. Methods. 5, 869-872 (2008).
  5. Pujol, N., et al. Distinct innate immune responses to infection and wounding in the C. elegans epidermis. Curr. Biol. 18, 481-489 (2008).
  6. Medzhitov, R., Janeway, C. Innate immune recognition: mechanisms and pathways. Immunol. Rev. 173, 89-97 (2000).
  7. Matzinger, P. Tolerance, danger, and the extended family. Annu. Rev. Immunol. 12, 991-1045 (1994).
  8. Mariathasan, S., et al. Cryopyrin activates the inflammasome in response to toxins and ATP. Nature. 440, 228-232 (2006).
  9. Melo, J. A., Ruvkun, G. Inactivation of conserved C. elegans genes engages pathogen- and xenobiotic-associated defenses. Cell. 149, 452-466 (2012).
  10. Chen, G. Y., Nunez, G. Sterile inflammation: sensing and reacting to damage. Nat. Rev. Immunol. 10, 826-837 (2010).
  11. Tenor, J. L., Aballay, A. A conserved Toll-like receptor is required for Caenorhabditis elegans innate immunity. EMBO Rep. 9, 103-109 (2008).
  12. Pujol, N., et al. A reverse genetic analysis of components of the Toll signaling pathway in Caenorhabditis elegans. Curr. Biol. 11, 809-821 (2001).
  13. McEwan, D. L., Kirienko, N. V., Ausubel, F. M. Host translational inhibition by Pseudomonas aeruginosa Exotoxin A Triggers an immune response in Caenorhabditis elegans. Cell Host Microbe. 11, 364-374 (2012).
  14. Dunbar, T. L., Yan, Z., Balla, K. M., Smelkinson, M. G., Troemel, E. R. C. C. elegans detects pathogen-induced translational inhibition to activate immune signaling. Cell Host Microbe. 11, 375-386 (2012).
  15. Irazoqui, J. E., et al. Distinct pathogenesis and host responses during infection of C. elegans by P. aeruginosa and S. aureus. PLoS Pathog. 6, (2010).
  16. Pukkila-Worley, R., Ausubel, F. M., Mylonakis, E. Candida albicans infection of Caenorhabditis elegans induces antifungal immune defenses. PLoS Pathog. , (2011).
  17. Shapira, M., et al. A conserved role for a GATA transcription factor in regulating epithelial innate immune responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 14086-14091 (2006).
  18. Troemel, E. R., et al. p38 MAPK regulates expression of immune response genes and contributes to longevity in C. elegans. PLoS Genet. , 183 (2006).
  19. Twumasi-Boateng, K., Shapira, M. Dissociation of immune responses from pathogen colonization supports pattern recognition in C. elegans. PLoS One. , 7 (2012).
  20. Jakobsen, H., et al. The alkaloid compound harmane increases the lifespan of Caenorhabditis elegans during bacterial infection, by modulating the nematode's innate immune response. PLoS One. 8, (2013).
  21. Portal-Celhay, C., Bradley, E. R., Blaser, M. J. Control of intestinal bacterial proliferation in regulation of lifespan in Caenorhabditis elegans. BMC Microbiol. 12, 49 (2012).
  22. Troemel, E. R., Felix, M. A., Whiteman, N. K., Barriere, A., Ausubel, F. M. Microsporidia are natural intracellular parasites of the nematode Caenorhabditis elegans. PLoS Biol. 6, 2736-2752 (2008).
  23. Montalvo-Katz, S., Huang, H., Appel, M. D., Berg, M., Shapira, M. Association with soil bacteria enhances p38-dependent infection resistance in Caenorhabditis elegans. Infect. Immun. 18, 514-520 (2013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Solucan Ay klay cPatojen Kolonizasyonumm n Yan tPseudomonas aeruginosaFloresan RaporcuGen EkspresyonuAk SitometrisiNGM PlaklarGFP Ekspresyonu

İlgili makaleler