Yöntem makalesi

Plant protein kompleksleri, çevirim sonrası değişikliklerin belirlenmesi

DOI:

10.3791/51095

⸱

22 Şubat 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Life Sciences, University of Warwick, 2The Sainsbury Laboratory, Norwich Research Park, 3Research School of Biology, The Australian National University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada bitki protein komplekslerinin saflaştırılması ve karakterizasyonu için bir protokol açıklar. Biz bir kompleks içinde bir tek proteini imüno tarafından, bu yüzden onun translasyon sonrası modifikasyonlar ve etkileşim ortakları belirlemek olduğunu göstermektedir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bitkiler algı ayrıntılı nedeniyle değişen ortamlara ve sinyalizasyon sistemi ile hızlı bir şekilde adapte. Patojen atak sırasında Bitkiler, hızla immün komplekslerin toplama ve etkinleştirme ile enfeksiyona yanıt. Immün komplekslerinin aktivasyonu, fosforilasyon, glikosilasyon ya da ubikitinasyon gibi proteinlerin translasyon sonrası modifikasyonlar (PTMS) ile ilişkilidir. Bu PTMS koreografisini nasıl anlamak direnç elde edilir nasıl daha iyi bir anlayışa yol açacaktır.

Burada nükleotid-bağlayıcı lösin açısından zengin tekrar (LRR-NB) etkileşen proteinleri ve post-translasyonel modifikasyonlar (PTMS) sonraki belirlenmesi için bir protein saflaştırma yöntemi tarif etmektedir. Küçük değişikliklerle, protokol diğer bitki protein komplekslerinin saflaştırılması için uygulanabilir. Yöntem, daha sonra kısmen saflaştırılır ilgilenilen proteinin, b bir epitop etiketli versiyonu ekspresyonuna dayanıry immüno ve etkileşen protein ve PTMS belirlenmesi için kütle spek-trometresine tabi.

Bu protokol olduğunu göstermektedir: i.) Fosforilasyon gibi PTMS dinamik değişikliği kütle spektrometresi ile tespit edilebilir, ii). Bu ilgilenilen proteinin yeterli miktarda olması ve bu immünoçökeltme saflık eksikliği telafi edebilir önemlidir, iii). Ilgi konusu bir proteinin PTMS tespit etmek için, bu protein, protein yeterli bir miktarını elde etmek için imüno zorundadır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bağışıklık yollar hızla sinyalleri iletmektedir ve bağışıklık tepkileri 1 aktif hale getirmek için protein çeşitli post-translasyonel modifikasyonlar (PTMS) dayanmaktadır. PTMS protein yapısını, etkinlik, stabilite, yerelleştirme ve protein-protein etkileşimlerini 2-4 etkileyebilir protein yapısının hızlı, tersine çevrilebilir, ve son derece spesifik kimyasal değişiklikler bulunmaktadır. Bitkilerde, PTMS 300'den fazla türleri ubikitinasyon, sumoilasyon, sülfasyon, glikosilasyon ve fosforilasyon 2,5 dahil olmak üzere tespit edilmiştir. Kanıt artan vücut bitki bağışıklık 1,5,6 farklı yönleriyle PTMS önemini vurgulamaktadır. Protein fosforilasyonu, bir serin bir fosfat grubunun tersine çevrilebilir bağlanma, treonin ya da tirosin Tortu, pek çok hücresel bir fonksiyon düzenleyici olup, şaşırtıcı bir şekilde çok yüksek cascades 5-11 sinyal bitki savunma PTM incelenmiştir. Fosforilasyon-bağımlı sinyal bitki defe ayrılmaz bir parçasıdırnse aktivasyon multidomain dayanıklılık proteinleri 5,8 ile transmembran reseptörleri tarafından mikropların hücre dışı algı, ya da hücre içi tanıma sonra başlattı.

Bitkiler işgal üzerine, mikroplar örüntü tanıma reseptörleri (PRR'ler) 12 denilen plazma zarı reseptörleri tarafından tespit edilir. Bilinen PRR reseptör-benzeri proteinler (RLPs) ya da reseptör-benzeri kinazlar (RLKs), her ikisi de bir ligand bağlayıcı ektoalan taşıyan ve tek-geçişli bir zar geçiş alanı ya da bulunmaktadır. RLPs aksine, RLKs bir hücre içi kinaz etki alanını 13-15 sahiptir. PRRS of ekto RLKs durumunda, hücre içi etki alanı 6, ​​16 içinde otofosforilasyon ve transfosforilasyonu için, patojenle ilişkili moleküler modelleri (PAMPs) olarak adlandırılan lider korunmuş mikrop elisitör moleküllere bağlanır. PRRS algılama indüklediği fosforilasyon bölgesinin aşağısında, 17 kinazlar da dahil olmak üzere, sitoplazmik proteinler daha sonra fosforilasyon, 18 p, 19, E3 ligaz, mitojen tarafından aktive edilen protein kinazları (MAPK 'ler) 20, 21, kalsiyum-bağımlı protein kinaz (CDPK) PAMP tetiklenen bağışıklık (PTI) 22, 23 ve 24, transkripsiyon faktörleri, 25 yol açar.

PRRS ile hücre dışı algı ek olarak, patojenlerin hücre içi sitoplazmik tanıma reseptörleri yoluyla elde edilir. Bu multidomain direnci (R) proteinlerinin değişken bir N-ucu alanı, merkezi bir nükleotid-bağlayıcı (NB) motifi, ve C-terminali lösin açısından zengin tekrarları (LRR) içerir ve bu nedenle NB-LRR proteinler 26, 27 olarak adlandırılır. R proteinleri, doğrudan veya dolaylı olarak da PRRS ve bağışıklık sisteminin diğer hedef düğümleri için bilinen efektörleri olarak adlandırılan bir patojen kaynaklı hastalık oluşturma molekülleri, tanır. Tanıma efektör-tetiklenen bağışıklık (ETI) 28-31 önde gelen güçlü savunma uyarmaktadır. NB-LRR proteinler müsadere varte NB alanı 30, 32 içindeki motif ATP-bağlama, ancak bunlar bir kinaz sahası yoksundur. NB-LRRS korunmuş etki fosforilasyonu, büyük çaplı bir proteomik diğer 33'te rapor edilmiştir, ancak ETE ile ilişkisi açık değildir. Benzer şekilde PTI için, NB-LRR proteinlerin aktivasyonu MAPK 34-37 ve 38-40 gibi CDPKs sitoplazmik proteinlerin fosforilasyonuna yol açar. En önemlisi, efektör tanıma NB-LRR protein 41 ile doğrudan etkileşim aksesuar proteinlerin fosforilasyonunun yol açabilir. Bazı örnekler NB-LRR proteinleri ile etkileşen proteinleri RIN4 (Arabidopsis thaliana) ve Pto (domates, Solanum lycopersicum) arasında, RPM1 42, 43 ve 44, sırasıyla Prf. Pseudomonas syringae bakterilerin enfeksiyon esnasında, efektör protein AvrB, reseptör-benzeri kinaz RIPK 45, büyük olasılıkla, RIN4 fosforilasyonunu uyarır 46. Benzer şekilde, domates P. syringae ve AvrPto AvrPtoB Pto 47 fosforilasyonunun uyarılması efektörler. , Bir kinaz sahasına sahip değildir ve trans-fosforile edilmiş olmalı RIN4 aksine, Pto oto-fosforilasyonu 48 ve alt tabakalar 49, 50 trans-fosforilasyonu sahip aktif bir kinazdır. Pto sinyallemesinin efektör bağımlı başlatılması için, bunun kinaz aktivitesini gerektirir, kinaz ölü Pto mutantlar yine bir efektör-bağımsız bir şekilde 51 in sinyal edebiliyoruz. Biz son zamanlarda Prf / Pto karmaşık çoklu Prf içeren, oligomerik ve Pto 52 molekülleri ve aynı kompleks içinde Pto molekülleri 47 birbirine trans-fosforilatlayabilen o göstererek bu gözlemleri açıkladı. Biz, Pto (sensör) bir molekül da ikinci Pto molekül (yardımcı) wit aktive olduğu NB-LRR protein (Prf) bir değişikliğe yol açan konformasyon, efektör protein ile etkileşime girdiği bir model önerilenkarmaşık hin. Daha sonra, yardımcı Pto molekülü sensör Pto karmaşık direnci 47 tam aktivasyonuna yol trans-fosforile eder.

Bu örnekler efektör tanınması üzerine immün kompleks bileşenleri ve potansiyel PTMS belirleme sinyalleri aşağı hedeflerine efektör algı transdüksiyona nasıl daha iyi anlaşılmasına yol açabilir göstermektedir. Burada NB-LRR etkileşen proteinler ve bunların PTMS daha sonra tespit edilebilmesi için bir protein saflaştırma yöntemi tarif etmektedir. Bir model olarak Nicotiana benthamiana ve domates Prf / Pto kompleksi kullanarak, ancak aynı protokolü kolay N. ikinci RLKs uygulanabilir benthamiana ve A. küçük değişikliklerle thalianadan 53 biz protokolü dahilinde açıklamak gibi.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Not: Aksi belirtilmedikçe tüm adımları, oda sıcaklığında yapılır.

1.. Bitki Malzeme ve Tamponlar hazırlanması

  1. N. benthamina
    1. Agrobacterium (bu örnekte Prf-FLAG, Prf-3xHA, Pto-FLAG ve bir kontrol olarak boş vektör) 28 ° C'de sıvı kültür (uygun antibiyotikler ile L medium) (200 rpm) çalkalanarak geçici ekspresyon için ilgi tumefaciens büyümek durağan faz kadar C °.
    2. Toplamak ve santrifüjleme (5 dakika boyunca 3,000 x g) ile Agrobakterium pelet. Süpernatant atın ve sızma tamponu peletlenmemiş Agrobacteria'yı tekrar süspansiyon.
    3. 600 nm 'lik bir emişteki optik yoğunluğun (OD) değeri (Abs 600 nm) elde etmek ile agrobakteri miktarını ölçün. 0,1-0,8 bakterilerin OD ayarlayın.
    4. 4 haftalık N. Infiltrate han tarafından agrobakteriye ile benthamina bitkiler (22 ° C, 16 saat ışık)(a-1 ml iğnesiz şırınga ile) ya da vakum (% 0.02 v / v yüzey aktif madde ekleyin) d.
      Not: İlk neredeyse tamamen genişlemiş-yaprak kullanarak, en etkili ve protein ifadesi için iki hemen büyük yaprak. Ubikitinlenmesi veya asetile proteinlerinin tespiti için 100 nM MG-132 ya da 100 ng / ml, Trichostatin A, sırasıyla 1 de ve 2 gün post-infiltrasyon ile yaprakların sızmak.
    5. Infiltre yaprakları 2-5 gün sonra infiltrasyonu ve sıvı azot içinde dondurularak hasat. -80 ° C derin dondurucuda örnekleri saklamak.
      Not: önce 5 gün arasında bir süre boyunca numune alma ve immüno-lekeleme ile protein seviyelerini tespit ilgilenilen proteinin ekspresyonu en iyi düzeyde belirler.
  2. A için thaliana kararlı transgenik çizgiler
    1. A. büyüyecek 6 oyuklu plakalar içerisinde oyuk başına tohum thaliana Sıvı MS ortamı içinde, 5 ml (v sukroz w /% 1) ile takviye edilmiştir. Transgenik satır beş tohum (sterilize edilir ve tabakalı) için üç koyunfaiz veya kuyu başına dönüştürülmemiş kontrol çizgisinin. Büyüme odaya plaka aktarmadan önce iki gün boyunca 200 rpm'de çalkalayın ve 2 hafta (22 ° C, 10 saat ışık) için bırakın.
    2. Hasat örnekler ve sıvı azot içinde dondurularak.
      Not: Bir kontrol olarak, ilgi konusu proteinin aynı etiketi ile ilişkisiz bir proteini ifade eden bir transjenik çizgi kullanabilir.
  3. Tamponlar
    1. 1-2 saat boyunca tampon A. De-gaz tamponu hazırlayın (RLKs için, diğer zara bağlı proteinlerin ve nükleer proteinler,% 1 v / v Igepal CA-630 53 ekleyin).
      Not: süresiz 4 ° C'de Tampon A tutabilirsiniz. Sen Triton yerine IGEPAL CA-360 v / 1% v kullanabilirsiniz.
    2. Ekstre önce soğuk tampon B en az 1-2 saat 80 ml hazırlayın.
      Not: ekstraksiyon tamponu genel doku ideal oranı 1:04 (w / v) 'dir.

2. Protein Ekstraksiyon

  1. Hemen önce ekstre soğuk tampon C 80 ml hazırlamak
    Not: ubikitinlenmiş proteinlerinin tespiti için 10 uM MG-132 ekleyin.
  2. N. 20 g eziyet benthamiana doku (yaklaşık 15 yaprak) veya A. bir havan kullanılarak sıvı azot içinde thaliana fideleri (6-çukurlu plaka başına 2-4 g).
  3. , Zemin dokusunun 20 g soğuk tampon C 80 ml ilave edilir, iyice karıştırılmakta ve buz üzerinde eritin.
    Not: Aynı anda (faiz ve kontrol protein) tüm örnekleri öğütün.
  4. (4 ° C'de önceden soğutulmuş) bir doku homojenleştirici ile tam hızda 10 saniye, her 3 patlamaları ile homojenize edilmiştir. 4 ° C'de 30 dakika boyunca 30,000 x g'de 22-25 um bir doku ve santrifüj yoluyla Filtre ° C.
    Not: Alternatif olarak, yeni bir önceden soğutulmuş havan ve havan tokmağı ile homojenize.
  5. Afinite matrisi engelleme ve yıkama adımları için, Tampon D'nin 20 ml hazırlamak
  6. 4 ° C'de 5 dakika boyunca,% 1 BSA ihtiva eden soğuk tampon D 500 ml kullanılarak uygun bir afinite matrisi Blok 100 mi ° C.
    Not: Tercih affinity matrisler anti-FLAG M2 agaroz, Streptavidin agaroz, GFP-Trap_A ve anti-HA agaroz içerir.
  7. 1 ml soğuk tampon D ile yıkayın 3x
  8. Buz üzerinde yeni bir tüp içine, bir 0.45 mikron bir şırınga filtreden geçirilmiştir yaprağı ekstresi ve filtre süpernatantı.
    Not: özü rengi yeşil ya da sarı olmalı, örnek kahverengiye döndüğünde ise, atın ve yeniden başlayın.
  9. , Immunoblot için ham ekstraktı atın 5x bir kısım SDS-PAGE yükleme tamponu, girdap ekleyin ve 80-100 ° C'de 10 dakika için kaynatma ile denatüre örnekleri Isı bloğu C °.

3. Protein İmmunopresipitasyon

  1. Iki adet 50 ml tüpler içinde protein özü bölünmüş ve her bir tüpe Tampon D içinde süspansiyon haline afinite matrisi 50 ul ekle. 4 ° C'de 2 saat boyunca yumuşak bir rotasyon ile inkübe
    Not: uzun inkubasyon verimini arttırmak için bulunmuştur edilmemiştir.
  2. Eklenmesi ile elüsyon tampon 600 ul (afinite matrisi 6x boncuk hacmi) hazırlanmasıTampon D (nihai konsantrasyonlar):% 0.5 BSA, (anti-FLAG M2 agaroz için) 0.25 mg / ml ya da FLAG peptit (Streptavidin agaroz için), 10 mM D-biotin.
    Not: Elüsyon GFP-Trap_A ve anti-HA matrislerin durumunda tavsiye edilmez, bu nedenle 1 x SDS-PAGE yükleme tamponu içinde kaynama noktasına kadar doğrudan devam, 3.11 nolu aşama.
  3. 4 ° C (1000 x g, 5 dakika) santrifüj ile afinite matrisi çöktürün.
  4. , Immunoblot için bağlanmamış ekstraktının bir tümbölenini al yüzer geri kalanını atmak, tüpün alt yaklaşık 500 ul bırakır.
  5. Geniş çaplı ucu ile bulamaç solüsyon yeniden süspanse edin.
  6. Tek bir 1.5 ml tüp iki tüplerden karışık çamur solüsyon aktarın.
    Not: Şu andan itibaren, mikrofuge'de tüpleri bağlama 1.5 ml düşük protein kullanın.
  7. Afinite matrisi çöktürmek ve süpernatant kaldırmak için bir masa üstü santrifüj kullanılarak 5 saniye için nabız 3x.
  8. Yıkamalar arasında, 1 ml soğuk tampon D ile 3-5x yıkayın afinite matri çökeltmekx, daha önce tarif edilen ve süpernatant atılır. Son yıkama bir şırınganın iğne ile fazla Tampon D çıkarın.
    Not:% 0.1 Igepal ile Tampon D kullanılarak bir son yıkama başka spesifik olmayan bağlanmayı azaltmak için kullanılabilir.
  9. Sabit şekilde çalkalanarak (anti-FLAG M2 veya Streptavidin agaroz bakınız adım 3.2) uygun bir elüsyon tamponu içinde 200 ul 3x, 5 dakika ile her Zehir.
  10. Tek bir tüp içinde 3 yıkama sıvıları Havuz. Emme reçine 30 ul kullanılarak proteinleri konsantre edilir. Vortex, 5 dakika boyunca bekletin ve reçine (10.000 x g'de 2 dakika) çökelmesi edelim. Süpernatant atın.
    Not: GFP-Trap_A ve anti-HA agaroz için, adımları 3.9 ve 3.10 atlayın.
  11. Çöken afinite matrisi ya da emme reçinesine 1x SDS-PAGE yükleme tamponu 50 ul ekle. 80-100, 10 dakika vorteksleyin ve kaynatma Isı bloğu C °.
  12. 10,000 x g, 2 dakika için kaynatılmış afinite matrisi ya da reçine santrifüjleyin. Supernatan alikosu 5 ulimmüno-t ve ~ 10 cm uzunluğunda SDS-PAGE jel üzerinde (Şekil 2) üzerine diğer fraksiyonlar ile çalıştırın.
  13. İlave ayrılma (Şekil 2) gerekli ise, kütle spektrometrisi ile ayrılması ve fosforile edilmiş proteinlerin tanımlanması için, ~ 19 cm uzunluğundaki bir SDS-PAGE jeli üzerine, geri kalan 45 ul yükleyin.
    Not: Boş bir şerit örnekleri kirlenmesini azaltmak için tüm örnekler arasında dahil edilebilir.

4. Protein Sindirim

  1. Coomassie Brilliant Blue (CCBB) boyası ile SDS-PAGE jel leke.
    Not: keratinlerden ile kirlenmeyi azaltmak için jel kullanımını en aza indirin. Ekipman veya araçlarının hiçbiri imünoblotlarını veya artık protein kontaminasyonu yapmamışlar başka faaliyetler için kullanılan emin olun.
  2. Su içinde bol yıkanarak, tercihen O / N ile jel destain Temiz bir jilet ile jelden ilgi bant kesin.
    Not: immunoblot ile jel hizalama halinde necessadoğru alanını bulmak için ry. Fosforilasyon SDS-PAGE üzerinde protein göçünü geciktirme gibi hemen çıkar bant üzerinde ve altındaki alana kesin.
  3. (Bu jel pipet uçları engelleme olmadan tüp içinde çözümler ile kaplı olmasını sağlar) 2-4 mm'lik küpler halinde jel dilim zar. Bir tüp içinde yerleştirin.
  4. Jel iyi batık tutmak için gerekli hacmi tahmin. Türevleştirme, proteaz ve peptid çıkarma ile inkübasyon için bu miktarda kullanın, ve sonra yıkama için üçlü hacimleri çift kullanın.
    Not: Tipik olarak, kesme jel parçalarının yaklaşık olarak 100 ul ile sindirmek yıkama için 500 ul çözeltisi, su kaybı boyunca 2 x 180 ul, indirgeme, alkilasyon için 120 ul ve 120 ul sindirim için 150 ul kullanın.
  5. (50 mM amonyum bikarbonat, ABC),% 50 asetonitril eklenerek jel parçalarından 2 x 20 dak (veya beneği kadar) yıkanır. Jel parçaları kaldırmak için özen çözüm pipetle.
  6. % 100 Aceto ile dehydrate5 dakika boyunca nitril ve serbest sıvı boşaltılır.
    Not: Jel çekmiş ve beyaz görünmelidir. Mavi renk devam ederse, asetonitril / ABC ve / veya yüksek bir sıcaklıkta (45-55 ° C) daha inkübe edilir.
  7. Su içinde 10 mM DTT eklenerek protein disülfıt bağlarını azaltır ve çalkalanarak 56 ° C'de 30-45 dakika inkübe edilir. Serbest sıvı çıkarın.
  8. 20-30 dakika boyunca (oda sıcaklığı, karanlık) için (50 mM ABC) 55 mM kloroasetamid eklenmesiyle sistein kalıntısı alkile. Serbest sıvı çıkarın.
  9. (50 mM ABC),% 50 asetonitril ile jel parçalarından 2 x 10 dakika yıkayın. Serbest sıvı çıkarın.
  10. 5 dakika boyunca% 100 asetonitril ile jel parçaları kurutmak ve serbest sıvı boşaltılır.
  11. Triptik için, sindirimi tripsin çalışma çözeltisinin 40 ul (sindirim tamponu içinde 100 ng Tripsin: 50 mM ABC, ortalama bir Coomassie boyalı bant boyunca 5% asetonitril) ekleyin. Jel parçaları 10 dakika depoIayabiIirIer izin verin. Gerekirse jel parçaları karşılamak için sindirim tamponu yeterli ekleyin. 37 º C'de inkübeO / N
  12. Sindirim durdurmak ve jel parçalarından peptidleri özü,% 5 formik asit (% 50 asetonitril) (sindirim hacmi ile aynı hacim eklemek) ekleyin. 5-10 dakika için sonikasyon. Yeni bir tüp süpernatant aktarın. Ekstraksiyon 3 kez tekrarlayın.
  13. Liyofilizasyon (tercih edilir) veya (Speed-Vac veya Savant gibi) bir vakum yoğunlaştırıcı ile peptidleri kurutun. -20 º C'de muhafaza
  14. Kütle spektrometresi için örnek gönderin.
    Not: Sainsbury Laboratory (Norwich, UK) ile kütle spektrometresi tesisine bizim örnek sundu. Kütle spektrometrisi tesislerinde Protocols ölçüde değişiklik gösterir, ancak tipik olarak peptidler, tandem kütle spektrometrisi-püskürtücü elektro birleştirilmiş bir sıvı kromatografi sistemi üzerine yüklenmeden önce% 2 asetonitril ile% 0.2 trifloroasetik asit içinde çözülmüş olacaktır.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu stabil bir transgenik A. etiketli proteinlerin saflaştırılması için burada bir protokol açıklar thaliana çizgiler veya N proteinlerin geçici tanımlamadan sonra benthamina. Şekil 1 'de gösterildiği gibi, hedef proteinin saflaştırılması etkileşen protein ve hedef proteinin PTMS belirlenmesine olanak sağlamak için, kütle spektrometresi ile birleştirilir. Protokol ve bitki bağışıklığının PTMS kimlik katılan proteinlerin saflaştırılması için tasarlanmıştır, ancak herhangi etiketli bitki proteininin saflaştırılması için uygulanabilir.

Bir örnek olarak N arasından Prf / Pto kompleksinin kullanımı arıtma benthamiana. transjenik N. 35S benthamiana satır 38-12 54: Pto, geçici 35S ile transforme edildi: Prf-FLAG ve karmaşık anti-FLAG M2 agaroz (Şekil 2A) ile immüno-çökeltildi. Şekil 2A'da imüno (IB)hedeflenen protein (Prf) çoğu imüno olduğunu göstermektedir. Pto ve etkileşen efektör protein AvrPtoB Prf ile copurified ve (Şekil 2A ve 2B) antikorları ve kütle spektrometre analizi ile tespit edildi. AvrPto ve 35S: AvrPtoB (Şekil 2A) Bu efektör 35S yapıları ile birlikte eksprese olduğunda Prf ile copurified Pto SDS-PAGE jeli üzerinde daha yavaş göç bulundu. Her iki efektör proteinler Prf etkileşen Pto (Şekil 2A) ve daha yavaş göç neden oldu. Bu fosfataz 44 ile işlenerek çıkarılabilir olabilir gibi Pto bu efektör tanıma bağımlı yavaş göç önce fosforilasyon atfedilmiştir. Pto yavaş göç katkıda fosforilasyon bölgelerini tespit etmek için, kütle spektrometresi analizi Prf copurifying Pto tabi tutuldu. Pto yüksek ifadesi ve İmmünoblotların ile kolay tespiti rağmen biz peptidleri c almak olabilirPto dizinin sadece% 57 overing ve herhangi bir fosforilasyon bölgelerini (Şekil 2B) tanımlamak için başarısız oldu.

Daha sonra, anti-FLAG. N. ile Pto proteini hedef stratejileri değişti Prf-3HA ve 35S: Pto-FLAG, ya da 35S olmayan: AvrPto ve 35S: benthamiana WT bitkilerin geçici olarak 35S ile dönüştürülmüştür. AvrPtoB Prf-kompleks ile serbest formda hem de içeren Pto protein, toplam miktarı, immüno-çökeltildi anti-FLAG M2 agaroz ve SDS-PAGE fraksiyonasyon, in-jel triptik sindirim ve kütle spektrometrik analizi (Şekil 2C) tabi ile. Bu yaklaşımla onun dizisinin yaklaşık olarak% 80 ve bilinmeyen bir 100 kDa proteinini kapsayan etkileşim Pto peptidler belirlenmiştir. Biz, Pto peptidler 187-202 ve 188-202 (Tablo 1) için tek ve çift fosforilasyon bir dizi tanımlanır. Ser ve Thr-198-199, baskın fosforilasyon bölgeleri, ancak diğer pho idisphorylation siteler de tespit edildi (Tablo 1). Ser ve Thr-198-199 ile ilgili en önemlisi çift fosforlama sadece efektör protein (Tablo 1) ya da varlığında tespit edilmiştir. Yakın zamanda Pto fosforilasyon benzer bir dizi tanımlanır ve 47 sinyal için çift fosforilasyon olayın önemini gösterilen. Burada tarif edilen protokol izlenerek biz hedef proteinin fosforilasyon durumu dinamik değişiklikleri tespit etmek mümkün oldu.

figure-results-1
Şekil 1. Genel deney tasarımı. Hedef protein immüno-çökeltme (IP) için geçici Nicotiana benthamiana veya kararlı biçimde Arabidopsis thaliana, in planta etiketlendi ve ifade edilir. Protein çıkarılması ardındanHedef protein, bir afinite matrisi ile imüno-çökeltilir. Proteinler, elektroforez ile bir akrilamid jeli üzerinde ayrılır. Jel bantlar eksize edilir. Proteinler, jel bantları çıkarıldı ve kütle spektrometreye tabi tutulur. Fosforilasyon siteleri ve etkileşim proteinler tanımlanmıştır. resmi büyütmek için buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2. Prf ve Pto immunopresipitasyon. A). Yapı 35S: Prf-FLAG geçici 38-12 hattı (35S: Pto) olarak ifade edilmiştir boş vektör (EV) ile birlikte, 35S: AvrPto veya 35S: AvrPtoB. Üç gün sonrası infiltrasyon Prf anti-FLAG yakınlık matrisi kullanılarak immünopresipite edildi. ImmuPrf, AvrPtoB ve Pto için noblots (IB) yapıldı. Pto immunoblot panelinin altındaki oklar ile belirtildiği gibi, AvrPto ve AvrPtoB) Pto. Bir B yavaş göç neden olur. Yapı 35S: Prf-FLAG geçici 38-12 hattı (35S: Pto) olarak ifade edilmiştir boş vektör (EV) ile birlikte, 35S: AvrPto veya 35S: AvrPtoB. Üç gün sonra infiltrasyonu Prf anti-FLAG agaroz kullanılarak immüno-ve SDS-PAGE üzerinde ayrıldı. Jel, Coomassie Parlak Mavisi (CCBB) ile görünür Prf ile boyanmış, Pto ve AvrPtoB proteinler bantları jelden kesilip çıkarılmış ve kütle spektrometrisi ile analiz edilmiştir. Kütle spektrometresi ile tespit Pto ve Prf dizilerin yüzdesi peptid kapsama belirtilir. C) verdi. Yapıları 35S: Prf-3xHA ve 35S: Pto-FLAG geçici 35S ile birlikte ifade edildi: AvrPtoB, 35S: AvrPto veya N boş vektör (EV) benthamina. Üç gün toplam tutarı sonrası süzülmePto-FLAG agaroz anti-BAYRAK kullanarak immünopresipite ve SDS-PAGE çözüldü. Görünür Pto ve Pto-etkileşimli protein bantları jelden kesilip çıkarılmış ve kütle spektrometrisi ile analiz edilmiştir. Prf (oklarla gösterildiği gibi) biraz daha az görünür ise Pto ve 100 kDa Pto-etkileşimli protein bandı, koloidal Coomassie Brilliant Blue (CCBB)-boyanmış jel üzerinde açıkça görülebilir. IP: İmmunopresipitasyon; IB: Immunoblot; CBB: Koomassie Parlak Mavi boyama; CCBB: Coomassie Parlak Mavi boyaması. resmi büyütmek için buraya tıklayın.

Prf
EV AvrPto AvrPtoB
Pto peptid 188-202
GTELDQ [p T 195] HLSTVVK 1 1 0
GTELDQTHL [p S 198] TVVK 10 7 5
GTELDQTHLS [p T 199] VVK 8 3 4
G [p T 190] ELDQTHLS [p T 199] VVK 0 1 2
GTELDQTHL [p S 198] [p T 199] VVK 0 8 4
GTELDQTHLSTVVK 46 26 48
Pto peptid 187-202
KGTELDQ [p T 195] HLS TVVK 0 1 0
KGTELDQTHL [p S 198] TVVK 17 17 12
KGTELDQTHLS [p T 199] VVK 4 2 2
KGTELDQ [p T 195] HLS [p T 199] VVK 0 1 1
KGTELDQTHL [p S 198] [p T 199] VVK 0 7 5
KGTELDQTHLSTVVK 21 37 18
Peptidler 187-202 ve 188-202 83 88 50
İki fosforilasyon olayları ile peptidlerin yüzdesi % 0 % 26.9 % 11.2
Pto Dizi Kapsamı % 78 % 79 82%

Tablo 1, 35S sinyal aktivasyonu üzerine bir çift Pto peptidin fosforilasyonu:.. Prf-3xHA ve 35S: Pto-FLAG geçici em ile birlikte ifade edildiPty vektörü (EV), 35S: AvrPto ya da 35S: N. AvrPtoB benthamina. Üç gün sonra infiltrasyonu Pto-FLAG proteininin toplam miktarı, anti-FLAG afinite matrisi kullanılarak immüno-ve SDS-PAGE üzerinde çözüldü. Coomassie parlak mavi lekeli jel üzerinde Pto görülebilir bantlar kütle spektrometrisi ile çıkarıldı ve analiz edildi. Pto 0 ile özdeşleşmiş peptidler, 1 ve 2 fosforilasyon olaylarının sayısı belirtilir.

Tamponların Tablo
L orta Tripton 10 g / L
Maya özü 5 g / L
NaCl 5 g / L
D-glikoz 1 g / L
Agro-infiltrasyon tampon MgCI2 10 mM
MES 10 mM
PH 5.5 'e ayarlayın
Asetosiringon (isteğe bağlı) 150 uM
Tampon A Tris-HCl pH 7.5 150 mM
NaCl 150 mM
EDTA 5 mM
EGTA 2 mM
Gliserin % 5 (v / v)
Tampon B Tampon A
PVPP % 2 (a / h)
Tampon C Tampon B
Ditiyotreitol (DTT) 10 mM
Plant proteaz önleyici kokteyl % 1 (v / v)
Fenilmetilsülfonil florid (PMSF) 0.5 mM
Calyculin A 50 nM
Sodyum flüorür (NaF) 50 mM
Sodyum molibdat (Na 2 MoO 4) 10 mM
Sodyum ortovanadat 1 mM
Okadaik asit 100 nM
Tampon D Tampon C PVPP'nin olmadan
5x SDS-PAGE yükleme tamponu Tris-HCl pH 6.8 60 mM
SDS % 2
Gliserin % 0.15
Bromophenol Mavi % 0.10
DTT (kullanımdan hemen önce ekleyin) 50 mM

Tablo 2. Tampon ve medya tarifleri.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PAMPs ve efektörler tarafından reseptör aktivasyonunun mekanizmasını açıklamaya bitki bağışıklığının anlayışımıza büyük katkıda bulunabilir. Son 20 yıl içinde, genetik ve maya iki hibrit ekranlar PRRS ve NB-LRR proteinlerin keşfi için vesile olmuştur. Daha yakın zamanda, kütle spektrometresi tabanlı protokoller 55-58 işaret bağışıklık kendi PTMS 11,33,59,60 boyunca ayrı düzenlenmiş proteinlerin tanımlanması için kurulmuştur, immün komplekslerin 61 ve effektör bileşim 62 hedefliyor. Burada immün komplekslerinin aktivasyonu düzenleyen PTMS belirlenmesi için basit bir protokol açıklar.

Daha önce tarif edilen protokol ile karşılaştırıldığında, bu protokol PTMS dinamik değişimlerin ayrıntılı belirlenmesini sağlar. Büyük ölçekli proteomiks yaklaşımların Protokolleri proteinlerin PTMS belirlemek ama sınırlamak nedeniyle PTMS site plastisite ortaya çıkarmak mümkün değildir olabilired protein miktarları. Protein fosforilasyon durumunda, büyük ölçekli proteomik yaklaşımlar tipik olarak sadece baskın fosforilasyon siteleri 11,33,59 belirlemek. Bir protein fosforilasyon durumunun detaylı karakterizasyonu sadece hedef proteinin 47 kısmi saflaştırılması yoluyla elde edilebilir protein bir miktar gerektirir. Protokol, saflaştırılmış proteinin kütle spektrometresi analizi ile, çiftler burada hedef proteinin önemli bir miktar veren bir protein saflaştırma bir yaklaşım tarif. Bu protokol ardından, Pto tek fosforilasyon olay, daha önceden açıklandığı gibi 52 Ser-198 ağırlıklı olarak atfedilen ancak bazı kütle spektrometresi spektrumları da Pr-195 veya Pr-199 üzerinde tek bir fosforilasyon olayı desteklenmiştir. Pto çift fosforlama etkinlik gözlenmiştir zaman başka sitelerde kombinasyonları da gözlenmiştir, ancak, fosforilli amino asitler baskın kombinasyonu (198 ve Ser-Thr-199 idiTablo 1). Bu sonuçlar açık bir şekilde protein kinazların fosforilasyon yeri doldurulan malzeme ve ayrıntılı olarak mümkün olan tüm fosforilasyon siteleri karakterize etmek için, tarif edilen protokol yeteneğini göstermektedir.

Bu protokolün en kritik adımlar şunlardır: proteinlerin 1) yeterli çıkarma; PTMS 2) korunması ve hedef protein 3) yeterli miktarda. İlk olarak, proteinlerin yeterli çıkarılması için, sıvı azot içinde doku öğütmek için ve daha sonra protokolde tarif edildiği gibi bir doku homojenleştirici kullanılması önemlidir. Bir doku homojenleştirici mevcut değilse, bir havan ve havaneli kullanılabilir. Bu, üç (veya dört) ekstraksiyon tamponu hacmi doku gram birinden bir oran kullanmak da önemlidir. Oranını ve öneririz yüksek mukavemetli tampon tampon Bu doku, pH çıkarma işlemi sırasında tarafsız kalmayı sağlayacaktır. Bu A için özel öneme sahip olduğu bulundu thaliana ve domates ekstrahiçbir zaman göz ardı 52. PTMS korunması tüm tampon PTMS kaldırabilir enzimlerin uygun inhibitörleri de dahil olmak üzere elde edilebilir. Bu 4 ° C'de tüm adımları gerçekleştirmek ve tamponlar ve araçlar prechill da önemlidir. Hedef proteinin yüksek verimleri yeterli miktarlarda protein eksprese eden bitkiler kullanılarak, doku (yaklaşık 20 g), yüksek miktarda kullanarak elde edilebilir. Hedef proteinin yeterli miktarda elde etmek için en önemli adımı, doğrudan immüno-çökeltme ile hedef proteinin konsantre edilir. Bu adımın önemi nedeniyle Yardımcı bağışık çökeltilmiş Pto (Şekil 2B) sınırlı miktarda bir Prf immunoprecipitation sonra Pto PTMS belirlemek için başarısızlık tarafından vurgulanır. Bunun aksine, Pto doğrudan immüno-protein dizisi ve PTMS (Tablo 1) tanımlanması nedeniyle yaklaşık% 80 içerisinde yol açan önemli ölçüde daha fazla ölçülebilir peptidler (Şekil 2C) vermiştir. Biz de strongly protein immunoprecipitation için epitop-etiketleri kullanmanızı öneririz. Proteinler, doğal epitop afinite matrisi karşı ortaya çıkartılan antikorlar ile karşılaştırıldığında, kısmen saflaştırılmış protein yüksek miktarlarda verebilir. Immüno-çökeltme için yerel Pto protein 51 (Şekil 2A) karşı ortaya çıkan bir antikor kullanarak, Pto iki baskın fosforilasyon siteleri tek tek fosforilasyonunu tespit etmek mümkün oldu.

Bu protokol, esas olarak N. kısmi saflaştırılması için geliştirilmiştir benthamiana sitoplazmik protein ve fosforilasyon siteleri sonraki tespiti. Bununla birlikte, bu tarifnamede tarif edilen modifikasyonları kullanılarak, bu protokol kolayca A. için uyarlanabilir thaliana proteinler ve zara bağlı proteinler. Bu protokol ana amacı PTMS tanımlanması için hedef proteinin yeterli miktarda elde etmek üzere ve karmaşık en yüksek saflık elde etmek için değildir. Eğer daha yüksek saflıktakompleks gereklidir saflaştırılması bir ikinci adım, bu protokol 52 eklenebilir. Bu durumda, bir ilk adım sert elüsyon koşulları gerektiren, yüksek tuzları veya asit kullanımı ve bir sonraki aşamada olmadan afinite matrisinden hedef proteinin elüsyon işlemi ise bir matris gerektirebilir sağlayacaktır. Biz sadece fosforilasyon sitelerinin tanımlanması için bu protokolü test edilmiş ve şu anda ek PTMS ayrıntılı tanımlanması için kabiliyetini test olduğunu olduğunu vurgulamak önemlidir.

Bizim için temsili sonuçlar açık bir şekilde protein kinazların fosforilleme alanı plastisite ve fosforilasyon siteleri karakterize etmek için, tarif edilen protokol yeteneğini göstermektedir. En önemlisi, kütle spektrometrisi ile ve oto-fosforilasyon siteleri tek bir nokta mutasyonu tarafından proteinlerin düşük miktarda güvenmek fosforilasyon siteleri kimlik kafa karıştırıcı sonuçlar verebilir vurgulamak. Biz burada daha önce göstermek 47 Ser-Thr-198 ve 199 ile ilgili Pto bu çift fosforlama Prf / Pto kompleksinin aktivasyonu ile ilişkilidir. Bunun aksine, daha önce yayınlanmış sonuçlar 47,63 Ser-Thr-198 ve 199 tek bir nokta mutasyonu kompleks aktivasyonu için bir önkoşul, bu siteye bu fosforilasyonunu gösteren işaret yeteneğine sahip olan, bu sitelerde fosforilasyonunu değildir önleyen, alanine göstermiştir . Bu sonuçlar, şu anda ikincil site Thr-195 fosforilasyonu ile açıklanabilir. Diğer protein kinaz fosforilasyon Alanı plastiklik içine Benzer fikir, bu protokol takip edilerek elde edilebilir. Ayrıca, fosforilasyon bölgelerini kullanan bir birleşik yaklaşım mutasyon, protein kinazların fosforilasyon yer plastisite evrimsel öneminin daha iyi anlaşılmasına yol açacaktır protein immüno ve kütle spektrometre analizleri ile bağlantılı olarak, özel kinazlarının (efektörler) inhibe edebilir proteinlerin etmektedir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, (mali ya da diğer) herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederim.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

VN Royal Society tarafından desteklenmektedir. JPR bir Avustralya Araştırma Konseyi Gelecek Fellow (FT0992129) 'dir. Biz eleştirel yazının okunması için Dr Miriam Gifford teşekkür ederim.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
MgCl2SigmaM8266
MESSigmaM8250
AsetosiringonSigmaD134406toksik - DMSO
Şırıngada 1 M stok 1 ml sterilTerumo
Şırınga iğnesiTerumoNN-2525R
Silwet L-77 (yüzey aktif madde)Lehle TohumlarıVIS-01toksik
MG-132 (Z-Leu-Leu-Leu-al)SigmaC2211DMSO'da 1 M stok, -80 ve derecede saklayın; C
MS tuzlarıSigmaM5524oksitleyici, toksik
SükrozSigma16104
Trizma bazSigmaT15031 M Tris-HCl tamponu yapmak için pH'ı 1 N HCl ile ayarlayın
NaClSigmaS30145 M stok
EDTASigmaE6758toksik - 0,5 M stok
EGTASigmaE4378
GliserolUlusal TeşhisEC-606
IGEPAL CA-630SigmaI8896aşındırıcı
PVPP (polivinilpolipirolidon)SigmaP5288PVP
DTT (DL-ditiotreitol)Sigma43815toksik - 1 M stok, -20 ° C'de saklayın; C
Bitki proteaz inhibitörü kokteyliSigmaP9599çok fazla donma/çözülme yapmaz
PMSF (fenilmetilsülfonil florür)SigmaP7626aşındırıcı, toksik
Kalikülin AHücre Sinyalizasyon Teknolojisi9902
Sodyum Florür (NaF)SigmaS7920toksik - 1 M stok
Sodyum Molibdat (Na2MoO4)SigmaS66460,5 M stok
Sodyum ortovanadat (Na3VO4)Sigma450243toksik - 200 mM'lik bir sodyum ortovanadat çözeltisi hazırlayın. 1 N NaOH veya 1 N HCl kullanarak pH'ı 10.0'a ayarlayın. Sodyum ortovanadat çözeltisinin başlangıç pH'ı, birçok kimyasala göre değişebilir. PH 10.0'da çözelti sarı olacaktır. Çözeltiyi renksiz olana kadar kaynatın (yaklaşık 10 dakika). Oda sıcaklığına soğutun. pH'ı 10.0'a yeniden ayarlayın ve çözelti renksiz kalana ve pH 10.0'da stabilize olana kadar 3. ve 4. adımları tekrarlayın.
Okadaik asitSanta Cruz Biyoteknolojisc-3513
Kinematica Polytron doku homojenizatörüFisher Scientific08-451-320
MiraclothMerck Millipore475855-1R
anti-FLAG M2 agarozSigmaA2220bu matris önerilir
Streptavidin-agarozThermo-Scientific20347bu matris önerilir
GFP-Trap_AChromotekgta-20bu matris önerilir
Anti-HA-AgarozSigmaA2095bu matris
0.45 & mu önerilir; m filtresiVWR513-1902
BSASigmaA7906
FLAG peptitSigmaF3290
D-biotinSigma47868
StrataClean reçineAgilent400714bu absorpsiyon reçinesi protein çökeltmesi için önerilir
Mini-PROTEAN Tetra CellBiorad
PROTEAN II XL CellBiorad
SimplyBlue SafeStainInvitrogenLC6060bu leke önerilir
Protein düşük bağlayıcı tüpler (LoBind)Eppendorf0030 108.116bu tüpler önerilir
Amonyum bikarbonat (ABC)Sigma9830toksik
AsetonitrilVWR83639toksik, yanıcı
2-kloroasetamidSigma22790toksik
TripsinPromegaV5280tahriş edici, hassaslaştırıcı
Formik asitSigma14265toksik, aşındırıcı
Su banyosu sonikatörüUltravaweUltra BT Ultrasonik Banyo
LTQ-Orbitrap XLTermo-Bilimsel
Trichostatin ASigmaT8552toksik
, , ile karıştırmayın

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jones, A. M., Monaghan, J., Ntoukakis, V. Editorial: Mechanisms regulating immunity in plants. Front. Plant Sci. 4, 64 (2013).
  2. Jensen, O. N. Modification-specific proteomics: characterization of post-translational modifications by mass spectrometry. Curr. Opin. Chem. Biol. 8, 33-41 (2004).
  3. Cohen, P. The regulation of protein function by multisite phosphorylation-a 25 year update. Trends Biochem. Sci. 25, 596-601 (2000).
  4. Narayanan, A., Jacobson, M. P. Computational studies of protein regulation by post-translational phosphorylation. Curr. Opin. Struct. Biol. 19, 156-163 (2009).
  5. Stulemeijer, I. J., Joosten, M. H. Post-translational modification of host proteins in pathogen-triggered defence signalling in plants. Mol. Plant Pathol. 9, 545-560 (2008).
  6. Park, C. J., Caddell, D. F., Ronald, P. C. Protein phosphorylation in plant immunity: insights into the regulation of pattern recognition receptor-mediated signaling. Front. Plant Sci. 3, 177 (2012).
  7. van Bentem, S. D., Hirt, H. Using phosphoproteomics to reveal signalling dynamics in plants. Trends Plant Sci. 12, 404-411 (2007).
  8. Peck, S. C. Early phosphorylation events in biotic stress. Curr. Opin. Plant Biol. 6, 334-338 (2003).
  9. Thurston, G., Regan, S., Rampitsch, C., Xing, T. Proteomic and phosphoproteomic approaches to understand plant-pathogen interactions. Physiol. Mol. Plant P. 66, 3-11 (2005).
  10. Xing, T., Ouellet, T., Miki, B. L. Towards genomic and proteomic studies of protein phosphorylation in plant-pathogen interactions. Trends Plant Sci. 7, 224-230 (2002).
  11. Nuhse, T. S., Bottrill, A. R., Jones, A. M., Peck, S. C. Quantitative phosphoproteomic analysis of plasma membrane proteins reveals regulatory mechanisms of plant innate immune responses. Plant J. 51, 931-940 (2007).
  12. Boller, T., Felix, G. A renaissance of elicitors: perception of microbe-associated molecular patterns and danger signals by pattern-recognition receptors. Ann. Rev. Plant Biol. 60, 379-406 (2009).
  13. Wang, G., et al. A genome-wide functional investigation into the roles of receptor-like proteins in Arabidopsis. Plant Physiol. 147, 503-517 (2008).
  14. Wang, G. D., et al. The Diverse Roles of Extracellular Leucine-rich Repeat-containing Receptor-like Proteins in Plants. Crit. Rev. Plant Sci. 29, 285-299 (2010).
  15. Schwessinger, B., Ronald, P. C. Plant innate immunity: perception of conserved microbial signatures. Ann. Rev. Plant Biol. 63, 451-482 (2012).
  16. Schulze, B., et al. Rapid heteromerization and phosphorylation of ligand-activated plant transmembrane receptors and their associated kinase BAK1. J. Biol. Chem. 285, 9444-9451 (2010).
  17. Lu, D., et al. A receptor-like cytoplasmic kinase, BIK1, associates with a flagellin receptor complex to initiate plant innate immunity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 496-501 (2010).
  18. Zhang, J., et al. Receptor-like cytoplasmic kinases integrate signaling from multiple plant immune receptors and are targeted by a Pseudomonas syringae effector. Cell Host Microbe. 7, 290-301 (2010).
  19. Lu, D., et al. Direct ubiquitination of pattern recognition receptor FLS2 attenuates plant innate immunity. Science. 332, 1439-1442 (2011).
  20. Asai, T., et al. MAP kinase signalling cascade in Arabidopsis innate immunity. Nature. 415, 977-983 (2002).
  21. Rasmussen, M. W., Roux, M., Petersen, M., Mundy, J. MAP Kinase Cascades in Arabidopsis Innate Immunity. Front. Plant Sci. 3, 169 (2012).
  22. Boudsocq, M., et al. Differential innate immune signalling via Ca2+ sensor protein kinases. Nature. 464, 418-422 (2010).
  23. Dubiella, U., et al. Calcium-dependent protein kinase/NADPH oxidase activation circuit is required for rapid defense signal propagation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 8744-8749 (2013).
  24. Ishihama, N., Yamada, R., Yoshioka, M., Katou, S., Yoshioka, H. Phosphorylation of the Nicotiana benthamiana WRKY8 transcription factor by MAPK functions in the defense response. Plant Cell. 23, 1153-1170 (2011).
  25. Mao, G., et al. Phosphorylation of a WRKY transcription factor by two pathogen-responsive MAPKs drives phytoalexin biosynthesis in Arabidopsis. Plant Cell. 23, 1639-1653 (2011).
  26. Dangl, J. L., Jones, J. D. G. Plant pathogens and integrated defence responses to infection. Nature. 411, 826-833 (2001).
  27. Eitas, T. K., Dangl, J. L. NB-LRR proteins: pairs, pieces, perception, partners, and pathways. Curr. Opin. Plant Biol. 13, 472-477 (2010).
  28. Jones, J. D., Dangl, J. L. The plant immune system. Nature. 444, 323-329 (2006).
  29. Boller, T., He, S. Y. Innate immunity in plants: an arms race between pattern recognition receptors in plants and effectors in microbial pathogens. Science. 324, 742-744 (2009).
  30. Bonardi, V., Dangl, J. L. How complex are intracellular immune receptor signaling complexes. Front. Plant Sci. 3, 237 (2012).
  31. Bonardi, V., Cherkis, K., Nishimura, M. T., Dangl, J. L. A new eye on NLR proteins: focused on clarity or diffused by complexity. Curr. Opin. Immunol. 24, 41-50 (2012).
  32. Takken, F. L., Albrecht, M., Tameling, W. I. Resistance proteins: molecular switches of plant defence. Curr. Opin. Plant Biol. 9, 383-390 (2006).
  33. Nakagami, H., et al. Large-scale comparative phosphoproteomics identifies conserved phosphorylation sites in plants. Plant Physiol. 153, 1161-1174 (2010).
  34. del Pozo, O., Pedley, K. F., Martin, G. B. MAPKKKalpha is a positive regulator of cell death associated with both plant immunity and disease. EMBO J. 23, 3072-3082 (2004).
  35. Ekengren, S. K., Liu, Y., Schiff, M., Dinesh-Kumar, S. P., Martin, G. B. Two MAPK cascades, NPR1, and TGA transcription factors play a role in Pto-mediated disease resistance in tomato. Plant J. 36, 905-917 (2003).
  36. Romeis, T., et al. Rapid Avr9- and Cf-9 -dependent activation of MAP kinases in tobacco cell cultures and leaves: convergence of resistance gene, elicitor, wound, and salicylate responses. Plant Cell. 11, 273-287 (1999).
  37. Zhang, S., Klessig, D. F. Resistance gene N-mediated de novo synthesis and activation of a tobacco mitogen-activated protein kinase by tobacco mosaic virus infection. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 7433-7438 (1998).
  38. Romeis, T., Piedras, P., Jones, J. D. G. Resistance gene-dependent activation of a calcium-dependent protein kinase in the plant defense response. Plant Cell. 12, 803-815 (2000).
  39. Romeis, T., Ludwig, A. A., Martin, R., Jones, J. D. G. Calcium-dependent protein kinases play an essential role in a plant defence response. EMBO J. 20, 5556-5567 (2001).
  40. Romeis, T. Protein kinases in the plant defence response. Curr. Opin. Plant Biol. 4, 407-414 (2001).
  41. Dodds, P. N., Rathjen, J. P. Plant immunity: towards an integrated view of plant-pathogen interactions. Nat. Rev. Genet. 11, 539-548 (2010).
  42. Grant, M. R., et al. Structure of the Arabidopsis RPM1 gene enabling dual specificity disease resistance. Science. 269, 843-846 (1995).
  43. Mackey, D., Holt, B. F. 3rd, Wiig, A., Dangl, J. L. RIN4 interacts with Pseudomonas syringae type III effector molecules and is required for RPM1-mediated resistance in Arabidopsis. Cell. 108, 743-754 (2002).
  44. Mucyn, T. S., et al. The tomato NBARC-LRR protein Prf interacts with Pto kinase in vivo to regulate specific plant immunity. Plant Cell. 18, 2792-2806 (2006).
  45. Chung, E. H., et al. Specific threonine phosphorylation of a host target by two unrelated type III effectors activates a host innate immune receptor in plants. Cell Host Microbe. 9, 125-136 (2011).
  46. Liu, J., Elmore, J. M., Lin, Z. J., Coaker, G. A receptor-like cytoplasmic kinase phosphorylates the host target RIN4, leading to the activation of a plant innate immune receptor. Cell Host Microbe. 9, 137-146 (2011).
  47. Ntoukakis, V., et al. The Tomato Prf Complex Is a Molecular Trap for Bacterial Effectors Based on Pto Transphosphorylation. PLoS Pathog. 9, (2013).
  48. Sessa, G., D'Ascenzo, M., Martin, G. B. Thr38 and Ser198 are Pto autophosphorylation sites required for the AvrPto-Pto-mediated hypersensitive response. EMBO J. 19, 3157-3157 (2000).
  49. Ntoukakis, V., et al. Host Inhibition of a Bacterial Virulence Effector Triggers Immunity to Infection. Science. 324, 784-787 (2009).
  50. Zhou, J. M., Loh, Y. T., Bressan, R. A., Martin, G. B. The Tomato Gene Pti1 Encodes a Serine/Threonine Kinase That Is Phosphorylated by Pto and Is Involved in the Hypersensitive Response. Cell. 83, 925-935 (1995).
  51. Wu, A. -J., Andriotis, V. M. E., Durrant, M. C., Rathjen, J. P. A Patch of Surface-Exposed Residues Mediates Negative Regulation of Immune Signaling by Tomato Pto Kinase. Plant Cell. 16, 2809-2821 (2004).
  52. Gutierrez, J. R., et al. Prf immune complexes of tomato are oligomeric and contain multiple Pto-like kinases that diversify effector recognition. Plant J. 61, 507-518 (2010).
  53. Ntoukakis, V., Schwessinger, B., Segonzac, C., Zipfel, C. Cautionary notes on the use of C-terminal BAK1 fusion proteins for functional studies. Plant Cell. 23, 3871-3878 (2011).
  54. Rommens, C. M., Salmeron, J. M., Oldroyd, G. E., Staskawicz, B. J. Intergeneric transfer and functional expression of the tomato disease resistance gene Pto. Plant Cell. 7, 1537-1544 (1995).
  55. Jones, A. M., et al. Specific changes in the Arabidopsis proteome in response to bacterial challenge: differentiating basal and R-gene mediated resistance. Phytochemistry. 65, 1805-1816 (2004).
  56. Widjaja, I., et al. Combining subproteome enrichment and Rubisco depletion enables identification of low abundance proteins differentially regulated during plant defense. Proteomics. 9, 138-147 (2009).
  57. Keinath, N. F., et al. PAMP (pathogen-associated molecular pattern)-induced changes in plasma membrane compartmentalization reveal novel components of plant immunity. J. Biol. Chem. 285, 39140-39149 (2010).
  58. Elmore, J. M., Liu, J., Smith, B., Phinney, B., Coaker, G. Quantitative proteomics reveals dynamic changes in the plasma membrane during Arabidopsis immune signaling. Mol. Cell. Proteom. 11, (2012).
  59. Benschop, J. J., et al. Quantitative phosphoproteomics of early elicitor signaling in Arabidopsis. Mol. Cell. Proteom. 6, 1198-1214 (2007).
  60. Maor, R., et al. Multidimensional protein identification technology (MudPIT) analysis of ubiquitinated proteins in plants. Mol. Cell. Proteom. 6, 601-610 (2007).
  61. Elmore, J. M., Coaker, G. Biochemical purification of native immune protein complexes. Methods Mol. Biol. 712, 31-44 (2011).
  62. Win, J., Kamoun, S., Jones, A. M. Purification of effector-target protein complexes via transient expression in Nicotiana benthamiana. Methods Mol. Biol. 712, 181-194 (2011).
  63. Sessa, G., D'Ascenzo, M., Martin, G. B. Thr38 and Ser198 are Pto autophosphorylation sites required for the AvrPto-Pto-mediated hypersensitive response. EMBO J. 19, 2257-2269 (2000).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

mm nopresipitasyonK tle SpektrometrisiProtein Safla t rmaFosforilasyon TespitiEpitop EtiketlemeSDS PAGE JeliTripsin SindirimiAfinite Matrisi

İlgili makaleler