Yöntem makalesi

Multiprotein kompleksleri Karşılaştırmalı Analizi için Yeni Bir Yaklaşım dayanarak

11.6K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/51103

⸱

13 Mart 2014

 ,  ,  , 
1Institute of Plant Biology and Biotechnology, University of Münster, 2Department of Plant Biology, Carnegie Institution for Science

Bu makalede

Özet

Tarif edilen karşılaştırmalı nicel proteomik yaklaşım, farklı koşullar altında multiprotein komplekslerinin bileşimi içine bir bakış açısı elde etmeyi amaçlamaktadır ve genetik olarak farklı suşların karşılaştırılması ile gösterilmiştir. Kantitatif analiz için bir sükroz yoğunluk gradyanı farklı fraksiyonların eşit hacimleri kütle spektrometresi ile analiz edilir ve karıştırılır.

Özet

Katılan protokolü, farklı koşullar altında kompleks bileşim içine bir bakış açısı ortaya çıkararak, thylakoid zarında multiprotein kompleksleri analizi için bir araç sağlar. Bu protokolde yaklaşım, genetik olarak farklı cinslerinden izole edilmiş Chlamydomonas reinhardtii içinde siklik elektron akışı (CEF), karmaşık sorumlu proteinin bileşimin karşılaştırılması ile gösterilmiştir. Prosedür, ayırıcı metabolik etiketleme (14 N / N 15) göre sükroz yoğunluk gradyanı ile santrifüjleme, SDS-PAGE, İmmuno ve karşılaştırma, kantitatif kütle spektrometrisi (MS) ile multiprotein kompleksler onların ayrılması takip thylakoid membran izolasyonunu içerir, analiz suşları. Deterjan çözünmüş thylakoid zarlar eşit klorofil konsantrasyonunda sakaroz yoğunluk dereceleri üzerine yüklenir. Ultrasantrifüje edildikten sonra, kütle-gradyanlar spectromet ile analiz edilir fraksiyonlar, ayrılırry eşit hacmine göre. Bu yaklaşım ayrıca degrade kesirleri içinde kompozisyonun soruşturma ve özellikle ANR1, CAS ve PGRL1 odaklanarak, farklı proteinlerin göç davranışlarını analiz etmeyi sağlar. Ayrıca, bu yöntem, (daha önceki çalışmalardan elde edilen daha önceden PGRL1, FNR'nin olarak CEF-supercomplex parçası olmak için tarif edilmiş proteinlerin tanımlanması ve PSI-bağımlı geçiş bulguları destekleyen ve immüno-lekeleme ile birlikte ve ayrıca sonuçları teyit ile gösterilmiştir cyt f). Özellikle, bu yaklaşım bu protokol kabul edilebilir ve örneğin, farklı çevre koşullarına izole multiprotein karmaşık bileşim karşılaştırmalı analiz için kullandığı için soru geniş bir adres için geçerlidir.

Giriş

Bitki ve alglerin thylakoid zarlarında fotosentez süreçleri doğrusal ve döngüsel modda çalışabilir. Doğrusal elektron akışı (LEF) fotosistem I (PSI), fotosistem II (PSII) ve sitokrom b 6 / f sırasında sonuç olarak NADPH ve ATP 2'nin üretimi yol açan, su, NADP + 1 için elektron transfer. Buna karşılık, durum 2 3 ve anaerobik koşullar 4, geri elektron nakil zincirine elektron enjekte yükseltgenmiştir PSI yeniden azalma sonuçları gibi çeşitli çevresel koşullar altında neden olduğu bilinen bir siklik elektron akışı (CEF). Bu süreç sitokrom b 6 / f kompleks 1 stromal tarafında veya plastokinon havuzda 5 de ya gerçekleşecek ve ATP üretir, ama hiçbir NADPH 2 olabilir.

Sunulan protokol amacı, kütle spektrometrisi (MS) bazlı m göstermektir(genetik olarak farklı suşlar karşılaştırılması ile örneklenen) farklı koşullar altında, bu komplekslerin bileşimine anlamak için Chlamydomonas reinhardtii thylakoid zarlarında multiprotein komplekslerinin karşılaştırmalı, kantitatif analiz için ethod. Bu yaklaşım Terashima ve arkadaşlarının yaptığı bir yayında uygulanmıştır. 2012'de C. CEF bir Ca 2 +-bağımlı düzenlenmesini gösteren Proteinlerin CAS, ANR1 ve PGRL1 6 da dahil olmak üzere bir multiprotein kompleksi tarafından aracılık reinhardtii. Bu prosedür, nispeten böylece etiketleme ağır azot (15 N) ile iki suşlarının bir yararlanarak, iki genetik olarak farklı suşlarda CEF-supercomplex bileşimini analiz ederek açıklanacaktır. Kısaca, protokol deterjan çözünmesi ve bir sükroz yoğunluk gradyanı içinde fotosentetik komplekslerin parçalanması, ardından thylakoid membran hazırlanmasını içerir. Gradyan ayrışımdan sonra frac seçileniki suş tions karıştırılmış, eşit hacimde göre in-jel sindirim ve daha sonra kantitatif MS analizi ile ve ardından SDS-PAGE ile ayrılmıştır.

Yukarıda belirtildiği gibi, CEF farklı çevresel koşullar altında ve 2010 bağlı bir yayın durumundan C. 2 kilitli hücreleri fonksiyonel CEF-supercomplex izolasyonunu olduğunu göstermektedir ultrasantrifüj sırasında bir sükroz yoğunluk gradyanı üzerinde çözündürülmüş thylakoid membranlar ayrılması ile gerçekleştirilmiştir ki, 7, reinhardtii. Iwai et al. 7'den farklı olarak, sunulan protokol anaerobik yetiştirilen C ila CEF-supercomplex izolasyonunu anlatmaktadır alternatif bir prosedür izleyerek reinhardtii kültürler. Bu thylakoid izolasyon protokolde değişiklikler gibi çözündürme adım ilişkin farklılıklar ve ultra-santrifüj ile protein kompleksleri ayrılmasını içerir. Mevcut protokolde, thylakoid membranlartamponlar Iwai ve arkadaşları tarafından thylakoid hazırlanması için kullanılan süre, Chua ve Bennoun 8 tarafından yayınlanan prosedürü uygulanarak izole edildi ark. 9, tarif edildiği gibi 25 mM Mes, 0.33 M sükroz, 5 mM MgCl2, 1.5 mM NaCI (pH 6.5) ihtiva etmiştir. Burada tarif edilen çözündürme yöntemi,% 0.9 deterjan kullanımına dayanır ise çözündürme, Iwai ve arkadaşları durumunda, buz üzerinde 30 dakika boyunca% 0,7-0,8 deterjan (n-tridesil-β-D-maltozit) ile gerçekleştirildi (n -Dodesil-β-D-maltozit (β-DM)) ve buz üzerinde sadece 20 dakika boyunca gerçekleştirilir. Her iki grup da, ilgili bir deterjan ile çözündürme için ml başına 0.8 mg klorofil kullanılır. Bu protokolün yazarlar arasında değişen konsantrasyonlarda kullanılır ise çözünmüş thylakoid zarlarından fotosentez komplekslerin ayrılması için Iwai vd., 0,1-1,3 M arasında sukroz konsantrasyonları uygulanan 0.4-1.3 M. son farkı kıyasla düşük santrifüj hız, ea içinrlier yayın.

Sukroz yoğunluk gradyan ayırma işlemiyle, ardından iyonik olmayan deterjan ile thylakoid membran Çözündürülmesi zaten 1980'lerden ve proteinlerin metabolik etiketleme uygulama proteomik alanında yaygın bir yöntemdir bugün 7, 9-14 kadar değişen çeşitli çalışmalarda uygulanmıştır. Tarif edilen yaklaşım, kütleye gelen tüm amino asitlerin dahil edilen 15 N NH4CI, şeklinde tek azot kaynağı olarak ağır azot varlığında içinde kültürlenmesi ile karşılaştırıldığında, iki soylarının biri için 15 N metabolik etiketleme geçerlidir Peptidin amino asit sekansına bağlı olarak kaydırır. Bir MS çalıştırmak içinde 14 N ve 15 N bir karışımı analiz edildiğinde, bu kitle kayma her bir peptidin ve bolluğu karşılık gelir göreceli zengindi temsil hesaplanabilir göreli peptit için örnek kaynağını belirlemek için kullanılabilirprotein 15 ing.

C üzerinde çok sayıda nicel proteomiks çalışmalar reinhardtii deneysel koşullar (nedeniyle, 16-19 besin ya da hafif stres 20,21 için proteomun örneğin değişiklikler) arasındaki proteomun değişiklikleri analiz etmek için protein tanımlanmış bir miktarını karşılaştırmak ki, kullanılabilir. Bu çalışmalara göre, şu anda sunulan bir yaklaşımla numune eşit hacimleri birleştirilir ve analiz edilir. Bu kurulum, gradyanın içinde proteinlerin göç davranışını incelemek için ve ayrıca incelenmiştir suşları ile ilgili olarak farklı komplekslerin bileşimini analiz etmeyi sağlar.

Bu yöntem esas olarak üç proteinler üzerinde yoğunlaşarak izah edilecektir: ilk aday C. fotoğraf iklimlendirme dahil olmak üzere gösterilmiştir kloroplast-lokalize kalsiyum sensör protein CAS, bir reinhardtii 22. Kalsiyum önemli bir sinyal olarak kabul edilirSonunda gen ifadesi ve hücre fizyolojisi 23 değişikliklere yol açan, farklı biyotik ve abiyotik streslere aktive edilir ve kloroplastlar CAS proteinin 22,24,25 aracılığıyla sinyal + hücresel Ca 2 katkıda olabileceği ileri sürülmüştür yollar için iyon ing. İkinci protein ANR1 (anaerobik yanıt 1 6), C de oksijensiz büyüme koşulları altında tetiklendiği gösterilmiştir bir proteindir reinhardtii 26. Özellikle, CAS hem de ANR1 CEF-supercomplex ve dahası, ters genetik yaklaşımlar kullanılarak, bu her iki proteinin de, bu protein kompleksinin alt birimlerinin işlevsel olarak destekleyici bir rol, in vivo 6'da CEF fonksiyonel katkıda bulunduğu gösterilmiştir alt-birimleri olarak tanımlanmıştır. Üçüncü protein Chlamydomonas 4,27 hem de Arabidopsis 5,28 CEF dahil olduğu gösterilmiştir ve aynı zamanda id oldu thylakoid protein PGR5-1 gibi (PGRL1) 'dirIwai ve arkadaşları çalışmalarında yazısından. 7

, Vahşi tip (WT) (genel), bir ΔPSI 29 soyu karşı PSAB geninin bir silinmesini arzeden, aynı zamanda bir parçası olan bir alt biriminden bir temel fotosistem kodlayan Bu yaklaşım iki farklı deney sonuçlarını gösteren tarafından sunulacak CEF-supercomplex ve WT vs pgrl1 knock-out gerginlik 4. Bu deneylerin her biri için bir 15 N-ve 14 N-etiketli suşu karşılaştırılmıştır arasındaki CEF-supercomplex kantitatif bileşimi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1.. Chlamydomonas ekimi

  1. Aşağıdaki C. reinhardtii suşları bu çalışmada kullanılmıştır: WT cc124, WT cw15-arg7 (hücre duvarı eksik ve arginin auxotroph), bir ΔPSI mutant suşu 29 ve pgrl1 knock-out suşu 4.
  2. Tüm suşlar, sürekli ışık 20-50 yoğunluğundaki μE / m 2 sn ve 120 rpm'de sallama ile Tris-Asetat-Fosfat (TAP)-30 ortamı, 25 ° C'de yetiştirildi. ΔPSI kültürü <5 μE / m 2 sn ışığa maruz kalma için bir kağıt mendil ile sarılmalıdır.
  3. Nonlabeled suşları (sırasıyla, WT-cw15 arg7 ve pgrl1) için kültürler 7,5 mM, 14 N NH4CI ihtiva etmiştir (sırası ile ΔPSI ve WT cc124) etiketlenmiş suşların kültürleri, 7.5 mM 15 N NH4CI ihtiva etmiştir. Hücreler en az dört generat için büyümeye zorundaTam etiketleme ve elde etmek için iyonları üstel büyüme aşamasında tutulmalıdır.
  4. Deney sayısı ve en azından 750 ml / streyn bir hacim içinde 1 x 10 6 hücre / ml 'lik bir yoğunluğa seyreltilmesi hücreleri başlamadan önce günde.

Süreksiz sakaroz yoğunluk dereceleri iki tür aşağıdaki protokolde tarif unutmayınız. Fotosistem sakaroz yoğunluk geçişlerini Takahashi ve ark. 9'a göre thylakoid sakaroz yoğunluk dereceleri (Protokolü 2 bakınız) önceki gece boyunca santrifüj sırasında izole ve solübilize Thylakoid'in gelen farklı fotosentetik protein kompleksleri ayırmak ve günlük hazırlıklı olması için kullanılan ve 8 (Protokol: 3) thylakoid izolasyon prosedürü uygulanır.

2. Fotosistem Sakkaroz Yoğunluk Gradyanların hazırlanması

  1. Geçişlerini dökme için üç hisse senedi çözümler gereklidir:
    1. 2 M Sukroz
    2. H 2 içinde% 10 β-O DM
    3. 0.5 M Trişin, pH 8.0 (NaOH)
  2. Bu stokları kullanarak, aşağıdaki çözümleri hazırlayın:
    Konsantrasyon: 1.3 M 1.0 M 0.85 M 0.7 M 0.65 M 0.4 M
    2 M Sukroz 13 mi 10 mi 8.5 mi 7 mi 6.5 mi 4 mi
    % 10.46;-DM 100 ul 100 ul 100 ul 100 ul 100 ul 100 ul
    0.5 M Trişin 200 ul 200 ul 200 ul 200 ul 200 ul 200 ul
    H 2 O 6.7 mi 9.7 mi 11.2 mi 12.7 mi 13.2 mi 15.7 mi
  3. 14 mm x 89 mm santrifüj tüpleri kullanarak ve daha düşük yoğunluklu çözeltisine yüksek sükroz yoğunluk solüsyonu ile başlanarak, çok yavaş gradyanlar dökün.
  4. Çözeltilerin geri kalanı için 1.3 ve 1.0 M solüsyon ve 2 ml için sadece 1 ml her dökün.
  5. Gece soğuk bir odada geçişlerini bırakın.

3. Anaerobik İndüksiyon ve thylakoid Zarlar 8 İzolasyonu

  1. Thylakoid membran izolasyonu ile başlamadan önce, 4 saat boyunca içinden argon kabarcıkları geçirilerek anaerobik koşullar neden olur. Köpürme Manyetik bir karıştırma çubuğuna sahip olan kültür sabit karıştırma ile kültür şişeleri içinde bir cam pipet üzerinden gerçekleştirilebilir.
  2. 2,500 xg'de 5 dakika boyunca hücreler pellet ile thylakoid membranların izolasyonu ile başlayın, H1 tampon maddesi içinde tekrar süspansiyon (0.3 M sukroz, 25 mM HEPES (pH 7.5), 5 mM MgCI2).
    (Lütfen unutmayın thylakoid membranlar örnekleri sh izolasyonu ile başlatırkenprotein bozulmasını önlemek için buz üzerinde tutulmalıdır kimse, her santrifüj adımları 4 ° C'de gerçekleştirilir ve eldiven ile çalışan güçlü bir keratin kirlenmesini önlemek için önerilir.)
  3. 2500 x g, H1 tamponunda tekrar süspansiyon 5 dakika için pellet hücreler.
  4. 1500 hPa arasında bir azot basıncı olan bir püskürtücü ile iki geçit ile birlikte hücreler Arası (hücre duvarı olmayan suşlar için tek geçiş yapmak).
  5. 2500 x g 7 dakika için hücreleri aşağı spin.
    (Bu aşamadan sonra süpernatan değilse, hücre kırılma başarılı olmadı, açık yeşil olması gerekmektedir.)
  6. H2 tampon maddesi (0.3 M sukroz, 5 mM HEPES (pH 7.5), 10 mM EDTA (pH 8.0)) ve 32800 x g ile 10 dakika boyunca pellet hücrelerine yeniden süspanse hücreler.
  7. H3 tamponu içinde yeniden süspanse hücreleri (1.8 M sükroz, 5 mM HEPES (pH 7.5), 10 mM EDTA (pH 8.0)) ile bir Potter (yeşil no parçacıklar bu çalışma aşamasının sonunda kalmalıdır) ile pelet homojenize.
  8. Küvette thylakoid sakaroz yoğunluğu yoğunluğu hazırlayın12 ml H3 bir tabaka ile alt başlayarak es (25 mm x 89 mm) 12 ml H4 tampon bir orta tabaka dökmek, hücre tamponu (1.3 M sukroz, 5 mM HEPES (pH 7.5), 10 mM EDTA ( pH 8.0)) ve üst 12 mi H5 tamponu üzerine (0.5 M sükroz, 5 mM HEPES (pH 7.5), 10 mM EDTA (pH 8.0)). Geçişlerini dökme dikkatli olun ve üç tabakadan karıştırma kaçının.
  9. H5 x g 70700 1 saat boyunca tampon ve santrifüj thylakoid sakaroz yoğunluk geçişlerini ile dengeleyin.
  10. Thylakoid sükroz yoğunluk derecelerine ait thylakoid bantları çıkarın ve uygun bir hacim H6 tampon maddesi (5 mM HEPES (pH 7.5), 10 mM EDTA (pH 8.0)) ile seyreltin.
  11. 20 dakika boyunca 37.900 xg'de hücreleri aşağı spin. Pelet sıkı değildir, daha fazla H6 tampon Bu santrifüj adımı için gereklidir.
  12. Bir küçük hacimli H6 tamponunda Thylakoid'in süspanse ve klorofil konsantrasyonunun belirlenmesi ile devam edin.

4. Klorofil 31 Konsantrasyon tayini

  1. Klorofil miktarının belirlenmesi,% 80 aseton ile gerçekleştirilir.
  2. 995 ul% 80 aseton ve H6 tamponu Thylakoid'in 5 ul (1:200 seyreltme) karıştırın.
  3. Birkaç saniye için Vortex hiç yeşil parçacıklar kalır ve daha sonra 5 dakika boyunca 14.1 xg'de aşağı doğru döndürün kadar.
  4. Üstteki sıvı kısmı alınır ve sırasıyla, 663,6 ve 646,6 nm ve 750 nm 'de yok olma ölçer.
  5. Aşağıdaki formülleri kullanarak klorofil miktarını hesaplayın:
    1. C Chl a [mg / ml] = (0,01225 * E 663,6-0,00255 * E 646,6) * seyreltme faktörü
    2. C Chl b [mg / ml] = (0,02031 * E 646,6-0,00491 * E 663,6) * seyreltme faktörü
    3. C Chl [mg / ml] = C Chl a + C Chl b

5. Fotosistem Sakkaroz Yoğunluk Gradyanların Yükleniyor

  1. Gerekli Thylakoid'in, β-DM ve H6 tampon miktarlarını hesaplayınHer degrade için:
    1. Her bir gradyan% 0.9 β-DM (H 2 O β-DM çözülür) içinde 0.8 mg / ml, klorofil ile 700 ul toplam hacmi ile yüklenmiş olması gerekir, H6 tamponu ile geri kalan hacmi doldurun.
  2. Çözülebilmesi için her degrade için tilakoidler, β-DM ve H6 tamponu ile farklı alikotları hazırlamak.
  3. Düzenli (tersini) her birkaç dakikada (çözünürleşme aşama) karıştırılması ile buz üzerinde 20 dakika boyunca örnekleri bırakın.
  4. 4 ° C'de 10 dakika maksimum hızda (14,000 xg) santrifüje
    (Yüzer koyu yeşil iken Santrifüj işleminden sonra, topak ve küçük beyazımsı olması gerekmektedir.)
  5. Yokuşta süpernatant yükleyin.
  6. H6 tampon ve 4 ° C'de (14 saat) bir gecede 134.470 xg ultrasantrifüj kullanarak dönmeye ile denge
    (Istimal bu protokolde sunulan fotosistem sükroz yoğunluk gradyanlarla fotosentez komplekslerinin başarılı ayrılık sadece elde edilir unutmayınçözünmesi ve karmaşık ayrılması için bir tahmin daha önce dondurulmuş olan thylakoid zarları ile çalışırken yapmak zor olduğundan g taze, Thylakoid'in izole edilmiştir.)

6. Fotosistem Sakkaroz Yoğunluk Gradyanların Fraksiyonu

  1. Degradelerin fotoğraf çekmek.
  2. 500 ul tüplerde bir iğne ve damıtmak gradyanları kullanılarak tüpün alt kısmında bir delik delin. Seçenek olarak ise, aynı zamanda bir ayrıştırma 96 oyuklu plaka (mikro) kullanılarak gerçekleştirilebilir.
  3. Bir mikrotabla kullanırken, 675 nm 'de, farklı fraksiyonların gradyan absorbans belirler.
    (Bu adım örnekleri anda birkaç hafta -80 ° C'de saklanabilir.)

7. SDS-PAGE ve İmmuno

(Sadece ΔPSI vs WT karşılaştırma için bir western blot analizi sonraki MS-analiz için kesirler seçmek için yapılmıştır unutmayın. Deney için WT vs pgrl1 freylemleri farklı fraksiyonlarda absorbans vasıtasıyla seçilmiştir.)

  1. Bir% 13 SDS poliakrilamid jeli üzerinde 32 WT ve ΔPSI gradyanı her fraksiyonun ayrı 30 ul.
  2. ANR1 (TEF7) 26, PGRL1 34, CAS 6, PSI alt birim PSAD 32 ve PSII çekirdek alt birimi D1: Aşağıdaki antikorlar kullanılarak Western blot analizi 33 yapın. 1:10,000 dilüzyonda kullanılmalıdır D1 antikor haricinde (zenginleştirilmiş kimyasal aydınlatma tekniği için) 1:1,000 bir seyreltme ile, bütün antikorları kullanarak.
  3. İmmuno sonuçlarına göre, WT ve ΔPSI için ANR1, PGRL1 ve PSA'nın pik fraksiyonların (sırasıyla, burada fraksiyon 6 ve 13) almak WT ve ΔPSI ikinci fraksiyon 6 30 ul karıştırıp fraksiyonu 13 ile aynı şeyi Her iki preparatlar ve bir% 13 SDS poliakrilamid jeli üzerinde yeniden ayırın.
  4. WT vs pgrl1 nicel karşılaştırma için C almakFarklı gradyan fraksiyonlarında absorbans ölçülerek belirlenmiş ve% 13 SDS poliakrilamid jeli üzerinde ayırma, ardından her iki numune 30 ul karışım olarak EF-supercomplex parçacıklar.
  5. 4 ° C'de, oda sıcaklığında ya da gece boyunca 2 saat için Coomassie çözeltisi (% 85 fosfor asit, 757 mM amonyum sülfat,% 1.2 Coomassie parlak mavi,% 20 metanol) ile, protein bantları Leke
  6. Belirsiz lekelenme kaldırmak için, GKD 2 O. ile birkaç kez yıkayın
  7. 1 mm jel parçalar halinde şerit kesin ve-jel sindirim ile devam edin.
    (Alternatif olarak, numune vakumlu bir santrifüjde, bir kaç dakika kurutuldu ve in-jel sindirim ile devam etmeden önce bir kaç hafta boyunca depolanabilir.)

8. In-jel Sindirim (Shevchenko ve ark. 35 Modifiye)

Kullanımdan kısa bir süre önce tüm tamponları ve çözümleri hazırlamak ve asetonitril (ACN) içeren tamponlar için cam şişe almak için lütfen unutmayın.
DİKKAT! ACN ile çalışan zararlı olabilir; daha fazla bilgi indirilebilir: http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927335 (2013).

  1. 30 saniye için GKD 2 O (~ 200 ul)> 10 hacim jel parçaları yıkayın.
  2. , Çalkalama ile, 15 dakika boyunca 25 mM NH4 HCO 3 300 ul ile inkübe jel parçaları sıvı boşaltılır.
  3. , Çalkalama ile, 15 dakika boyunca (1:1 lik bir oranda ACN ve 50 mM NH4 HCO 3 karıştırılarak hazırlandı) sıvının çıkması% 50 ACN içinde 25 mM NH4 HCO 3 300 ul jel parçaları inkübe edin.
  4. Jel parçaları hala mavi ise, Coomassie çoğu çıkarılır kadar NH4 HCO 3 ve NH4 HCO 3 / ACN yıkar tekrarlayın.
    (Coomassie boyaması toplu kaldırılması gerekir, ancak tamamen jel parçaları destain için gerekli değildir.)
  5. 5 dakika için jel parçaları kurutmak için ACN 100 ul ekleyin. Jel parçaları bir küçültmek gerekirnd tamamen beyaz görünüyor.
  6. Mümkün olduğunca ACN çıkarın ve tripsin sindirim ile devam edin. Alternatif olarak, numuneler bir kaç hafta boyunca -20 ° C'de saklanabilir.
  7. 20 ng bant başına 10-20 ul ekleyin / 10% tripsin ul ACN / 25 mM NH 4 HCO 3 (taze seyreltilmiş), buz üzerinde örnekleri tutmak.
  8. 30 dakika sonra tüm çözüm absorbe olup olmadığını kontrol edin ve gerekirse daha fazla tripsin tampon ekleyin. Jel parçaları tamamen tripsin tampon maddesi ile kaplanmalıdır. Buz üzerinde örnekleri tutun.
  9. Tripsin ile doyurulması için buz üzerinde bir 90 dakika daha jel parçaları bırakın.
    (Critical adım: triptik peptidlerin verimi muhtemelen poliakrilamid matris içine enzimin yavaş difüzyonu, buz üzerinde inkübasyon süreleri artan ölçüde artar Bu önlemek için kaplama parçalarının jel çözeltisi, küçük bir fazlalık için gerekli olduğu adettir. gecede inkübasyon sırasında kuru düşer.)
  10. 4-6 saat boyunca 37 ° C'de Digest. Gerektiren deneyler içinmaksimal peptid kurtarma gecede, sindirmek.
  11. Sindirim sonra yoğunlaştırılmış tampon aşağı doğru döndürün.
  12. 5 dk için sonikasyon tüpler tekrar peptidler ve santrifüj elute edin.
  13. Süpernatant toplayın ve yeni bir tüpe aktarın.
  14. 15 dakika boyunca, bir sonik banyo içinde% 30 ACN /% 1 formik asit (FA) 80 ul peptit çıkarma yapın.
  15. 15 dakika boyunca, bir sonik banyo içinde% 30 ACN /% 1 FA 80 ul ile ekstraksiyon yapın.
  16. 15 dakika boyunca, bir sonik banyo içinde% 70 ACN /% 1 FA 80 ul ile ekstraksiyon yapın.
  17. Önceki malzemeyle tekrar ve havuz yüzer santrifüj.
    (FA tripsin inaktive ve peptit çözünürlüğünü arttırmak için hizmet eder.)
  18. Tamamen bir vakum santrifüj içinde kuru peptid solüsyonu.
    (Bu noktada numune MS-analizi ile devam etmeden önce, -20 ° C'de birkaç hafta muhafaza edilebilir.)
  19. 6 ul MS tamponu (% 5 ACN, 0.1 v / v FA, su) ve 2-5 dakika boyunca ultrasonik titremeye maruz bırakılır peptitler tekrar.
  20. Maximu Santrifüj örneklerim hızı 5 dakika boyunca parçacık halinde malzemeyi çıkarmak için.
  21. Kitle spektrometrik analiz için yüzer 4 ul kullanın.

9. "Proteomatic" MS-Veri Analizi

Veri analizi, açık kaynak yazılım (http://www.proteomatic.org/ indirilebilir) "Proteomatic", nesil ve MS / MS veri değerlendirme boru hatlarının tamamlanması kullanarak sağlayan bir platform ile yapıldı özgür ve ticari yazılım 36. Kısaca, ayarlar aşağıda tarif edilmiştir ve daha ayrıntılı bilgi 6,26 bulunabilir.

  1. MS-verilerin tanımlanması ve miktarının belirlenmesi
    ΔPSI genel deneyler WT tanımlanması ve proteinlerin miktar 6,26 tarif edildiği gibi, OMSSA (sürüm 2.1.4 37) ve sırasıyla qTrace 26 ile yapılmıştır. Aşağıdaki güncelleştirilmiş boru pgrl1 deney WT vs MS-veri analizi için kullanıldı:
    1. OMSSA 37 ek olarak, aynı zamanda X proteinleri ile tespit edilmiştir! Tandem (sürüm 2013/02/01 38). Her iki algoritmaları NCBI'den birleşmiş bir veritabanına karşı AUGUSTUS veritabanı sürümü 10.2 yanı sıra ile JGI Chlamydomas gen model veritabanı sürümü 4.3 birleştirerek oluşturulan bir veritabanına karşı arayarak uygulandı BK000554.2 ve NC_001638.1 veritabanları.
    2. Peptidlerin MS 2 tanımlanması, bir hedef-yem yaklaşım 39 kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Her bir protein için bir yem nonproteotypic peptitlerin fazlalık koruyarak, rasgele triptik peptidler shuffling tarafından oluşturuldu.
    3. Peptidlerin istatistiksel doğrulama 0.01 'den az ve sonuçlar 5 ppm'lik bir ön-madde kütle tolerans ile filtre edildi ve bir posterior hata olasılığı (PEP) eşik kullanarak yazılım qvality (sürüm 0.3.3 40) ile gerçekleştirilmiştir.
    4. OMSSA ve X peptitler! Tandem çalışır qTrace ile katıldı ve ölçüldü Aşağıdaki filtre adımları uygulayarak 26:, MS 2 belirlenmesini gerektiren protein adları / grup bilgisi eklemek ve hem kardeş peptidler gerektirir.

Protein oranları WT ve pgrl1 gelen karışık CEF-supercomplex fraksiyonlar içinde birbirine doğru anlamlı bir farklılık olup olmadığını incelemek için, istatistiksel analiz yazılım SPSS (versiyon 21) uygulanması gerçekleştirilmiştir. Sitokrom b 6 / f kompleksinin alt-birimleri birbirine hem de protein FNR, FTSH2 ve PSI alt-birimlerine karşı HCF136 karşı test edildi. Dört suretin protein başına, her tarama sayısı peptid oranları Shapiro-VVilks testinin normal dağılımı açısından test edilmiştir. Peptid popülasyonlar normal (p <0.001) dağıtılmış değildi yana, parametrik olmayan istatistik yapıldı. Birincisi, Kruskal-Wallis testi gruplar arasında anlamlı bir farklılık değerlendirirken uygulandı. Bu testi anlamlı bir fark tahmin yalnızcagruplar arasında s, daha fazla analiz Mann-Whitney-U Testi ile bağımsız iki grup arasında önemli farklılıklar tahmin yapıldı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Katılan nicel proteomik yaklaşım, genetik olarak farklı C. CEF-supercomplex bileşenlerin karşılaştırmalı analizi ile gösterilmiştir thylakoid zarlarında multiprotein komplekslerinin kompozisyonu karakterize amaçlar suşları reinhardtii. Tarif edilen yöntem, başarılı bir şekilde Terashima et al. 6 uygulanan ve deterjan çözündürülmesi, ardından anaerobik yetiştirilen kültürlerden thylakoid membran izolasyonunu içerir edilmiştir. Daha sonra, numuneler eşit klorofil miktarına göre bir sü...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Kararlı izotop etiketleme kullanarak farklı kantitatif proteomik çalışmalar son yıllarda yayınlanmıştır. Bu deneylerde, genellikle iki farklı numune bir numune istikrarlı bir izotop ile etiketli olan, karşılaştırılmıştır. Bundan sonra her iki numune ikinci proteinler veya peptitler eşit oranda bir araya getirilmekte ve daha birlikte 48 işlenir. Bu tür çalışmalar genellikle araştırmak için farklı stres koşullarına 26,34,49 maruz tanımlanan izole edilmiş hücre bölmeleri (örn. kloroplastlar, ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir mali çıkarı beyan.

Teşekkürler

MH "Deutsche Forschungsgemeinschaft" (DFG) destek kabul eder. Yazar katkıları: MH tasarlanmış araştırma; KT, JS ve MT araştırma yapıldı ve verileri analiz KT ve MH kağıt yazdı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Kimyasallar< / güçlü >
Asetik asitAppliChemA0662http://www.applichem.com/home/
AsetonAppliChemA2300http://www.applichem.com/home/
Asetonitril Optigrade fü r LC-MSDiagonal9340Zararlı, eldivenlerle çalışın. Daha fazla önlem için protokol metnine bakın.

https://www.diagonal.de/

Amonyum klorür 15NCambridge İzotop Laboratuvarları39466-62-1http://www.isotope.com/cil/index.cfm
Amonyum klorür 14NAppliChemA0988http://www.applichem.com/home/
Amonyum hidrojen fosfat AppliChemA3583http://www.applichem.com/home/
Amonyum sülfat AppliChemA3598 http://www.applichem.com/home/
Coomassie parlak mavi R-250Fisher Scientific10041653http://www.de.fishersci.com/index.php/deindex
n-Dodesil-β-D-maltosideAppliChemA0819http://www.applichem.com/home/
EDTAAppliChemA2937http://www.applichem.com/home/
Formik asit   AppliChemA3858http://www.applichem.com/home/
HEPESAppliChemA3724http://www.applichem.com/home/
Magnezyum klorürAppliChemA4425http://www.applichem.com/home/
MetanolAppliChemA2954
http://www.applichem.com/home/ Fosfor asidiAppliChemA0989http://www.applichem.com/home/
Dipotasyum hidrojen fosfat AppliChemA1042http://www.applichem.com/home/
Potasyum dihidrojen fosfat AppliChemA1043http://www.applichem.com/home/
Sodyum hidroksitAppliChemA1551http://www.applichem.com/home/
SükrozAppliChemA1125http://www.applichem.com/home/
TrisinAppliChemA3954http://www.applichem.com/home/
TrisAppliChemA2264http://www.applichem.com/home/
Tripsin (sıralama derecesi değiştirilmiş) ve Tripsin tamponuPromegaV5111http://www.promega.de/
Ekipman< / güçlü>
Nebulizatör (BioNeb hücre bozucu)Glas-Colhttp://www.glascol.com/product/subproduct/id/75
Santrifüj tüpleri (14 mm x 89 mm) Beckman Coulter,Takahashi tarzı gradyanların hazırlanması için 331372

http://www.beckmancoulter.de/

>Santrifüj tüpleri 25 mm x 89 mm
Beckman Coulter,tilakoid izolasyon gradyanlarının hazırlanması için 344058.

http://www.beckmancoulter.de/

Coulter Avanti Santrifüj J-20 XPBeckman Coulterhttp://www.beckmancoulter.de/
Fuchs-Rosenthal hücre yıkama odasıDiagonal449/72https://www.diagonal.de/
Homojenizatör (Potter) 50 ml Homojenizatör için Fisherbrand10618242http://www.de.fishersci.com/index.php/defisherbrand
PistilFisherbrand105252220http://www.de.fishersci.com/index.php/defisherbrand
Ultrasantrifüj (Optima XPN-80 Ultrasantrifüj)Beckman Coulterweb sitesi: http://www.beckmancoulter.de/
Diğer
Antikorlar Agriserahttp://www.agrisera.com/en/index.html

Kaynaklar

  1. Joliot, P., Joliot, A. Cyclic electron flow in C3 plants. Biochim. Biophys. Acta. 1757 (5-6), 362-368 (2006).
  2. Shikanai, T. Cyclic electron transport around photosystem I: genetic approaches. Annu. Rev. Plant Biol. 58, 199-217 (2007).
  3. Finazzi, G., Furia, A., Barbagallo, R. P., Forti, G. State transitions, cyclic and linear electron transport and photophosphorylation in Chlamydomonas reinhardtii. Biochim. Biophys. Acta. 1413 (3), 117-129 (1999).
  4. Tolleter, D., et al. Control of hydrogen photoproduction by the proton gradient generated by cyclic electron flow in Chlamydomonas reinhardtii. Plant Cell. 23 (7), 2619-2630 (2011).
  5. Hertle, A. P., et al. PGRL1 Is the Elusive Ferredoxin-Plastoquinone Reductase in Photosynthetic Cyclic Electron Flow. Mol. Cell. 49 (3), 511-523 (2013).
  6. Terashima, M., et al. Calcium-dependent regulation of cyclic photosynthetic electron transfer by a CAS, ANR1, and PGRL1 complex. PNAS. 109 (43), 17717-17722 (2012).
  7. Iwai, M., Takizawa, K., Tokutsu, R., Okamuro, A., Takahashi, Y., Minagawa, J. Isolation of the elusive supercomplex that drives cyclic electron flow in photosynthesis. Nature. 464 (7292), 1210-1213 (2010).
  8. Chua, N. H., Bennoun, P. Thylakoid Membrane Polypeptides of Chlamydomonas reinhardtii: Wild-Type and Mutant Strains Deficient in Photosystem II Reaction Center. PNAS. 72 (6), 2175-2179 (1975).
  9. Takahashi, H., Iwai, M., Takahashi, Y., Minagawa, J. Identification of the mobile light-harvesting complex II polypeptides for state transitions in Chlamydomonas reinhardtii. PNAS. 103 (2), 477-482 (2006).
  10. Ikeuchi, M., Plumley, F. G., Inoue, Y., Schmidt, G. W. Phosphorylation of Photosystem II Components, CP43 Apoprotein, D1, D2, and 10 to 11 Kilodalton Protein in Chloroplast Thylakoids of Higher Plants. Plant Physiol. 85 (3), 638-642 (1987).
  11. Ruban, A. V., Lee, P. J., Wentworth, M., Young, A. J., Horton, P. Determination of the Stoichiometry and Strength of Binding of Xanthophylls to the Photosystem II Light Harvesting Complexes. J. Biol. Chem. 274 (15), 10458-10465 (1999).
  12. Barera, S., Pagliano, C., Pape, T., Saracco, G., Barber, J. Characterization of PSII-LHCII supercomplexes isolated from pea thylakoid membrane by one-step treatment with α- and β-dodecyl-D-maltoside. Phil. Trans. R. Soc. B. 367 (1608), 3389-3399 (2012).
  13. Kantzilakis, K., et al. A comparative approach towards thylakoid membrane proteome analysis of unicellular green alga Scenedesmus obliquus. Biochim. Biophys. Acta. 1768 (9), 2271-2279 (2007).
  14. Takahashi, Y., Yasui, T., Stauber, E. J., Hippler, M. Comparison of the subunit compositions of the PSI-LHCI supercomplex and the LHCI in the green alga Chlamydomonas reinhardtii. Biochemistry. 43 (24), 7816-7823 (2004).
  15. Thelen, J. J., Peck, S. C. Quantitative proteomics in plants: choices in abundance. Plant Cell. 19 (11), 3339-3346 (2007).
  16. Hsieh, S., et al. The Proteome of Copper, Iron, Zinc, and Manganese Micronutrient Deficiency in Chlamydomonas reinhardtii. Mol. Cell. Proteom. 12 (1), 65-86 (2013).
  17. Longworth, J., Noirel, J., Pandhal, J., Wright, P. C., Vaidyanathan, S. HILIC- and SCX-based quantitative proteomics of Chlamydomonas reinhardtii during nitrogen starvation induced lipid and carbohydrate accumulation. J. Proteome Res. 11 (12), 5959-5971 (2012).
  18. Malasarn, D., et al. Zinc deficiency impacts CO2 assimilation and disrupts copper homeostasis in Chlamydomonas reinhardtii. J. Biol. Chem. 288 (15), 10672-10683 (2013).
  19. Höhner, R., et al. The metabolic status drives acclimation of iron deficieny responses in Chlamydomonas reinhardtii as revealed by proteomics based hierarchical clustering and reverse genetics. Mol. Cell. , (2013).
  20. Mahong, B., Roytrakul, S., Phaonaklop, N., Wongratana, J., Yokthongwattana, K. Proteomic analysis of a model unicellular green alga, Chlamydomonas reinhardtii, during short-term exposure to irradiance stress reveals significant down regulation of several heat-shock proteins. Planta. 235 (3), 499-511 (2012).
  21. Förster, B., Mathesius, U., Pogson, B. J. Comparative proteomics of high light stress in the model alga Chlamydomonas reinhardtii. Proteomics. 6 (15), 4309-4320 (2006).
  22. Petroutsos, D., et al. The chloroplast calcium sensor CAS is required for photoacclimation in Chlamydomonas reinhardtii. Plant Cell. 23 (8), 2950-2963 (2011).
  23. Dodd, A. N., Kudla, J., Sanders, D. The language of calcium signaling. Annu. Rev. Plant Biol. 61, 593-620 (2010).
  24. Nomura, H., Komori, T., Kobori, M., Nakahira, Y., Shiina, T. Evidence for chloroplast control of external Ca2+-induced cytosolic Ca2+ transients and stomatal closure. Plant J. 53 (6), 988-998 (2008).
  25. Weinl, S., et al. A plastid protein crucial for Ca2+-regulated stomatal responses. New Phytol. 179 (3), 675-686 (2008).
  26. Terashima, M., Specht, M., Naumann, B., Hippler, M. Characterizing the anaerobic response of Chlamydomonas reinhardtii by quantitative proteomics. Mol. Cell. Proteomics. 9 (7), 1514-1532 (2010).
  27. Petroutsos, D., et al. PGRL1 participates in iron-induced remodeling of the photosynthetic apparatus and in energy metabolism in Chlamydomonas reinhardtii. J. Biol. Chem. 284 (47), 32770-32781 (2009).
  28. DalCorso, G., et al. A complex containing PGRL1 and PGR5 is involved in the switch between linear and cyclic electron flow in Arabidopsis. Cell. 132 (2), 273-285 (2008).
  29. Redding, K., et al. A systematic survey of conserved histidines in the core subunits of Photosystem I by site-directed mutagenesis reveals the likely axial ligands of P700. EMBO J. 17 (1), 50-60 (1998).
  30. Harris, E. H. The Chlamydomonas Sourcebook. Introduction to Chlamydomonas and its laboratory use. , Elsevier Academic Press. San Diego, CA. (2008).
  31. Porra, R. J., Thompson, W. A., Kriedemann, P. E. Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy. Biochim. Biophys. Acta. 975 (3), 384-394 (1989).
  32. Naumann, B., Stauber, E. J., Busch, A., Sommer, F., Hippler, M. N-terminal processing of Lhca3 Is a key step in remodeling of the photosystem I-light-harvesting complex under iron deficiency in Chlamydomonas reinhardtii. J. Biol. Chem. 280 (21), 20431-20441 (2005).
  33. Hippler, M., Klein, J., Fink, a, Allinger, T., Hoerth, P. Towards functional proteomics of membrane protein complexes: analysis of thylakoid membranes from Chlamydomonas reinhardtii. Plant J. 28 (5), 595-606 (2001).
  34. Naumann, B., et al. Comparative quantitative proteomics to investigate the remodeling of bioenergetic pathways under iron deficiency in Chlamydomonas reinhardtii. Proteomics. 7 (21), 3964-3979 (2007).
  35. Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nat. Prot. 1 (6), 2856-2860 (2006).
  36. Specht, M., Kuhlgert, S., Fufezan, C., Hippler, M. Proteomics to go: Proteomatic enables the user-friendly creation of versatile MS/MS data evaluation workflows. Bioinformatics. 27 (8), 1183-1184 (2011).
  37. Geer, L. Y., et al. Open mass spectrometry search algorithm. J. Proteome Res. 3 (5), 958-964 (2004).
  38. Craig, R., Beavis, R. C. TANDEM: matching proteins with tandem mass spectra. Bioinformatics. 20 (9), 1466-1467 (2004).
  39. Elias, J. E., Gygi, S. P. Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry. Nat. Methods. 4 (3), 207-214 (2007).
  40. Käll, L., Storey, J. D., Noble, W. S. QVALITY: non-parametric estimation of q-values and posterior error probabilities. Bioinformatics. 25 (7), 964-966 (2009).
  41. Wollman, F. A., Bennoun, P. A new chlorophyll-protein complex related to photosystem I in Chlamydomonas reinhardtii. Biochim. Biophys. Acta. 680, 352-360 (1982).
  42. Bailey, S., et al. A critical role for the Var2 FtsH homologue of Arabidopsis thaliana in the photosystem II repair cycle in vivo. J. Biol. Chem. 277 (3), 2006-2011 (2002).
  43. Kato, Y., Sakamoto, W. Protein quality control in chloroplasts: a current model of D1 protein degradation in the photosystem II repair cycle. J. Biochem. 146 (4), 463-469 (2009).
  44. Meurer, J., Plücken, H., Kowallik, K. V., Westhoff, P. A nuclear-encoded protein of prokaryotic origin is essential for the stability of photosystem II in Arabidopsis thaliana. EMBO J. 17 (18), 5286-5297 (1998).
  45. Kuras, R., Wollman, F. A. The assembly of cytochrome b6/f complexes: an approach using genetic transformation of the green alga Chlamydomonas reinhardtii. EMBO J. 13 (5), 1019-1027 (1994).
  46. de Vitry, C., Finazzi, G., Baymann, F., Kallas, T. Analysis of the nucleus-encoded and chloroplast-targeted rieske protein by classic and site-directed mutagenesis of Chlamydomonas. Plant Cell. 11 (10), 2031-2044 (1999).
  47. Hamel, P., Olive, J., Pierre, Y., Wollman, F. A., de Vitry, C. A new subunit of cytochrome b6f complex undergoes reversible phosphorylation upon state transition. J. Biol. Chem. 275 (22), 17072-17079 (2000).
  48. Stanislas, T., et al. Quantitative proteomics reveals a dynamic association of proteins to detergent-resistant membranes upon elicitor signaling in tobacco. Mol. Cell. Proteomics. 8 (9), 2186-2198 (2009).
  49. Atteia, A., et al. A proteomic survey of Chlamydomonas reinhardtii mitochondria sheds new light on the metabolic plasticity of the organelle and on the nature of the alpha-proteobacterial mitochondrial ancestor. Mol. Biol. Evol. 26 (7), 1533-1548 (2009).
  50. Pagliano, C., Barera, S., Chimirri, F., Saracco, G., Barber, J. Comparison of the α and β isomeric forms of the detergent n-dodecyl-D-maltoside for solubilizing photosynthetic complexes from pea thylakoid membranes. Biochim. Biophys. Acta. 1817 (8), 1506-1515 (2012).
  51. Wisniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nat. Methods. 6 (5), 3-7 (2009).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

oklu Protein Kompleks AnaliziSakroz Yo unluk GradyanTilakoid Membran zolasyonuSDS PAGEmm nodeteksiyonD ng sel Elektron AkChlamydomonas reinhardtiiProtein Migrasyon Davran

İlgili makaleler