Method Article

Multiprotein kompleksleri Karşılaştırmalı Analizi için Yeni Bir Yaklaşım dayanarak 15 N Metabolik Etiketleme ve Kantitatif Kütle Spektrometre

DOI:

10.3791/51103

⸱

March 13th, 2014

 ,  ,  , 
1Institute of Plant Biology and Biotechnology, University of Münster, 2Department of Plant Biology, Carnegie Institution for Science

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tarif edilen karşılaştırmalı nicel proteomik yaklaşım, farklı koşullar altında multiprotein komplekslerinin bileşimi içine bir bakış açısı elde etmeyi amaçlamaktadır ve genetik olarak farklı suşların karşılaştırılması ile gösterilmiştir. Kantitatif analiz için bir sükroz yoğunluk gradyanı farklı fraksiyonların eşit hacimleri kütle spektrometresi ile analiz edilir ve karıştırılır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Katılan protokolü, farklı koşullar altında kompleks bileşim içine bir bakış açısı ortaya çıkararak, thylakoid zarında multiprotein kompleksleri analizi için bir araç sağlar. Bu protokolde yaklaşım, genetik olarak farklı cinslerinden izole edilmiş Chlamydomonas reinhardtii içinde siklik elektron akışı (CEF), karmaşık sorumlu proteinin bileşimin karşılaştırılması ile gösterilmiştir. Prosedür, ayırıcı metabolik etiketleme (14 N / N 15) göre sükroz yoğunluk gradyanı ile santrifüjleme, SDS-PAGE, İmmuno ve karşılaştırma, kantitatif kütle spektrometrisi (MS) ile multiprotein kompleksler onların ayrılması takip thylakoid membran izolasyonunu içerir, analiz suşları. Deterjan çözünmüş thylakoid zarlar eşit klorofil konsantrasyonunda sakaroz yoğunluk dereceleri üzerine yüklenir. Ultrasantrifüje edildikten sonra, kütle-gradyanlar spectromet ile analiz edilir fraksiyonlar, ayrılırry eşit hacmine göre. Bu yaklaşım ayrıca degrade kesirleri içinde kompozisyonun soruşturma ve özellikle ANR1, CAS ve PGRL1 odaklanarak, farklı proteinlerin göç davranışlarını analiz etmeyi sağlar. Ayrıca, bu yöntem, (daha önceki çalışmalardan elde edilen daha önceden PGRL1, FNR'nin olarak CEF-supercomplex parçası olmak için tarif edilmiş proteinlerin tanımlanması ve PSI-bağımlı geçiş bulguları destekleyen ve immüno-lekeleme ile birlikte ve ayrıca sonuçları teyit ile gösterilmiştir cyt f). Özellikle, bu yaklaşım bu protokol kabul edilebilir ve örneğin, farklı çevre koşullarına izole multiprotein karmaşık bileşim karşılaştırmalı analiz için kullandığı için soru geniş bir adres için geçerlidir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bitki ve alglerin thylakoid zarlarında fotosentez süreçleri doğrusal ve döngüsel modda çalışabilir. Doğrusal elektron akışı (LEF) fotosistem I (PSI), fotosistem II (PSII) ve sitokrom b 6 / f sırasında sonuç olarak NADPH ve ATP 2'nin üretimi yol açan, su, NADP + 1 için elektron transfer. Buna karşılık, durum 2 3 ve anaerobik koşullar 4, geri elektron nakil zincirine elektron enjekte yükseltgenmiştir PSI yeniden azalma sonuçları gibi çeşitli çevresel koşullar altında neden olduğu bilinen bir siklik elektron akışı (CEF). Bu süreç sitokrom b 6 / f kompleks 1 stromal tarafın....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1.. Chlamydomonas ekimi

  1. Aşağıdaki C. reinhardtii suşları bu çalışmada kullanılmıştır: WT cc124, WT cw15-arg7 (hücre duvarı eksik ve arginin auxotroph), bir ΔPSI mutant suşu 29 ve pgrl1 knock-out suşu 4.
  2. Tüm suşlar, sürekli ışık 20-50 yoğunluğundaki μE / m 2 sn ve 120 rpm'de sallama ile Tris-Asetat-Fosfat (TAP)-30 ortamı, 25 ° C'de yetiştirildi. ΔPSI kültürü <5 μE / m 2 sn ışığa maruz kalma için bir kağıt mendil ile sarılmalıdır.
  3. Nonlabeled suşları (sırasıyla, WT-cw15 arg7 ve pgrl1) için kültürler 7,5 mM, 14 N <....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Katılan nicel proteomik yaklaşım, genetik olarak farklı C. CEF-supercomplex bileşenlerin karşılaştırmalı analizi ile gösterilmiştir thylakoid zarlarında multiprotein komplekslerinin kompozisyonu karakterize amaçlar suşları reinhardtii. Tarif edilen yöntem, başarılı bir şekilde Terashima et al. 6 uygulanan ve deterjan çözündürülmesi, ardından anaerobik yetiştirilen kültürlerden thylakoid membran izolasyonunu içerir edilmiştir. Daha sonra, numuneler eşit klorofil miktarına göre bir sü.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kararlı izotop etiketleme kullanarak farklı kantitatif proteomik çalışmalar son yıllarda yayınlanmıştır. Bu deneylerde, genellikle iki farklı numune bir numune istikrarlı bir izotop ile etiketli olan, karşılaştırılmıştır. Bundan sonra her iki numune ikinci proteinler veya peptitler eşit oranda bir araya getirilmekte ve daha birlikte 48 işlenir. Bu tür çalışmalar genellikle araştırmak için farklı stres koşullarına 26,34,49 maruz tanımlanan izole edilmiş hücre bölmeleri (örn. kloroplastlar, .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar herhangi bir mali çıkarı beyan.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MH "Deutsche Forschungsgemeinschaft" (DFG) destek kabul eder. Yazar katkıları: MH tasarlanmış araştırma; KT, JS ve MT araştırma yapıldı ve verileri analiz KT ve MH kağıt yazdı.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Kimyasallar< / güçlü >
Asetik asitAppliChemA0662http://www.applichem.com/home/
AsetonAppliChemA2300http://www.applichem.com/home/
Asetonitril Optigrade fü r LC-MSDiagonal9340Zararlı, eldivenlerle çalışın. Daha fazla önlem için protokol metnine bakın.

https://www.diagonal.de/

Amonyum klorür 15NCambridge İzotop Laboratuvarları39466-62-1http://www.isotope.com/cil/index.cfm
Amonyum klorür 14NAppliChemA0988http://www.applichem.com/home/
Amonyum hidrojen fosfat AppliChemA3583http://www.applichem.com/home/
Amonyum sülfat AppliChemA3598 http://www.applichem.com/home/
Coomassie parlak mavi R-250Fisher Scientific10041653http://www.de.fishersci.com/index.php/deindex
n-Dodesil-β-D-maltosideAppliChemA0819http://www.applichem.com/home/
EDTAAppliChemA2937http://www.applichem.com/home/
Formik asit   AppliChemA3858http://www.applichem.com/home/
HEPESAppliChemA3724http://www.applichem.com/home/
Magnezyum klorürAppliChemA4425http://www.applichem.com/home/
MetanolAppliChemA2954
http://www.applichem.com/home/ Fosfor asidiAppliChemA0989http://www.applichem.com/home/
Dipotasyum hidrojen fosfat AppliChemA1042http://www.applichem.com/home/
Potasyum dihidrojen fosfat AppliChemA1043http://www.applichem.com/home/
Sodyum hidroksitAppliChemA1551http://www.applichem.com/home/
SükrozAppliChemA1125http://www.applichem.com/home/
TrisinAppliChemA3954http://www.applichem.com/home/
TrisAppliChemA2264http://www.applichem.com/home/
Tripsin (sıralama derecesi değiştirilmiş) ve Tripsin tamponuPromegaV5111http://www.promega.de/
Ekipman< / güçlü>
Nebulizatör (BioNeb hücre bozucu)Glas-Colhttp://www.glascol.com/product/subproduct/id/75
Santrifüj tüpleri (14 mm x 89 mm) Beckman Coulter,Takahashi tarzı gradyanların hazırlanması için 331372

http://www.beckmancoulter.de/

>Santrifüj tüpleri 25 mm x 89 mm
Beckman Coulter,tilakoid izolasyon gradyanlarının hazırlanması için 344058.

http://www.beckmancoulter.de/

Coulter Avanti Santrifüj J-20 XPBeckman Coulterhttp://www.beckmancoulter.de/
Fuchs-Rosenthal hücre yıkama odasıDiagonal449/72https://www.diagonal.de/
Homojenizatör (Potter) 50 ml Homojenizatör için Fisherbrand10618242http://www.de.fishersci.com/index.php/defisherbrand
PistilFisherbrand105252220http://www.de.fishersci.com/index.php/defisherbrand
Ultrasantrifüj (Optima XPN-80 Ultrasantrifüj)Beckman Coulterweb sitesi: http://www.beckmancoulter.de/
Diğer
Antikorlar Agriserahttp://www.agrisera.com/en/index.html

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Joliot, P., Joliot, A. Cyclic electron flow in C3 plants. Biochim. Biophys. Acta. 1757 (5-6), 362-368 (2006).
  2. Shikanai, T. Cyclic electron transport around photosystem I: genetic approaches. Annu. Rev. Plant Biol. 58, 199-217 (2007).
  3. Finazzi, G., Furia, A., ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Multiprotein Complex AnalysisSucrose Density GradientQuantitative Mass SpectrometryThylakoid Membrane IsolationMetabolic LabelingSDS PAGEImmunodetectionCyclic Electron FlowChlamydomonas ReinhardtiiProtein Migration Behavior

Related Articles