Sitotoksik Aktiviteyi Ölçmek için Hücre Bazlı Akış Sitometrisi Testi

Özet

Bu protokol, hassas, hücre bazlı bir sitotoksisite testini tanımlar. Artan sayıda efektör CD8 + T hücresinin varlığında canlı hedef CD4 + T hücrelerinin frekansındaki azalmayı numaralandırarak, bu test antijene özgü CD8 + T hücrelerinin sitolitik aktivitesinin doğrudan değerlendirilmesine izin verir.

Özet

CD8+ T hücrelerinin sitolitik aktivitesi nadiren değerlendirilir. Burada, antijene özgü CD8 + T hücrelerinin, aynı kökenli peptitleri ile yüklü CD4 + T hücrelerini öldürme kapasitesini ölçmek için yeni bir hücre bazlı testi açıklıyoruz. Hedef CD4 + T hücreleri, iki farklı CFSE konsantrasyonu ile etiketlenmiş iki popülasyona ayrılır. Bir popülasyon, ilgilenilen peptit ile nabız atarken (CFSE-düşük), diğeri nabızsız kalır (CFSE-yüksek). Darbeli ve darbesiz CD4 + T hücreleri eşit oranda karıştırılır ve artan sayıda saflaştırılmış CD8 + T hücresi ile inkübe edilir. Otolog hedef CD4+ T hücrelerinin spesifik öldürülmesi, peptit/MHCI tetramer boyaması ile tespit edilen antijene özgü efektör CD8+ T hücrelerini içeren CD8+ T hücreleri ile kokültür sonrası akış sitometrisi ile analiz edilir. Farklı efektör ve hedef oranlarında ölçülen hedef CD4 + T hücrelerinin spesifik lizisi, litik birimlerin, LU₃₀/10⁶ hücrelerinin hesaplanmasına izin verir. Bu basit ve anlaşılır tahlil, CD8 + T hücrelerinin hedef CD4 + T hücrelerini öldürmek için içsel kapasitesinin doğru bir şekilde ölçülmesini sağlar.

Giriş

Sitolitik aktivite, CD8+ T hücrelerinin ana işlevidir, ancak bu amaç için kullanılan tahliller hantal olduğundan ve standardize edilmesi zor olduğundan hala nadiren ölçülür. Bu fonksiyonun doğru ölçümü, CD8 + T hücrelerinin efektör fonksiyonlarını karakterize ederken büyük önem taşır, çünkü etkili hücre aracılı sitotoksisitenin güvenilir bir öngörücüsü henüz tanımlanmamıştır^1,2. Burada, antijene özgü CD8+ T hücrelerinin hedef CD4+ T hücreleri üzerindeki sitotoksik aktivitesini ölçmek için yeni bir fonksiyonel test öneriyoruz. Altın standart olan krom salınım testine alternatifler sağlamak için çeşitli yaklaşımlar geliştirilmiştir. Burada, canlı hedef hücrelerin ölümünü ölçtüğü için tüm öldürme sürecini ortaya çıkaran hücre bazlı bir test sunuyoruz. Bu yöntem, farelerde in vivo ^4,5 ve insanlarda in vitro akış sitometrisi bazlı sitotoksik test protokollerinden türetilmiştir⁶. Bu protokolde, toplam CD8+ T hücre popülasyonunda bulunan antijene özgü CD8+ T hücreleri efektör hücre, otolog CD4+ T hücreleri ise hedef hücre olarak kullanılır. İlgilenilen efektör CD8 + T hücreleri, MHCI / peptit tetramerleri⁷ kullanılarak numaralandırılır. Hedef hücrelerin ölümü, peptit yüklü/yüksüz CD4+ T hücreleri arasındaki oran ile hesaplanır. Bu yöntemin tekrarlanabilir, duyarlı, spesifik olduğunu ve toplam CD8 + T hücre popülasyonu⁸ içindeki efektör hücre sayısına bağlı olmadığını daha önce göstermiştik. Kokültür tahlilinde hem efektör hem de hedef hücrelerin sayısını numaralandırarak, CD8 + T hücrelerinin hedef hücreleri öldürme içsel kapasitesi hesaplanabilir ve litik birimler⁹ olarak ifade edilebilir.

Protokol

1. Efektör CD8+ T Hücrelerinin Hazırlanması

1. Otolog kriyoprezervasyonlu PBMC'leri (50 x 10⁶ hücreli 2-3 şişe), kriyoviali sıvı nitrojenden 37 ° C'lik bir su banyosuna aktararak çözün.
2. Tüpü tam RPMI (4 mM L-glutamin ve 100 U / ml penisilin ve streptomisin,% 10 FBS ile desteklenmiş) ile 50 ml'ye kadar doldurarak hücreleri yıkayın. PBMC'leri sayın ve hücreleri tam RPM'de 5 x 10⁶ / ml konsantrasyonda yeniden askıya alın.
3. PBMC'lere spesifik peptit (5 μg/ml) ve IL-2 (10 ng/ml) ekleyin.
4. 96 derin kuyu plakasında kurulum kültürü; her oyuğa 1 ml hücre süspansiyonu tohumlayın.
5. 3 günlük kültürden sonra, hücre kültürü ortamının yarısını taze tam RPMI ile değiştirin.
6. 6 günlük kültürden sonra, tüm PBMC'leri çok kanallı pipet ile toplayın ve hücreleri steril rezervuarda transfer edin.
7. PBMC'leri 5 ml'lik yuvarlak tabanlı tüplerde önerilen ayırma tamponunda 10^{x 7 7} / ml'de sayın, yıkayın ve yeniden süspanse edin. 50 μl / ml hücrelerde insan CD8 + T hücresi zenginleştirme kokteyli ekleyin. Karıştırın ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. 150 μl/ml'de manyetik parçacıklar ekleyin ve 5 dakika inkübe edin.
8. Ayırma tamponunu ekleyerek hücre süspansiyonunu 7 ml'ye getirin. Tüpü mıknatısın içine yerleştirerek dokunulmamış CD8 + T hücresinin immünomanyetik izolasyonuna devam edin. 5 dakika sonra, tüp hala mıknatısın içindeyken, ilgilenilen hücreleri 15 ml'lik yeni bir konik tüpe dökün. Küçük bir alikot alın ve hücreleri CD3 ve CD8'e karşı antikorlarla 1X PBS-2% FBS'de 4 ° C'de 30 dakika boyunca boyayın. CD8 + T hücrelerinin saflığı daha sonra akış sitometrisi ile %95 veya daha yüksek bir saflıkta ölçülebilir.
9. CD8 + T hücrelerini tam RPMI ile 450 μl'de yeniden süspanse edin.
10. 5 vidalı kapaklı tüpe 225 μl tam RPMI ekleyin.
11. 225 μl CD8 + 'yı bir sonraki tüpe aktararak seri seyreltmeleri (1: 2 ila 1: 32 arası) hazırlayın (bkz. Şekil 1 üst panel).

2. Hedef CD4+ T Hücrelerinin Hazırlanması

1. Otolog kriyoprezervasyonlu PBMC'leri (50 x^{10 6} hücreli 1 şişe), kriyoviali sıvı nitrojenden 37 ° C'lik bir su banyosuna aktararak çözün.
2. Hücre süspansiyonunu 10 ml RPMI içeren 50 ml'lik konik bir tüpe aktarın.
3. Hücreleri yıkayın ve PBMC'leri 14 ml'lik yuvarlak tabanlı tüplerde ayırma tamponu ile 5 x 10⁷ / ml'de yeniden süspanse edin. 50 μl / ml hücrelerde insan CD4 + T hücresi zenginleştirme kokteyli ekleyin. Karıştırın ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. 100 μl/ml'de manyetik parçacıklar ekleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
4. Ayırma tamponu ekleyerek hücre süspansiyonunu 7 ml'ye getirin. Tüpü mıknatısın içine yerleştirerek CD4 + T hücrelerinin izolasyonuna devam edin. 5 dakika sonra, tüp hala mıknatısın içindeyken, istenen hücreleri 15 ml'lik yeni bir konik tüpe dökün. Küçük bir alikot alın ve hücreleri CD3 ve CD4'e karşı antikorlarla 1x PBS-2% FBS'de 4 ° C'de 30 dakika boyunca boyayın. CD4 + T hücrelerinin saflığı daha sonra akış sitometrisi ile %95 veya daha yüksek bir saflıkta ölçülebilir.
5. CD4 + T hücrelerini sayın, iki adet 15 ml'lik konik tüpe bölün ve ılık 1x PBS'de yıkayın.
6. Sıcak PBS'de 0,4 μM CFSE yüksekliğinde bir çalışma solüsyonu hazırlayın.
7. 10x CFSE yüksek çalışma çözeltisinin bir kısmını ılık PBS'de seyrelterek 0,04 μM CFSE düşük çalışma çözeltisi hazırlayın.
8. Hücreleri 20 x 10⁶ / ml PBS'de yeniden süspanse edin (CD4 + T hücrelerinin sayısı 10 x 10⁶ / ml'den azsa, 0.5 ml PBS'deki hücreleri yeniden süspanse edin) ve CD4 + T hücrelerinin yarısını bir eşit hacim ekleyerek boyayın 0.4 μM CFSE yüksek çalışma çözeltisi (nihai konsantrasyon 0.2 μM). Örneğin, 1 ml hücre için 1 ml CFSE çalışma çözeltisi ekleyin. CD4 + 'nın kalan yarısını, bir eşit hacimde 0.04 μM CFSE-düşük çalışma çözeltisi (nihai konsantrasyon 0.02 μM) ekleyerek boyayın. Hücreleri %5 CO₂ atmosferinde 37 ° C'de 15 dakika boyayın.
9. İnkübasyondan sonra, pelet hücreleri 5 dakika boyunca 1.500 rpm'de ve etiketleme reaksiyonunu söndürmek için 1 ml ılık tam RPMI'de yeniden süspanse edin.
10. CFSE-düşük CD4 + T hücrelerini, tam RPMI'de 5 μg / ml'lik bir nihai konsantrasyonda ilgilenilen peptidi ekleyerek darbeleyin ve 37 ° C'de% 5 CO₂ atmosferinde 45 dakika inkübe edin.
11. CFSE-yüksek ve CFSE-düşük CD4 + T hücrelerini tam RPMI'de yıkayın. Toplam iki yıkama için tekrarlayın. Tam RPMI'de her biri 2 x 10⁵ hücre / ml konsantrasyonda yeniden süspansiyon haline getirin.
12. İki hedef popülasyonu 1:1 oranında karıştırın (CFSE-Yüksek: CFSE-Düşük) (bkz. Şekil 1 alt paneli).

3. Kokültür

1. CD8 + T hücrelerinin her seyreltilmesinden, 100 μl'yi çift olarak yuvarlak tabanlı 96 oyuklu plakaya tohumlayın.
2. Karışık hedef CD4+ T hücrelerini (100 μl), 200 μl'lik bir son hacim için efektör hücrelerin her bir seyreltmesine ekleyin.
3. Bazal apoptozu ölçmek için, yalnızca hedef hücrelerle 3 kuyu tohumlayın.
4. Kokültürü 37 ° C'de% 5 CO₂ atmosferinde 6 saat inkübe edin.

4. Akış Sitometrisi Boyama ve Edinme

1. Hücreleri V tabanlı 96 oyuklu bir plakaya aktarın ve 37 ° C'de% 5 CO₂ atmosferinde 15 dakika boyunca PE konjuge pMHC tetramerleri ile boyayın.
2. 1x PBS-2% FBS'de yıkayın ve hücreleri Far Red LIVE/DEAD sabitlenebilir ölü hücre, αCD3-Alexa700, αCD8-Percp, αCD4-Brilliant Violet 650 ile 4 ° C'de 30 dakika boyunca ışıktan koruyarak boyayın.
3. Hücreleri 1x PBS-2% FBS ile bir kez yıkayın ve 1x PBS'de% 2 formaldehit ile 100 μl'de yeniden süspanse edin.
4. Akış sitometresinde hücreler edinin.

Sonuçlar

Şekil 1'deki şema deneyi özetlemektedir. Saflaştırılmış CD8+ T hücreleri (efektör hücreler) 450 µl komple RPMI içinde yeniden süspanse edildi ve 225 µl CD8+ T hücresinin 225 µl besiyeri içeren bir sonraki tüpe eklenmesiyle seri dilüsyonlar gerçekleştirildi (üst panel). Saflaştırılmış CD4+ T hücreleri (hedef hücreler) sayıldı, iki tüpe ayrıldı ve protokolde açıklandığı üzere iki farklı CFSE konsantrasyonu ile (yüksek ve düşük) boyandı. CFSE-low CD4+ T hücreleri ilgili peptit ile pulse edildi ve CFSE-high ...

Tartışma

Burada açıklanan tahlil, CD8+ T hücrelerinin temel işlevinin ölçülmesine izin verir: sitolitik aktivite. CD8+ T hücrelerinin efektör fonksiyonlarını karakterize ederken bu fonksiyonun doğru ölçümü büyük önem taşır, çünkü önceki çalışmalar bu fonksiyon ile antijene özgü CD8+ T hücrelerinin sitokin sekresyonu arasında uyumsuzluk bildirmiştir^10,11. Kısa kokültür inkübasyon süresi (6 saat) ve otolog hedef hücrelerin kullanımı nedeniyle, hedef hücrelerin spesifik olmayan öldürülme oranı düşüktür. Bu nedenle bu tahl...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
EasySep İnsan CD4 + T Hücre Zenginleştirme	Kiti Kök Hücre	19052
EasySep İnsan CD8 + T Hücre Zenginleştirme	Kiti Kök Hücre	19053
CellTrace CFSE Hücre Proliferasyon Kiti - Akış Sitometrisi için	Invitrogen	C34554
Uzak Kırmızı CANLI / ÖLÜ sabitlenebilir ölü hücre	Invitrogen	L10120
Alexa Fluor 700 Fare Anti-İnsan CD3	BD
Brilliant Violet 650 Anti-İnsan CD4 Antikor	Biyoefsanesi	317435
PerCP anti-insan CD8 Antikor	Biyoefsanesi	344707
RPMI 1640 Orta 1x	VWR	10-040-CV
Penisilin-Streptomisin 100x Çözelti	İnvitrojen	15070063
Fetal Sığır Serumu - Altın, Isı ile İnaktive PAA		A15-252
96 oyuklu plakalar; Tedavi; U alt; kapaklı	BD Falcon	353077
25 ml steril polistiren, ayrı ayrı sarılmış rezervuarlar	USA Scientific	2321-2230
96 oyuklu U-dipli, steril 2 ml derin kuyu plakaları	Thermo Scientific	275743
İnsan IL-2 (v126), araştırma sınıfı	Miltenyi Biotec	130-093-096
RoboSep Tampon, ayırma tamponu	Kök hücre	20104
15 ml Polipropilen Konik Boru	BD Falcon	352097
14 ml yuvarlak tabanlı tüp, polipropilen	BD Falcon	352059
The Big Easy EasySep Mıknatıslı	Kök hücre	18001
PBS 1x	VWR	21-040-CV
96 kuyulu; Kapaklı V alt plaka	Fisher	12-565-481
Formaldehit çözeltisi, ACS reaktifi, ağırlıkça %37 H2O	Sigma-Aldrich	252549-500ML
1.5 ml vidalı kapaklı mikrotüp, konik	Sarstedt	72.692.005

557943