Yüksek çözünürlüklü erime analizi (HRMA) ile bir araya PCR zebrafish genotip için hızlı ve etkili bir yöntem olarak gösterilmiştir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Yüksek çözünürlüklü Melt Analizi ile PCR kullanarak hızlı ve verimli Zebra Genotiplemesi
Bu makalede
Özet
Özet
Zebra balığı, geliştirme eğitimi hastalık modelleme ve uyuşturucu taraması gerçekleştirmek için güçlü bir omurgalı model sistem. En son genetik araçlar çeşitli mutasyonlar neden olan ve transgenik çizgiler üretmek için çeşitli stratejiler de dahil olmak üzere, getirilmiştir. Bununla birlikte, büyük ölçekli tarama zaman alıcı ve emek yoğun olan geleneksel genotipleme yöntemleri ile sınırlıdır. Burada yüksek çözünürlüklü erime analizi (HRMA) ile birlikte PCR ile Zebrafish genotipleri analiz etmek için bir tekniği açıklar. Bu yaklaşım, kirlenme eserler düşük riski, hızlı, hassas ve ucuzdur. HRMA ile PCR ile genotipleme yüksek verimli tarama protokolleri de dahil olmak üzere, embriyo veya yetişkin balıklar için kullanılabilir.
Giriş
Zebrafish (Br.rerio) yaygın gelişimi ve hastalığın modelleme çalışmaları için kullanılan bir omurgalı bir model sistem. Son zamanlarda çok sayıda transgenik ve mutasyon zebrabalıkları teknolojileri geliştirilmiştir. Genellikle Tol2 transpozon sistemi 1 göre hızlı transgenesis teknikleri, birden fazla DNA fragmanı düzeneği 2 için gelişmiş klonlama seçenekleri ile kombine edilmiştir. Çinko-Parmak nükleazlar (ZFNs) ve transkripsiyon aktivatörü gibi efektör nükleazlar (TALENS) zebra balığı 3,4 hem somatik hem de germlin hücrelerinde mahalleri hedeflemek üzere kullanılmıştır. Bu teknikler, etkili bir şekilde yüksek frekanslı mutas....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1.. DNA hazırlanması
- 50 mM KCI, 10 mM Tris-HCl pH 8.3,% 0.3 Tween 20,% 0.3 NP-40: DNA lizis tamponu hazırlayın. Kullanım 12 günde 1 mg / ml 'lik bir nihai konsantrasyona kadar proteinaz K ilave taze.
- Doku toplama:
- Yetişkin balık yüzgeç klibi için:
- Balık anestezisi: 0.004% MS-222 (tricaine) çözümü de balık yerleştirin. Solungaç hareketi yavaşlatır kadar bekleyin.
- 5-10 Kimwipes bir yığın balık koymak ve steril bir jilet ile kuyruk yüzgecinin, yaklaşık 2-3 mm, küçük bir parça kesti.
- Hızla geri kazanımı için temiz su ile etiketlenmiş bir tankta balık yer, özenle fin klip içerecek tankı ve ilgili tü....
- Yetişkin balık yüzgeç klibi için:
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Protokol (iş akış diyagramı Şekil 1 'de gösterilmiştir), birkaç gün boyunca tek bir gün boyunca gerçekleştirilen ya da kademeleri içinde ayrılabilir. DNA ekstraksiyon PCR amplikonların eriyik ve analiz takip eder. Amplikonun eriyik için sıcaklıklar büyüklüğü ve GC-içeriğine bağlıdır, ancak genellikle başlangıç ve 50 ˚ C ve 95 ° C ˚ uç sıcaklıkları (Şekil 2A ve 2B) uygundur. Eriyik gerçekleştirildiğinde, floresan erime eğrilerinin analizi, genellikle kullanan önces.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
HRMA ile birlikte PCR Zebra balığı genotiplendirebilmek güçlü bir teknolojidir. Bu yaklaşımın avantajı, hız, sağlamlık, ve hatta nokta mutasyonları tespit etmek için hassasiyet vardır. Tüm protokol, fin-klip için eritilerek eğri analizi, tek bir kişi tarafından daha az sekiz saat içinde gerçekleştirilebilir. Buna ek olarak, teknik, yüksek miktarda madde taraması için müsait olan, etidyum bromid kullanımını gerektirmeyen ve kirlenme sorunları en aza indirir ve her PCR analizi adımları için kapatılır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Teşekkürler
Biz tavsiye ve teknik yardım için Blaschke, Grunwald ve Wittwer laboratuarları üyelerine teşekkür ederim. Bu çalışma JLB için PCMC Vakfı, NIH R01 MH092256 ve DP2'deki MH100008 ve Dimes Vakfı araştırma bursu # 1-FY13-425, Mart, tarafından desteklenmektedir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 100 Reaksiyon LightScanner Master Karışımı | BioFire | HRLS-ASY-0002 | www.biofiredx.com |
| Sert Kabuklu PCR 96 kuyulu BLK/WHT Plakaları | Bio-Rad Laboratuvarları | HSP9665 | www.bio-rad.com |
| Microseal 'B' Yapışkan Contalar | Bio-Rad Laboratuvarları | MSB1001 | |
| www.bio-rad.com 96 kuyulu LightScanner Cihazı | BioFire | LSCN-ASY-0040 | www.biofiredx.com |
| Call-IT 2.0 ile LightScanner Yazılımı | BioFire | www.biofiredx.com | |
| Yüksek Çözünürlüklü Erime Analizi 2.0 | BioFire | www.biofiredx.com | |
| LightScanner Primer Tasarım Yazılımı | BioFire | www.biofiredx.com | |
| Vector NTI Yazılımı | Invitrogen | www.invitrogen.com | |
| Trikain | |||
| Paraformaldehit |
Kaynaklar
- Kawakami, K., Takeda, H., Kawakami, N., Kobayashi, M., Matsuda, N., Mishina, M. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Dev. Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
- Kwan, K. M., Fujimoto, E., et al.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
