Bir Modifiye Yağış Yöntemi İdrar eksozomlar yalıtmak için

Summary

Bu el yazması, modifiye edilmiş bir çökeltme tekniği kullanarak eksozomları insan idrarından izole etmek için bir protokolü açıklar.

Abstract

İdrar ve plazmada böbrek hastalıklarının erken teşhisini sağlayan biyobelirteçlerin tanımlanması birkaç yıldır aktif bir ilgi alanı olmuştur. Boyutları 40-100 nm arasında değişen idrar eksozom vezikülleri, normal koşullar altında tüm nefron segmentlerinden hücreler tarafından idrara salınır ve orijinli hücre tipini temsil eden protein, mRNA ve mikroRNA içerebilir. Böbrek fonksiyon bozukluğu veya yaralanma koşulları altında, eksozomlar, hastalık için biyobelirteç görevi görebilecek bu bileşenlerin değiştirilmiş oranlarını içerebilir. Şu anda üriner eksozomların izolasyonu için çeşitli yöntemler mevcuttur ve daha önce bu yaklaşımların her birinin deneysel bir karşılaştırmasını gerçekleştirdik, bunlardan üçü ultrasantrifüjlemeye dayalı, biri nanomembran ultrafiltrasyon yoğunlaştırıcısı kullanarak, biri ticari bir çökeltme reaktifi kullanarak ve biri laboratuvarımızda geliştirdiğimiz ExoQuick reaktifi kullanarak çökeltme tekniğinin bir modifikasyonunu kullanarak. Modifiye çökeltme yönteminin en yüksek eksozom parçacıkları, miRNA ve mRNA verimini ürettiğini bulduk ve bu yaklaşımı sonraki RNA profillemesi için eksozomların izolasyonu için uygun hale getirdik. Modifiye eksozom çökeltme yönteminin, eksozomların idrardan izolasyonu için hızlı, ölçeklenebilir ve etkili bir alternatif sunduğu sonucuna vardık. Bu raporda, insan idrarından eksozomları izole etmek için ExoQuick reaktifi kullanarak modifiye çökeltme tekniğimizi açıklıyoruz.

Introduction

İdrar eksozomlar miRNA'ların ¹ zenginleştirilmiş görünmektedir idrar drenaj sistemlerinin astar glomerüler Podositler, renal tübül hücreleri ve hücreler de dahil olmak üzere idrar alanı normal ve patolojik koşullar altında tüm hücre tipleri türetilen multiveziküler organları (MVB), 100 nm küçük bir iç veziküllerdir ^-2. Pek çok araştırmacı, sağlıklı bireylerin idrar aynı zamanda böbrek ve / veya sistematik hastalık ^3-5 olan izole eksozom belirgin proteinleri tespit ettik. Eksozomlar, ultra ^{santrifüjleme, 8-9} ya da ^10-11 çökeltme ile nanomembrane filtrenin birlikte, bu ya da sukroz ^6-7 olmaksızın iki aşamalı bir diferansiyel ultra-santrifüj gibi farklı yöntemler kullanılarak izole edilebilir. Biz son zamanlarda idrar eksozomlar izole ve miRNA ve protein biyomarkerları ¹¹ algılamak için, basit, hızlı, ölçeklenebilir ve etkili bir yöntem geliştirdik. Biyomarkerler farklı biyolojik sıvıların çeşitli tespit edilebilir olsa da, urine nispeten invazif olmayan bir şekilde büyük miktarlarda elde edilebilir, çünkü, böbrek ve idrar yolu hastalıkları olan hastalar için uygun bir seçimdir.

Idrar eksozomlar ^6-11 izole etmek birkaç yöntem olmasına rağmen, en yaygın kullanılan prosedür% 30 sukroz yastık ile diferansiyel Ultrasantrifügasyon bağlıdır. Bu yöntem etkili değildir ve bu yönteme izole elde edilen eksozom kalitesi yüksek olsa da, teknik kendisi uzman personel gerektirir ve zaman alıcı birçok adımları ultrasantrifügasyon, zorunlu kılmaktadır. Bu, süzme ve çökeltme gibi başka yöntemler, özel bir özelliği, çökeltme reaktifinin kullanan bir de dahil olmak üzere, eksozom izolasyonu için geliştirilmiştir (örneğin, ExoQuick-TC: Sistem Biosciences, Mountain View, CA). Bu reaktif kullanılarak yağış hızlı ve nispeten kolay olmasına rağmen, izole eksozomlann saflık Ultrasantrifügasyon meth kıyasla düşüktürod. Kısa bir süre önce laboratuarımızda ¹¹ geliştirilen ExoQuick-TC ile çökeltme yönteminin bir modifikasyonu dahil olmak üzere idrar eksozomlann izole edilmesi için altı yöntemi olarak karşılaştırılmıştır. Biz bu değiştirilmiş çöktürme yöntemi protein, miRNA ve mRNA'larının ve kendisi daha hızlı ve daha Ultrasantrifügasyon uygulamak kolay oldu prosedürün daha yüksek miktarlarda vermiştir bulundu. Burada, biz kademeli bir şekilde bizim modifiye yağış yöntemi deneysel protokol açıklar ve eksozom izolasyonu diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında bu tekniğin avantajları ve dezavantajları bir tartışma vardır. değiştirilmiş çöktürme yöntemi exosomal proteinleri ile ilişkili ve idrardan eksozom veriminin azalmasına yol açtığı bilinmektedir Tamm-Horsfall proteini ile uzaklaştırılarak elde edilmiş eksozom partiküllerinin ilk çökeltme, içerir. Biz, bu değişimler idrardan exosomal hazırlama verim ve saflıkta arttırdığı bulunmuştur.

Protocol

Not:. Modifiye çökeltme yöntemi kullanılarak idrar eksozomlann izole söz konusu olan adımlar, Şekil 1 'de gösterilmektedir, ilk adım santrifüj ile büyük ölü hücrelerin çıkarılması ve hücre artıkları içerir. Her bir sonraki aşamada toplanan kültür bakiyesinden elde edilen nihai pelet, protein, RNA ve DNA daha fazla ekstre için ayırma çözeltisi içinde eritilir eksozom tekabül eder.

İdrar 1. Koleksiyonu

1. Idrar toplama öncesinde, üreticinin talimatlarına uygun olarak bir proteaz inhibitörü kokteyli hazırlamak ve boş steril hazne Bu kokteyl 3.125 ilave edin. proteaz inhibitörü kokteyli içeren Tüp daha sonra idrar toplama gönüllülere dağıtılabilir.
   Not: proteaz inhibitörü ilave nedeni idrar numunesi içinde bulunan proteini bozulmasını en aza indirmektir. Biz özellikle bir proteaz inhibitörü kokteyl kullanılmasına rağmenSigma, diğer ticari olarak temin edilebilen proteaz inhibitörleri ikame edilebilir.
2. İlk boşluk idrar yaklaşık 10 ml toplayın. Toplandıktan hemen sonra depolama veya soğutma olmadan idrar işleyin. Modifiye yağış yöntemini kullanarak kopya üriner eksozomlar yalıtmak; üriner eksozom partiküllerinin ölçülmesi için ise çiftleri biri, DNA, toplam RNA ve protein ekstre içindir.
   NOT: 24 saat idrar numunesi 4 ° C'de saklayarak eksozom izolasyonu için toplanabilir.

Hücre Moloz ve Tamm-Horsfall Protein 2. Kaldırma (THP)

1. 15 ml santrifüj tüplerine idrar örnekleri aktarın. Santrifüj 37 ° C'de 10 dakika boyunca 17,000 x g'de idrar 10 mi hücreleri ve hücre kalıntısını (Şekil 1) ortadan kaldırmak için.
2. Bir pipet kullanarak, daha fazla işlem için yeni bir tüpe süpernatantı aktarın. Izolasyon çözeltisi 500 ul pelletini (250 mM sakaroz, 10 mM Trietilamininnihai konsantrasyon 200 mg / ml), 37 ° C 'de DL-ditiyotreitol (DTT ile 10 dakika inkübasyon ile takip anolamine, pH 7.6).
   Not: DTT verim azalmasına yol açan, eksozomlar yakalar THP, indirgeme eklenir. Süpernatant transferi sırasında rahatsız pelet bırakmak özen, ve yüzer pelet açık olduğunu doğrulayın.
3. Vortex pelet örnekleri pelet kadar her 2 dk tamamen çözülür. Ardından çözünmüş pelet izolasyon çözeltisi 500 ul ekleyin.
4. 37 ° C, 10 dakika için 17,000 x g'de izole pelet çözeltisi santrifüj ilave edildikten sonra. Pipetleyin süpernatant ve önceki toplanan süpernatant ile birleştirmek.
5. SDS-PAGE analizi için ayırma çözeltisi 50 ul pelletini.
   Not: PBS veya TBS pelletini yerine yalıtım çözeltisi kullanılabilir.

Exosome Peleti 3. İzolasyonu

1. Toplanan supern 11 mlatant, ExoQuick-TC ayıracı 3.3 ml ilave edilir ve en az 12 saat süre ile 4 ° C'de inkübe edin.
   Not: ExoQuick-TC reaktif süpernatant hacmine oranı arttırmak veya exosomal verim azaltmak için ayarlanabilir. Bu ilave reaktif az miktarlar eksozom küçük anomerin görülmektedir.
2. Inkübasyondan sonra, santrifüj 25 ° C'de 30 dakika boyunca 10,000 x g'de örnek / ExoQuick-TC karışımı.
3. SDS-PAGE analizi için temiz bir tüpe süpernatant aktarın.
4. eksozom pelet, DNA, RNA ve protein ekstraksiyonu ve CD9 ELISA ¹¹ kullanılarak eksozom partiküllerinin ölçümü için, -80 ° C'de saklanabilir.
   Not: eksozom pelet sınırlı dondurma ve eritme ile 1 yıl boyunca, -80 ° C'de saklanabilir.

4. Biyomarker Algılama ve Exosome Peleti Analizi

1. Alt baş analizler için, DNA / RNA / protein izolasyon kiti ve bir RNA izolasyon Ki ile eksozom topağından DNA, RNA ve protein özüüreticinin talimatlarına uygun olarak T. Örnek 2 ul 260 absorbans ve 280nm ölçerek Nanodrop spektrofotometre kullanılarak konsantrasyonlarını belirleyin.
2. Kantitatif gerçek zamanlı RT-PCR (qPCR), TaqMan microRNA deneyleri kullanılarak veya miRNA-spesifik primerler (bizim durumumuzda, biz insan miR-192- ve miR-1207-5p özel deneyleri kullanılır) gerçekleştirin.
3. SDS-PAGE analizi için, tek boyutlu elektroforez ile% 4-12 Bis-Tris jel ve ayrı protein numuneleri kullanmaktadır. Üreticinin talimatlarına uygun olarak, gümüş boya kitini kullanarak jeller görselleştirmek.
4. Üretici tarafından sağlanan talimatlara uygun olarak PVDF membranlar kullanılarak Western blot analizi. Western blot algılama tümör bir gen 101 protein veya TSG101 apoptoz bağlantılı gen-2 etkileşimli protein X veya Alix ve fare monoklonal antikor tavşan poliklonal antikor kullanın. Açık erişim NIH ImageJ yazılımı tarafından bantların yoğunluğu ölçmek (http://rsbweb.nih.gov/ij/) veyabenzer bir program.
5. Üreticinin talimatlarına göre bir CD9 ELISA kiti kullanılarak elde edilen idrar eksozom parçacıkların sayısını ölçmek.

Results

İdrar eksozomlar böbrek epitel hücrelerinden salgılanan protein MiRNA ve mRNA biyolojik işaretleri taşırlar. Bu eksozomlann izolasyon ve algılama gibi diyabetik nefropati gibi böbrek hastalıklarının erken teşhisi için yararlı bir tanısal araç sağlayabilir. Insan deneklerden alınan idrar örneklerinde eksozomlann izole edilmesi için bir kaç yöntem vardır. Biz daha önce idrar eksozom izolasyon altı yöntemleri karşılaştırıldığında ve protein, mRNA ve miRNA düzeyleri ¹¹ Elde incelenmiştir. Burada amacımız detaylı ...

Discussion

Idrardan eksozom çökelmesini içeren çok yöntem Tamm-Horsfall proteini (THP) tarafından oluşturulan polimerik ağ kaldırılmasını ele alınmamıştır. Bu protein, bu varsayımsal trans ilk düşük hızlı santrifüj içinde eksozomlar idrar, büyük miktarlarda mevcuttur. Modifiye yönteminde, sonuç eksozom çökeltme öncesinde DTT kullanılarak THP azaltmıştır. Şekil 2'de gösterildiği gibi, THP, daha yüksek bir miktar, proteine ​​çıkarılmasını gösteren, son yüzer tabakanın ve eksozom pelet içinde herhangi bir THP ile...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Corning 15 ml Santrifüj Tüpü	Corning (Sigma Aldrich)	CLS430791
Proteaz İnhibitörü Kokteyl	Sigma Aldrich	P8340
Santrifüj	Sorvall
DL-dithiothreitol	Sigma Aldrich	D9779	200 mg / ml
Novex NuPAGE SDS-PAGE sistemi (% 4-12 Bis-Tris Jel 1.0 mm, 10 kuyulu		SDS-PAGE analizi için	NP0321BOX
ECL Advance Western lekelenme tespit kiti	GE Sağlık Yaşam Bilimleri	RPN2135	Biyobelirteçlerin western blot tespiti için
Exoquick-TC Reaktif	Sistemi Biosciences (SBI)	EXOTC50A-1	Eksozom izolasyonu için
Eksozom CD9 ELISA Komple Kit	Sistemi Biosciences (SBI)	EXOEL-CD9-A-1	Eksozom miktar tayini için
DNA, RNA, Protein izolasyonu için	AllPrep DNA/RNA/Protein mini kiti	Qiagen	80004
Rneasy MinElute Temizleme kiti	Qiagen	74204
NanoDrop 2000 UV-Vis Spektrofotometre	Miktar Tayini İçin	Termo Bilimsel
ProteoSilver Şerit Leke Kiti	Sigma Aldrich	PROTSIL1-1KT	SDS-PAGE jellerini
boyamak içinXcell SureLock Mini-Cell Elektroforez Sistemi	Yaşam Teknolojileri		SDS-PAGE jellerini çalıştırmak için
TaqMan mikroRNA testleri	Yaşam Teknolojileri		RT-PCR testleri için
qBasePlus v1.5 yazılımı	Biogazelle NV		RT-PCR test verilerinin analizi için
Millipore'a		karşı tavşan poliklonal antikoru	Biyobelirteçlerin
batı lekesi tespiti içinBiyobelirteçlerin	western blot tespiti için	Abcam'a